一、用原位杂交试验检测猪腹泻病毒（论文文献综述）
刘建波[1]（2020）在《猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究》文中认为猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）主要引起幼龄仔猪腹泻、呕吐、脱水和死亡,死亡率高达100%,给养猪业带来重大经济损失。尽管目前已经有防控PEDV的疫苗,但是由于预防接种的盲目性,导致免疫失败的现象在很多猪场出现,仍有猪场发生PEDV引起的仔猪腹泻并导致经济损失。为克服接种疫苗的盲目性,有必要建立评价母源抗体水平的诊断方法。此外,建立快速诊断PEDV的试纸条可以第一时间内确诊仔猪腹泻是否由PEDV引起,以便对猪群进行紧急接种以达到控制PEDV流行的效果。在确诊PEDV感染的情况下,猪群由紧急接种到产生抗体至少需要7天时间,有必要研制治疗PEDV的抗体类药物,对已发病猪群进行治疗来降低经济损失。分泌性IgA（Secretory IgA,SIgA）抗体为黏膜免疫系统中重要的效应分子,为检测PEDV特异性SIgA抗体,本研究以纯化的PEDV粒子为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子为检测样品,以辣根过氧化物酶标记的鼠抗猪SIgA分泌成分（Secretory component,SC）的抗体为酶标二抗,建立了检测初乳和肠道黏膜中的PEDV SIgA间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、重复性和敏感性实验。该方法与TGEV、PoRV阳性初乳无交叉反应,经间接免疫荧光（IFA）标定,当初乳中抗体效价在1:200到1:6400之间时,该ELISA的敏感性较好;批内和批间实验表明重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIgA水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,为选择合适的预防接种时间提供了技术支持。为快速确诊仔猪腹泻是由PEDV引起的,以纯化的抗PEDVN蛋白的15B12单抗和兔IgG抗体用含有铕（Eu）元素的荧光纳米微球进行标记,将其用喷金仪喷于结合垫上;以抗PEDVN蛋白的4H7单抗作为捕获抗体用喷膜机喷涂在硝酸纤维膜（NC）上形成检测线T;将羊抗兔IgG抗体用喷膜机喷涂在NC形成质控线C线,组成检测PEDV的荧光快速检测试纸条。用荧光检测仪分别采集T线处荧光峰值（HT）和C线的荧光峰值（HC）,并计算HT/HC的比值,根据比值确定检测结果。当检测值大于0.05时,表明该样品含有PEDVN蛋白或PEDV。用该试纸条检测TGEV、PoRV等其它病毒时均呈阴性反应,敏感性试验结果表明,该PEDV荧光检测试纸条的灵敏度要高于RT-PCR的灵敏度。研制的试纸条为快速确诊PEDV提供了技术手段。为筛选具备中和PEDV的单克隆抗体,以纯化的PEDV流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原,免疫BALB/c小鼠,经融合后筛选获得1株稳定分泌抗PEDV的杂交瘤细胞株,命名为1B9。病毒中和实验表明,该单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株,使其失去感染细胞的能力,但不能中和CV777毒株（G1基因亚型）。为阐明1B9单抗中和病毒的分子机制,本研究用抗PEDV多克隆抗体（pAb）和1B9单抗筛选PEDV LNCT2的突变毒株。经过连续30代次中和试验,成功筛选到1B9单抗的逃逸毒株,命名为Mutant-1B9,但该逃逸毒株仍然被PEDV的pAb中和。序列分析发现,在突变毒株的s基因中缺失了两个区域:55IGENQ59和609F,使得Mutant-1B9能够逃避1B9单抗的中和作用。上述结果表明,缺失的氨基酸参与了构象表位的形成,为构象表位的定位提供了有价值的信息。推测中和抗体通过结合上述位置影响病毒与受体的结合而发挥中和作用。此外,没有筛选出PEDV多抗的逃逸毒株。这表明pAbs或基于多个单克隆抗体的联合疗法在控制PEDV感染方面的具有潜在效用。综上所述,本研究建立了检测PEDV特异性SIgA的ELISA方法;建立了检测PEDV抗原的荧光快速检测试纸条;筛选到一株具备中和PEDV的中和性单克隆抗体,该抗体识别的表位为构象表位,其中55IGENQ59和609F位为抗体结合的关键氨基酸位点,中和抗体通过结合这些位置后影响病毒与受体的结合而发挥中和作用。上述研究结果为防控PEDV提供了重要的技术手段和理论支持,具有广阔的应用前景及研究意义。
郭倩妤[2]（2020）在《猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用》文中研究表明猪消化道类病毒性疫病是近年来生猪养殖生产实践中最为普遍和突出的疾病,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。许多国内外的研究表明:猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastro enteritis virus,TGEV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）、猪轮状病毒A型（Porcine rotavirus groupA,PoRVA）和猪轮状病毒C型（Porcine rotavirus group C,PoRV C）是临床上引起猪消化道腹泻的主要病毒性病原,且常呈现出混合感染或继发感染,导致猪群的高发病率和高死亡率,加大了诊断和防治的难度。为了实现临床对猪消化道主要病毒性疫病多种病原体混合感染的快速确诊,本研究建立了针对上述病原体的五重RT-PCR检测方法并进行了初步应用,为猪消化道病毒性疫病病原的快速诊断和防控提供了有效的技术手段和理论参考依据。主要研究内容如下:1.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一RT-PCR检测方法的建立及检测参照Gen Bank上PEDVN（KT323979）、TGEVN（EU074218）、PDCoVN（MH715491）、PoRVAVP6（MH320796）、PoRV CVP6（KJ814472）等基因的部分序列片段,采用Primer Select等相关软件和平台,分别设计了5对用于扩增PEDVN、TGEVN、PDCoVN、PoRVAVP6和PoRV CVP6基因的部分片段的引物,大小分别为799 bp、375 bp、271 bp、525 bp和184 bp。将实验室检测呈PEDV、TGEV、PoRVA阳性的粪便样品及肠道组织等病料提取核酸和生物公司合成的含PDCoVN基因和PoRV C基因的部分片段的阳性质粒,分别以阳性病料的核酸和合成的质粒作为模板,通过对5种病毒单一RT-PCR扩增产物的鉴定,结果扩增出与预期相符的条带。将PEDV、TGEV、PoRVA的RT-PCR产物进行胶回收,并将胶回收后的产物与p MD-19T载体进行连接并转化入感受态细胞,通过对阳性克隆菌的筛选后提取相应的重组质粒,并以其中的5种重组质粒作为反应模板优化对单一病毒的PCR反应退火温度,并对敏感性进行检测,建立了能够用于PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒快速诊断的单一RT-PCR检测方法。结果显示:（1）最佳反应体系:5对引物浓度均为10μmo L/L,TGEV、PDCoV和PoRV C上下游引物各1μL,PEDV和PoRVA上下游引物1.5μL,模板各2μL,金牌Mi X（Green）补足25μL。（2）最佳反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;在51.0～60.5℃之间的退火温度条件下,PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C单一病毒RT-PCR均可扩增出特异的条带,但55.1℃45 s退火温度最佳;72℃45 s延伸,35个循环;72℃延伸10 min。（3）敏感性结果表明,上述5种病毒模板的最低核酸检测量分别为:PEDV 0.39 pg、TGEV 0.34 pg、PDCoV 0.35pg、PoRVA 0.37 pg和PoRV C 0.34 pg。2.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的建立在上述建立的PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的五种病毒单一RT-PCR基础上,对PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR反应的体系进行调整,通过不断摸索模板和引物的用量、浓度以及退火温度的优化,并对五重RT-PCR的特异性、敏感性及重复性进行探索,建立了一种能够同时快速的鉴别PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五种常见猪消化道类病毒性疫病的五重RT-PCR检测方法。结果表明:（1）50μL体积是RT-PCR的最佳反应总体系。两步法的PCR体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,金牌Mi X（Green）补足50μL;一步法反应体系为:上下游引物浓度均为10μmol/L,引物量TGEV、PDCoV、PoRV C各0.75μL,PEDV、PoRVA各1μL,模板量TGEV、PDCoV、PoRV C各1μL,PEDV、PoRVA各1.5μL,2×1 Step Buffer 25μL,Prime Script One Step Enzyme Mix 2μL,RNase free water 8.5μL。（2）反应条件为:94℃5 min（预变性）;94℃45 s（变性）;55.1℃45 s（退火）;72℃45s（延伸）,35个循环;72℃10min（延伸）是最佳反应条件。（3）特异性、敏感性和重复性试验结果表明:五重RT-PCR能扩增出PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C的特异性片段,分别为799 bp、525 bp、271 bp、375 bp和184 bp,未扩增出CSFV、JEV、PCV2、PRV及正常细胞组织的DNA/RNA;五重RT-PCR中各种病毒的最低核酸检测量分别为:PEDV 39 pg、TGEV34 pg、PDCoV35 pg、PoRVA37pg、PoRVC 34 pg。3.PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRV C五重RT-PCR检测方法的初步应用应用所建立的猪主要消化道病毒五重RT-PCR检测方法对2017～2020年间采集自贵州省内不同地区、不同规模化养猪场、农户散养等的临床病料共计523份进行了相关的检测。通过对病料进行检测,比较多重RT-PCR与单一RT-PCR的检测情况,结果表明:来自贵州省不同猪场的523份样品中,阳性率分别为PEDV 26.96%（141/523）、PoRVA13.96%（73/523）、TGEV 1.72%（9/523）、PDCoV 1.53%（8/523）,未检测到PoRV C感染。PEDV+TGEV的二重感染阳性率为1.72%（9/523）,PEDV+PDCoV的二重感染阳性率为1.53%（8/523）,PEDV+PoRVA的二重感染阳性率为1.91%（10/523）,未检测到三重及以上的感染现象,五重RT-PCR检测结果与单一RT-PCR方法的检测结果一致。
胡斌[3]（2020）在《猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立》文中认为近年来,随着养猪业的发展,与之伴随的疾病也越来越复杂。猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）和猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）在临床养殖过程中常出现混合感染,且PCV2感染后会使猪产生免疫抑制,容易激发或并发其他传染病原,副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）是一种典型的“机会主义”病原,常作为继发病原伴随PCV2导致混合感染。准确而快速的诊断这几种病原,从而提供针对性的治疗,对养猪业的健康发展意义重大。荧光定量PCR检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、能定量等优点,广泛应用于病原诊断。本研究拟建立一种三重实时定量PCR检测方法,并结合熔解曲线分析,实现对PPV、PCV2和Hps单独或混合感染的快速诊断。为此,做了以下研究:（一）分别建立了PPV,PCV2,Hps的荧光定量PCR检测方法。根据PPV的VP2基因、PCV2的cap基因和Hps的infB基因保守区域设计特异性引物,并将扩增片段克隆载体后构建质粒标准品。以不同稀释度的标准品为模板进行SYBR GreenΙ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了三种荧光定量PCR检测方法。该方法对三种病原的检测灵敏性分别是146拷贝/μL、121个拷贝/μL和72个拷贝/μL,三对引物均不与其他常见病原存在交叉反应,重复性和特异性较好,可用于临床组织病料检测。（二）建立了可同时检测PPV和PCV2的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与PCV2特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PPV与PCV2双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。该方法的灵敏性可达167拷贝/μL和140拷贝/μL,引物与其他病原无交叉反应,特异性和重复性较好,临床组织病料检测结果与普通PCR一致,证明该方法可为快速鉴别诊断这两种病毒的混合感染提供技术支持。（三）建立了可同时检测PPV和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PPV与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,通过调节引物浓度、退火温度等条件,建立PPV与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,证明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。（四）建立了可同时检测PCV2和Hps的双重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2与Hps特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立了PCV2与Hps双重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法。通过对该方法的灵敏度、特异性、重复性和临床组织病料检测验证,结果表明该方法可用于这两种病原的快速鉴别诊断。（五）建立了可同时检测PPV、PCV2和Hps的三重荧光定量PCR检测方法。利用上述PCV2、PPV与Hps三对特异性引物及纯化后的重组质粒作为模板,调节引物浓度、退火温度等条件,建立PCV2、PPV与Hps三重SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法,可在同一条熔解曲线上产生了3个特异性的Tm峰值,且不与其他病原发生交叉反应,具有良好的重复性和特异性,为快速诊断这三种疾病提供技术支持,也为这三种疾病的免疫程序修订提供依据。
李明月[4]（2020）在《猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立》文中提出猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）作为猪传染性胃肠炎病原,是一种急性、高度接触性传染病,该病以呕吐、水样腹泻、脱水和对两周龄内死亡率较高（通常为100%）为特征。TGEV常在每年冬季和春季呈暴发流行,给养猪业造成较大的经济损失。为了获得临床分离毒株TGEV HQ2016全基因组序列,本研究利用Illumina二代测序法对TGEV HQ2016毒株进行全基因组测序,该毒株全序列长度为28 585 nt,全序列由5’端到3’端符合ORF（1a/1b）-S-3a-3b-sM-M-N-ORF7’的顺序。全序列分析显示TGEV HQ2016毒株核苷酸序列与AYU、HX、WH-1、PUR46-MAD、Purdue毒株同源性最高（100%）。全基因组进化树显示TGEV HQ2016毒株与Purdue普系毒株亲缘关系较近,与Miller谱系毒株的亲缘关系较远。重组性分析结果显示,TGEV HQ2016毒株中不存在重组区域。为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒的半巢式RT-PCR方法,本研究利用TGEV HQ2016与已发表于GenBank其TGEV毒株序列N基因等序列设计3条特异性引物,建立并优化反应体系。试验结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带。对TGEV具有良好特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;敏感性最低可检测到1.86×10-11 pg/μL的TGEV cDNA。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性良好,利用建立的半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品检测结果显示,阳性率为36%,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。本研究对TGEV HQ2016毒株基因组结构进行特性分析,并且建立半巢式RT-PCR检测方法,不仅为TGEV的遗传进化等基础性研究提供重要的理论基础,也为猪传染性胃肠炎的诊断、相关生物制品研制以及疾病防控具有重要参考价值。
高翔[5]（2020）在《猪德尔塔冠状病毒免疫应答的初步评价及感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析》文中提出猪德尔塔冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）是一种新型的猪肠道冠状病毒,可感染不同日龄猪,但新生仔猪更易感,感染后主要表现出严重腹泻、呕吐、脱水等临床症状。2012年,在中国香港首次报道了PDCoV。然而,PDCoV疫情的爆发却发生在2014年美国俄亥俄州。随后,在美国养猪州迅速蔓延和传播,造成新生仔猪3040%的死亡率。近年来,PDCoV已在多个国家猪场中流行,包括中国、加拿大、日本、韩国、泰国、墨西哥等国家。当前,由于尚不清楚PDCoV传播和致病机制,并且缺乏有效的疫苗和防控措施,给多个国家造成了巨大的经济损失,对养猪业仍然是一个严峻的挑战。基于此,本研究对PDCoV开展以下几方面的研究,以期为提高PDCoV快速诊断、阐明致病机制和疫苗的研发等奠定基础。1.PDCoV LFD-RPA快速检测方法的建立参照GenBank中已公布的PDCoV N基因保守序列（GenBank登入号:KJ481931）设计特异性引物和探针,建立重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条（Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,LFD-RPA）检测PDCoV的方法。结果表明,LFD-RPA检测方法具有较广的检测温度（1037℃）,当温度为37℃时可以在20 min内完成PDCoV检测。经验证,该方法最低检测限度为1×102 copies/μL,并且能特异性检测出PDCoV,具有良好的灵敏性和特异性。批间和批内重复性检测结果证实LFD-RPA具有良好的重复性。通过对68份猪腹泻样品（48份直肠拭子样品和20份肠道内容物样品）检测以评价LFD-RPA检测方法的有效性。结果显示,LFD-RPA和RT-PCR检测PDCoV阳性率分别为26.47%（18/68）和23.53%（16/68）,表明LFD-RPA检测方法有效、准确。2.PDCoV毒株的分离、鉴定及生物学特性研究应用猪肾上皮（LLC porcine kidney,LLC-PK）细胞成功从新疆维吾尔自治区采集的猪腹泻样品中分离出一株PDCoV细胞适应株CH/XJYN/2016（GenBank登入号:MN064712）。该毒株在LLC-PK细胞中盲传至P5代时开始出现典型的细胞病变（Cytopathic effect,CPE）。目前,CH/XJYN/2016毒株已稳定传代至P140代,病毒毒价可高达107.8.8 TCID50/mL。经免疫荧光检测出PDCoV抗原呈绿色荧光。应用透射电子显微镜观察到CH/XJYN/2016毒株病毒粒子呈椭圆形,具有典型的“皇冠”状纤突结构。采用RT-PCR扩增获得CH/XJYN/2016毒株的全基因组序列,全长为25 833 nt。序列分析表明,CH/XJYN/2016毒株与其它PDCoV分离株S基因核苷酸同源性为97.7098.74%,其中遗传距离最接近于中国香港株HKU15-44（GenBank登入号:JQ065042）,具有98.74%核苷酸同源性。与其它报道的PDCoV相比,在CH/XJYN/2016毒株S基因中观察到37个核苷酸替换和3个核苷酸插入。S基因系统进化树分析显示,CH/XJYN/2016毒株与从中国、美国、日本和韩国分离的PDCoV毒株亲缘关系较近,而与泰国、越南和老挝分离的PDCoV毒株亲缘关系较远,表明中国、美国、日本和韩国分离的PDCoV毒株可能都来源于共同的祖先。3.PDCoV对不同日龄仔猪的致病性分析及免疫应答的初步评价应用PDCoV CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物(104 TCID50/mL)口服接种4日龄哺乳仔猪,感染后12 d（days post-infection,dpi）仔猪出现腹泻、呕吐、精神沉郁等临床症状。感染仔猪解剖后发现肠道受损严重,尤其是小肠,出现肠系膜充血、肠壁变薄、充满黄色液体。组织病理学结果显示,小肠绒毛萎缩、融合和脱落。此外,免疫组化结果证实,PDCoV抗原主要存在于小肠绒毛肠细胞中。上述结果表明,CH/XJYN/2016毒株对哺乳仔猪具有较强的致病性。通过PDCoV CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物口服接种45日龄断奶仔猪,G1G4感染组(104101 TCID50/mL)在314 dpi内相继出现明显的腹泻和病毒脱落,感染组猪血清PDCoV特异性IgG、IgA和病毒中和（virus-neutralization,VN）抗体水平显着升高（P<0.05）。但在21 dpi时所有仔猪均恢复正常,并再次对仔猪口服接种CH/XJYN/2016毒株P6代病毒培养物。再次接种后14 dpi仔猪均无临床症状和病毒脱落,感染组猪血清和唾液中PDCoV特异性IgG、IgA和VN抗体水平却持续增高,并且二者表现出良好的相关性。值得注意的是,首次接种7 dpi时猪血清中IFN-γ抗体水平显着升高,而后却持续下降。测定出断奶仔猪PDCoV半数仔猪腹泻量(The median pig diarrhea dose,PDD50)为2.0 log10PDD50/3mL。此外,应用铝佐剂和206佐剂开发了一种基于CH/XJYN/2016毒株的灭活疫苗并接种免疫仔猪,发现与未接种疫苗的仔猪相比,仔猪接种灭活疫苗后产生了较强的体液免疫应答,攻毒后无临床症状和病毒脱落,表明该疫苗对PDCoV感染猪具有较强的保护作用。4.PDCoV感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析应用LC-MS/MS技术结合串联质谱标签（Tandem mass tag,TMT）,开展了PDCoV感染后18 h和未感染LLC-PK细胞蛋白质组学研究。共鉴定出275个差异表达蛋白（differentially expressed proteins,DEPs）,其中128个显着上调,147个显着下调。生物信息学分析表明,DEPs主要参与防御反应、细胞凋亡和免疫系统。在DEPs生物信息学分析的基础上,表明PDCoV感染可能利用宿主细胞凋亡途径来实现病毒最大化增殖。同时,宿主细胞可能利用JAK/STAT信号通路激活干扰素刺激因子（interferon-stimulated genes,ISGs）转录来抵抗病毒入侵。此外,应用平行反应监测（Parallel reaction monitoring,PRM）技术对候选蛋白进行定量验证。结果表明,PRM定量结果与TMT定量数据相符,进一步证实了蛋白质组学数据的有效性和准确性。
杨朋霞[6]（2020）在《抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究》文中指出猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒亚科（Coronavirinae）的α冠状病毒属（Alpha Coronavirus）猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一种急性、高度接触性的肠道传染病。这种病毒可致各阶段的猪均能发病,但危害最为严重的是对10日龄以内的仔猪,临床上常引起仔猪脱水、呕吐和水样腹泻等症状。1971年在英国首先报道该病,随后在多个国家暴发流行。由于经典疫苗毒株CV777灭活苗或弱毒苗的使用,PEDV取得了较好的防控。但是好景不长,2010年冬季有人发现就算免疫过经典疫苗株的养猪场照样能发生该病,原因是PEDV发生了变异,变异毒株引发的严重腹泻病迅速席卷全球,近年来,临床上缺乏针对现行PEDV变异株的有效疫苗,一时间养猪业损失惨重,而该病也成为了危害养猪业的最为严重的疫病。因此,PED的防控具有重要的意义,而检测是防控的主要手段,但目前临床上缺少针对当前流行的PEDV变异毒株检测方法。本研究在GenBank中参照已登录的PEDV N（AF353511）基因序列,经过对比近年来流行株,设计出了一对特异性引物,将扩增后的目的片段（N基因）克隆到pQE-30原核表达载体中,进行表达、纯化,以纯化的重组N蛋白（rN）作为包被抗原,异性和重复性试验。对500份来源于不同猪场临床血清样品进行检测,并将结果与进口商品化试剂盒通过矩阵法优化ELISA反应条件,建立了 PEDV间接ELISA检测方法,并进行敏感性、特比较。结果表明,本研究成功扩增了长度1221bpN基因,表达的rN约为50.4 ku,western blot结果表明该试验所建立的ELISA方法反应原性良好。rN最佳包被浓度为2 μg/mL;血清最佳稀释度为1:100,作用时间1 h;羊抗猪HRP-IgG最适稀释度为1:5000,作用时间为30 min;TMB最佳显色时间为10 min。本方法可特异性检测PEDV抗体,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TG EV等病原的阳性血清均无交叉反应;本方法检测出相同血清的最高稀释倍数与中和试验基本一致,具有良好敏感性;批内、批间重复性检验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。对500份临床猪血清的检测,与进口商品化试剂盒相比符合率为99.6%。本研究为PEDV血清学检测提供了技术手段,也为下一步单克隆抗体（单抗）的筛选奠定基础。本研究按照常规技术免疫小鼠,将小鼠血清倍比稀释用所建立的间接ELISA方法检测小鼠抗体效价,将检测效价大于1:80000的小鼠脾脏充分研磨后过铜网,在PEG1500的作用下与事先培养好的SP2/0细胞进行融合,后将融合细胞铺到96孔板中,逐日观察细胞情况,取每孔上清液用建立的间接ELISA方法进行筛选鉴定,同时进行单抗亚型鉴定,对阳性孔进行5次亚克隆后,筛选出2株亚型为IgG且能稳定分泌抗PEDV N蛋白单抗的杂交瘤细胞株（2D4、6C6）。将杂交瘤细胞扩大培养并注射入小鼠腹腔,收集腹水后对其进行纯化,同时进行SDS-PAGE、稳定性、特异性检测。结果显示:制备腹水纯化后,2株中仅有1株（6C6）,纯度高达95%以上,且其可以特异性地与 PEDV抗原反应,而与PRV、PRRSV、CSFV、PCV、TGEV、大肠杆菌等抗原均不发生交叉反应,特异性良好;经过连续几次传代后,其效价依然可达到1:102400,稳定性好。为进一步建立基于PEDV N蛋白抗体阻断ELISA及应用于临床的胶体金快速检测试纸条的方法奠定了基础。本研究用本实验室分离鉴定得到的病毒制备的灭活疫苗,进行免疫效力试验的研究。选取PEDV血清中和效价<1:4,且FQ-PCR检测为阴性的母猪所产的5日龄仔猪10头,分为2组,每组5头,免疫组口服病毒液（攻毒剂量1000TCID50/mL）,对照组口服相同剂量的DMEM,在攻毒后3d内观察仔猪发病情况。结果显示:试验组均符合腹泻发病要求,对照组均未发病。用制备的灭活疫苗在临床上分别于母猪分娩前45d、分娩前21d和再次配种前7d免疫灭活疫苗,对照组在相同的时间里注射相同剂量的DMEM。选取免疫组和对照组分娩的仔猪进行攻毒免疫保护实验的研究。结果显示:试验组母猪所产仔猪获得的保护率能达到90%,对照组仔猪100%发病,且致死率为30%。且在精神状态、增重率、病原学检测和剖检症状等各方面试验组均比对照组要好。说明本实验室的毒株制备成灭活疫苗免疫接种给母猪,它能给仔猪提供有效保护,可用于当前猪流行性腹泻变异毒株疫苗的研发。
祁光宇[7]（2019）在《猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究》文中认为这几年,PEDV G2群的变异毒株在我国猪群中发病并导致流行,很难将患轮状病毒猪、传染性胃肠炎的猪在临床症状上很难进行区分。准确的检测是防制猪流行性腹泻的重要环节,以免疫层析法技术为基础建立的猪流行性腹泻病毒金标试纸条是一种具有快速、灵敏、特异的PEDV检测方法,对基层现场诊断具有广泛应用价值。目前PEDV的疫苗主要是全病毒灭活苗和弱毒苗两种,这些疫苗或多或少的存在缺点。因此,研发安全、高效的新型PEDV疫苗对防控PED具有十分重要的意义。通过RT-PCR技术扩增HB2015分离毒株N基因,对扩增的N基因进行测序分析,分析结果表明:与2014年德国毒株（GER-L00721-2014）、CH/JXJA/2017、法国毒株KR011756-FR001-2014)、河北毒株（JF700126.1-HB-HS-2010）同源性为99.5%99.9%。HB2015分离毒株与CV777、CH/S毒株之间的同源性为95.5%95.6%,存在小幅度的变异。HB2015分离毒株与2014年德国毒株（GER-L00721-2014）、CH/JXJA/2017、法国毒株（KR011756-FR001-2014）、河北毒株（JF700126.1-HB-HS-2010）同属于一个进化分支,HB2015分离毒株属于PEDV G2群的变异毒株。通过pET-32a-N原核表达重组N蛋白,对获得的重组N蛋白进行鉴定后,免疫6周龄BALB/c小鼠制备单抗,对筛选出的单抗进行Western blotting鉴定、IFA分析和间接ELISA检验。试验结果表明:在大肠杆菌中成功表达的N蛋白具有较好抗原性。筛选出两株能稳定分泌抗PEDV-N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E7和5D3。间接ELISA均不与猪蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生交叉反应为,腹水效价分别为1:32000和1:64000。两株单抗具有较好的特异性、稳定性和较高的抗体效价。通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金,分别以单抗3E7和5D3制备免疫胶体金和检测线,再以羊抗鼠IgG作为质控线制备金标试纸条,对研制的金标试纸条进行特异性、敏感性和保存期试验。试验结果表明:免疫胶体金最佳单抗3E7标记量的范围在2030μg/mL。抗原标记的最佳pH值为8.0,NC膜上的检测线单抗5D3含量为0.9mg/mL,NC膜的质控线羊抗鼠IgG含量为1.0mg/mL。金标试纸条不与蓝耳病毒、猪传染性肠胃炎病毒、猪瘟病毒、口蹄疫O型抗原、口蹄疫A型抗原发生反应。最低能够检测到225个TCID50的病毒量,4℃可以保存180天。通过分析了国内、外PEDV 31株的S基因核苷酸和S蛋白氨基酸序列的同源性,对S1的390-789aa编码的基因进行优化后,与P28、CD40L、IgG1Fc融合表达。将在杆状病毒系统表达的目的蛋白S1、S1-P28、S1-CD40L、S1-IgG1Fc分别与纳米佐剂和206佐剂乳化后,进行小鼠和猪免疫试验评价。试验结果表明:纳米S1-CD40L组疫苗中和抗体最好切均高于国家制定的标准（1:16）,无佐剂组免疫后血清中的检测,S1-CD40L免疫组的IFN-γ和IL-4均高于其它组,说明CD40L可以明显的增加免疫应答。
俞丽[8]（2019）在《猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap蛋白的原核表达》文中研究表明猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是一种无囊膜结构的单股环状DNA病毒,于2016年被美国学者发现并报道。该病毒对猪的各个发育阶段都易感,尤其对仔猪有很强的感染力与致病力。自报道以来,它已在全球范围内出现。2017年,华中农业大学何启盖教授首次报到了国内PCV3感染病例及其临床症状,发现其和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）极为相似,以猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis and nephrotic syndrome,PDNS）为主要特征。目前市场上还没出现商品化的疫苗及诊断试剂盒,故建立一种快速准确的鉴别诊断方法对该病的防控至关重要。根据PCV2和PCV3的保守序列各设计了一对特异性引物,建立了检测PCV2和PCV3的双重PCR检测方法。通过优化反应条件和反应体系,确定最佳退火温度为56.0℃,最佳引物浓度为0.2μmol/L。本实验成功的建立了检测PCV2与PCV3的双重PCR方法,为猪圆环病毒的临床诊断提供了良好的方法,同时为诊断试剂盒的研发打下基础。利用PCR对PCV3的流行病学进行了调查研究,采集了2016～2018年期间中国不同地区（广东、广西、海南、江西、江苏、湖南、湖北、河南、山西、黑龙江）疑似PCV3发病的86个猪场猪的不同类型和阶段的1189份病料样品。检测结果显示:猪粪便、口鼻分泌物阳性率为46.19%（291/630）,血清阳性率为6.48%（16/247）,组织器官阳性率为27.24%（85/312）。通过采自3个PCV3阳性猪场不同阶段猪的粪便和口鼻分泌物检测结果显示:哺乳仔猪（1～20日龄）阳性率为59.17%（71/120）;保育猪（21～60日龄）阳性率为56.67%（51/90）;生长育肥猪阳性率为32.22%（29/90）;后备母猪阳性率为23.33%（21/90）;妊娠母猪阳性率为54.44%（49/90）;哺乳母猪阳性率为60%（54/90）;公猪阳性率为26.67%（16/60）。本研究中筛选并获得总共7株PCV3全基因序列,对其进行同源性分析发现:与韩国株和部分中国株之间的核苷酸相似性高达99.7%,但与PCV2基因的同源性差异较大。根据遗传进化树分析:与近几年发现和鉴定的PCV3中国株处于同一分支,其亲缘关系较接近。根据已测序的PCV3/GD/08/16毒株保守序列Cap基因设计一对特异性引物,同时在上下游引物分别加入Bam HI和HInd III酶切位点。通过测序成功的Cap基因连接到p MAL-c5x表达载体上,成功构建重组表达载体PCV3-Cap-p MAL并进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳确定重组融合蛋白的大小为约70 k D,主要以包涵体的形式存在。此外,用IPTG诱导浓度、温度和时间,确定最佳诱导浓度为0.5 m M,最佳诱导温度为37℃,最佳诱导时间为6 h。用上述确定的最佳诱导条件对重组蛋白进行Western blot印迹。结果表明,成功构建了PCV3-Cap-p MAL表达载体,为下一步ELISA方法的构建奠定了基础。
刘正奎[9]（2019）在《猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究》文中研究说明猪病毒性腹泻是一种接触性的肠道传染病,其临床症状为呕吐,腹泻和脱水等。其病原包括猪博卡病毒（Porcine Bocavirus,PBCo V）、诺如病毒（Norovirus,No V）、猪Delta冠状病毒（Porcine Delta Coronavirus,PDCo V）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Variant Diarrhea Virus,PEDV）、轮状病毒（Rotavirus,RV）和猪传染性肠胃炎病毒（Porcine Infectious Gastroenteritis Virus,TGEV）等六种病毒,该类病毒引起的临床症状、流行病学规律和病理变化非常相似,特别是猪性腹泻病毒,其变异毒株不断出现,防控技术要求更高,临床诊断时不易区分其病原体,因此建立一种同一反应、快速、灵敏的检测方法区分将有利于该类疾病的防控。本研究利用多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA）和荧光定量RT-PCR技术,分别建立区分6种病毒性腹泻病原体的MLPA检测方法和猪流行性腹泻变异毒株与疫苗毒株的荧光定量RT-PCR方法,为快速检测猪病毒性腹泻疾病的病原提供技术支持。1、检测6种猪病毒性腹泻疾病病原的MLPA技术研究MLPA是一种高通量、针对多种病原核酸中特异靶序列进行定性和定量分析的新技术。本研究利用MLPA技术,以PBCo V、No V、PDCo V、PEDV、RV、TGEV为研究对象,分别设计了针对6种病毒的MLPA探针,按照变性、退火、杂交、扩增、检测的程序,建立了同一反应、同时检测6种病毒的MLPA方法。结果表明:引物探针浓度为1.33 nmol/L时,每种病毒的探针针对其自身模板都只有单一的扩增峰,其大小与预测基本一致:PBCo V约102 bp、No V约110 bp、PDCo V约117 bp、PEDV约124 bp、RV约131 bp、TGEV约138 bp,探针具有良好的扩增效率,对其他病毒模板都没有特异的扩增峰;6种探针混合体系中针对每一种腹泻病原体只扩增出单一的扩增峰,在同一体系中同时获得6种病原的特异性峰,而针对猪场常见病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）、猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）、伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）和猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2,PCV2）均为无特异性扩增峰。6种猪病的MLPA方法的最低检测限分别为:RV（75拷贝/反应）、PEDV（7.53拷贝/反应）、TGEV（7.49拷贝/反应）、PDCo V（7.54拷贝/反应）、No V（7.56拷贝/反应）、PBCo V（75.8拷贝/反应）。依据建立的MLPA检测方法,针对52份临床样品进行检测,同时设置阴性和阳性对照,结果显示:PEDV阳性率47.06%[95%CI:19.9%-26.9%],RV阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],TGEV阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],PEDV、RV和TGEV混合感染阳性率为1.96%[95%CI:0-10.4%],其它病毒均未检出。本研究建立的6种病毒MLPA检测方法具有一次采样、一次分析、同时检测6种猪病毒性腹泻病的目的,该方法特异性强、灵敏度高、多重性检测等优势,有望成为未来动物疫病检测的新技术。2、一步法双重荧光定量RT-PCR检测PEDV变异毒株与疫苗毒株方法的建立本研究根据Gen Bank公布的猪流行性腹泻病毒（PEDV）8株典型的变异毒株（GⅡ型）和5株疫苗毒株（GⅠ型）的S基因序列设计一对引物和两条特异探针（变异毒株携带FAM荧光基团,疫苗毒株携带HEX荧光基团）,建立基于Taq Man探针的一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示:该方法在10-1-108拷贝数/μL范围内,检测GⅡ毒株（R2=0.9892）和GⅠ型毒株（R2=0.9914）具有较好的扩增效率,Ct值与浓度之间具有较好线性关系;检测灵敏度分别为GⅡ毒株7.388拷贝数/μL、GⅠ型毒株4.322拷贝数/μL;GⅠ型和GⅡ型之间没有交叉反应,且该方法与CSFV、TGEV、RV、PRV、JEV、PPV等病原体之间没有交叉反应,特异性好;组间和组内变异系数低,重复性好;对12份临床样品通过一步RT-PCR检测方法与普通行业标准方法进行阳性值对比得出的kappa值为0.75,对12份经病毒分离鉴定为阳性的样品进行检测,12份皆为PEDV变异毒株阳性,与PEDV病毒分离结果符合率为100%。本研究建立的基于Taq Man探针的一步法双重荧光定量RT-PCR检测方法具有灵敏、特异、高通量、准确定量和基因分型等优点,可用于临床PEDV变异毒株和疫苗毒株的快速鉴别诊断。本研究建立的检测多种猪病毒性腹泻病毒的MLPA方法,同时检测出6种猪病毒性腹泻病毒病原体,具有快速、敏感度高、特异性好和可重复性高的特点,为猪病毒性腹泻病毒病原体的监测与应急诊断提供高通量检测技术。本研究双重基于Taqman探针的一步双重实时荧光定量PCR方法和普通荧光定量RT-PCR方法相比,使得检测结果更加准确、灵敏度更高,有利于鉴定临床样品中PEDV的变异毒株和疫苗毒株的流行。本研究所建立的方法为针对猪场病毒性腹泻的临床诊断、防控方案制定奠定技术基础。
刘志鹏[10]（2018）在《同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用》文中指出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒A型（Group A rota virus,GAR）以及猪delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原,这四种仔猪腹泻病在临床表现非常相似,难以鉴别诊断。本研究针对PEDV、TGEV、GAR以及PDCoV四种腹泻病毒,将酶促反应显色技术、不对称PCR单链扩增技术和基因芯片技术相结合,构建一套PEDV-TGEV-G AR-PDCoV可视化酶促寡核苷酸共检基因芯片技术,进行了初步临床应用评价研究。研究结果结果显示,各目的基因的不对称PCR上下游引物最佳浓度比分别为:PEDV-S:1:20;PEDV-M:1:10;TGEV-S:1:20;TGEV-N:1:20;GAR-VP7:1:10;GAR-NSP4:1:10;PDCoV-M:1:10;PDCoV-N:1:20,此时目的片段的单链产物量最多。确定了芯片检测的操作程序为:在50℃环境中杂交90 min后,进行洗涤。与2000倍稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶酶联后用DAB显色液显色后进行结果判读。本研究根据阳性对照生成棕褐色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。该可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR以及P DCoV的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV及FMDV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;各探针基因的灵敏性均可达10p g/μl（2.83×106copies/μl）;芯片在保存180天后仍可进行有效检测。研究应用所构建的芯片对四川、重庆地区的200份临床送检样本进行了检测。本研究成功构建了一套能高通量检测四种仔猪腹泻疾病的酶促可视化基因芯片,该方法特异性强,灵敏度高,为临床鉴别仔猪腹泻类疾病提供了一种新的方法。
二、用原位杂交试验检测猪腹泻病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用原位杂交试验检测猪腹泻病毒（论文提纲范文）
（1）猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒研究概况 |
| 1.1.1 PEDV流行病学及分子特征 |
| 1.1.2 S蛋白的免疫原性 |
| 1.1.3 黏膜免疫 |
| 1.1.4 PEDV受体研究 |
| 1.1.5 冠状病毒S蛋白三聚体结构解析 |
| 1.1.6 N蛋白 |
| 1.1.7 诊断方法 |
| 1.2 发光元素 |
| 1.3 抗体治疗 |
| 1.3.1 抗体介导的中和作用机制 |
| 1.3.2 PEDV中和性抗体及其表位研究 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA间接ELISA检测方法的建立及应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 细胞、毒株、试验动物、抗体和试剂 |
| 2.2.2 杂交瘤细胞复苏及单抗腹水的制备 |
| 2.2.3 抗体纯化及HRP标记 |
| 2.2.4 PEDV毒株的培养及纯化 |
| 2.2.5 IFA筛选阴性样品及阳性样品 |
| 2.2.6 间接ELISA反应条件的优化 |
| 2.2.7 临界值判定 |
| 2.2.8 特异性试验 |
| 2.2.9 敏感性试验 |
| 2.2.10 重复性实验 |
| 2.2.11 符合性实验及初步应用 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PEDV LNCT2粒子的鉴定 |
| 2.3.2 IFA筛选阴性样品和阳性样品 |
| 2.3.3 最佳工作条件的确定 |
| 2.3.4 批内批间重复性实验 |
| 2.3.5 临界值的确定 |
| 2.3.6 特异性试验 |
| 2.3.7 敏感性试验 |
| 2.3.8 间接ELISA方法的符合性和初步应用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PEDV荧光快速检测试纸条的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 细胞、试验动物、抗体和试剂 |
| 3.2.2 PEDVN基因的扩增及重组质粒构建 |
| 3.2.3 重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.4 抗PEDVN蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.2.5 荧光纳米微球标记PEDV抗体 |
| 3.2.6 荧光纳米微球标记兔IgG抗体 |
| 3.2.7 试纸条的制备 |
| 3.2.8 临界值的判定 |
| 3.2.9 敏感性检测 |
| 3.2.10 特异性检测 |
| 3.2.11 流行病学调查 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PEDV N重组蛋白的表达及纯化 |
| 3.3.2 稳定表达抗PEDV N蛋白的单克隆细胞株的筛选及鉴定 |
| 3.3.3 试纸条的组装及外观 |
| 3.3.4 临界值的判定 |
| 3.3.5 敏感性检测 |
| 3.3.6 试纸条的特异性检测 |
| 3.3.7 试纸条的临床应用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 分泌中和PEDV的单克隆抗体细胞株的筛选及鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 细胞、试验动物、抗体和试剂 |
| 4.2.2 PEDV的培养和纯化 |
| 4.2.3 抗PEDV单克隆抗体的制备 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 PEDV-LNCT2病毒粒子的纯化 |
| 4.3.2 抗PEDV单克隆抗体的制备 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 1B9单抗逃逸毒株的筛选及中和作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞、毒株和试剂 |
| 5.2.2 PEDV-LNCT2毒株的培养 |
| 5.2.3 PEDV多克隆抗体的制备 |
| 5.2.4 PEDV中和性单抗和多抗逃逸毒株的筛选 |
| 5.2.5 S基因序列测定及分析 |
| 5.2.6 关键氨基酸位点的确定 |
| 5.2.7 IFA检测 |
| 5.2.8 pAb与1B9单抗筛选的逃逸毒株的中和试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 中和抗体逃逸毒株筛选 |
| 5.3.2 突变毒株的S基因序列分析 |
| 5.3.3 缺失的氨基酸在PEDV S蛋白结构中的位置 |
| 5.3.4 mutant-1B9与pAb的中和试验 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪主要消化道类病毒概述 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.1 PEDV病原学特征及基因组结构 |
| 1.1.2 PEDV编码蛋白 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒 |
| 1.2.1 TGEV病原学特征及基因组结构 |
| 1.2.2 TGEV编码蛋白 |
| 1.3 猪德尔塔冠状病毒 |
| 1.3.1 PDCoV病原学特征及基因组结构 |
| 1.3.2 PDCoV编码蛋白 |
| 1.4 猪轮状病毒 |
| 1.4.1 PoRV病原学特征及基因组结构 |
| 1.4.2 PoRV编码蛋白 |
| 1.4.3 PoRV分群 |
| 2 猪消化道类病毒分子生物学检测方法研究进展 |
| 2.1 猪消化道病毒性疫病常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.1 猪流行性腹泻病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.2 猪传染性胃肠炎病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.3 猪德尔塔冠状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.1.4 猪轮状病毒常规RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2 猪消化道病毒性疫病实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.1 猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.2 猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.3 猪德尔塔冠状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.2.4 猪轮状病毒实时荧光定量RT-PCR方法研究进展 |
| 2.3 猪消化道病毒性疫病环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.1 猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.2 猪传染性胃肠炎病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.3 猪德尔塔冠状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.3.4 猪轮状病毒环介导等温扩增(LAMP)方法研究进展 |
| 2.4 猪消化道病毒性疫病重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.1 猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.2 猪传染性胃肠炎病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.4.3 猪德尔塔冠状病毒重组酶聚合酶扩增(RPA)方法研究进展 |
| 2.5 猪消化道病毒性疫病基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.1 猪流行性腹泻病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.2 猪传染性胃肠炎病毒基因芯片检测方法研究进展 |
| 2.5.3 猪轮状病毒因芯片检测方法研究进展 |
| 2.6 猪消化道病毒性疫病多重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.1 二重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.2 三重PCR检测方法研究进展 |
| 2.6.3 四重及以上PCR检测方法研究进展 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA及 PoRVC单重RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒来源 |
| 1.2 病料来源 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 病料的处理 |
| 2.3 病毒核酸的提取及cDNA模板的制备 |
| 2.4 病毒核酸的PCR扩增 |
| 2.5 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 2.5.1 目的基因的回收纯化 |
| 2.5.2 目的基因与pMD19-T载体的连接 |
| 2.5.3 重组质粒的转化 |
| 2.5.4 重组质粒的抽提及鉴定 |
| 2.6 单一病毒PCR检测方法的建立 |
| 2.6.1 单一病毒PCR反应体系的建立 |
| 2.6.2 单一病毒PCR反应条件的优化 |
| 2.6.3 单一病毒PCR的敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRVA和PoRVC目的基因的鉴定 |
| 3.2 单一病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 单一病毒RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.2.2 单一病毒RT-PCR扩增结果 |
| 3.2.3 单一病毒的RT-PCR反应条件的优化 |
| 3.2.4 单一病毒RT-PCR敏感性检测 |
| 3.3 单一RT-PCR检测方法对临床样本的检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 规模化猪场猪消化道主要病毒五重RT-PCR方法的建立与初步应用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 模板来源 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 试验使用的主要溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 2.2.2 五重RT-PCR反应退火温度的优化 |
| 2.2.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 2.2.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.5 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 2.2.6 五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 2.3 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 五重RT-PCR反应体系的建立 |
| 3.1.1 五重RT-PCR最佳反应体系 |
| 3.1.2 五重RT-PCR退火温度的优化 |
| 3.1.3 五重RT-PCR反应敏感性试验 |
| 3.1.4 五重RT-PCR反应特异性试验 |
| 3.1.5 五重RT-PCR反应重复性试验 |
| 3.2 五重RT-PCR对临床病料的检测 |
| 4 猪消化道主要病毒五重RT-PCR试剂盒的组装 |
| 4.1 阳性对照的制备 |
| 4.2 阴性对照的制备 |
| 4.3 反应液的制备 |
| 4.4 试剂盒说明 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 攻读硕士学位期间参与发表的论文 |
| 附录二 攻读硕士学位期间参与的课题 |
| 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
（3）猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 前言 |
| 2 猪细小病毒简介及检测方法研究进展 |
| 2.1 病原学特点 |
| 2.2 流行病学特点 |
| 2.3 检测方法 |
| 3 猪圆环病毒Ⅱ型及其诊断方法研究进展 |
| 3.1 病原学特点 |
| 3.2 流行病学特点 |
| 3.3 诊断方法 |
| 4 副猪嗜血杆菌病检测方法研究进展 |
| 4.1 病原学特点 |
| 4.2 流行病学特点 |
| 4.3 检测方法 |
| 第二章 猪细小病毒、猪圆环病毒2 型和副猪嗜血杆菌SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 阳性质粒的构建 |
| 2.2 反应条件优化结果 |
| 2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.4 扩增产物熔解曲线分析 |
| 2.5 特异性检测 |
| 2.6 重复性试验结果 |
| 2.7 敏感性检验 |
| 2.8 病料检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪细小病毒与猪圆环病毒Ⅱ型双重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 猪细小病毒与副猪嗜血杆菌双重SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪圆环病毒Ⅱ型与副猪嗜血杆菌双重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 猪细小病毒、猪圆环病毒Ⅱ型和副猪嗜血杆菌三重SYBR Green Ⅰ实时PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 体系优化结果 |
| 2.2 熔解曲线分析 |
| 2.3 特异性检测 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 敏感性检验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件(A) |
| 附件(B) |
| 附件(C) |
| 附件(D) |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（4）猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 TGEV研究进展 |
| 1.2 TGEV生物学特性 |
| 1.2.1 TGEV分类 |
| 1.2.2 形态特征 |
| 1.2.3 病毒基因组结构与其编码产物 |
| 1.3 TGEV流行病学 |
| 1.4 TGE临床症状 |
| 1.5 TGEV病理特征 |
| 1.6 TGEV发病机理 |
| 1.7 TGEV遗传特性 |
| 1.8 TGEV的生物学检测方法 |
| 1.8.1 聚合酶链式反应技术 |
| 1.8.2 核酸探针杂交技术 |
| 1.8.3 免疫胶体金技术 |
| 1.9 预防 |
| 1.10 目的与意义 |
| 2 TGEV HQ2016 的全基因组分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品处理 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 TGEV HQ2016 全基因组测序 |
| 2.2.4 生物学信息分析软件 |
| 2.2.5 核苷酸与氨基酸同源性分析 |
| 2.2.6 系统进化树构建 |
| 2.2.7 基因重组分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 基因结构分析 |
| 2.3.2 结构基因分析 |
| 2.3.3 非结构基因分析 |
| 2.3.4 同源性分析 |
| 2.3.5 系统进化树分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 TGEV半巢式RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 病毒RNA的提取 |
| 3.2.3 合成cDNA |
| 3.3 半巢式RT-PCR检测方法条件优化 |
| 3.3.1 最适引物使用量的优化 |
| 3.3.2 最适退火温度的确定 |
| 3.3.3 PCR扩增体系与循环参数 |
| 3.3.4 PCR特异性试验 |
| 3.3.5 PCR敏感性试验 |
| 3.3.6 PCR重复性试验 |
| 3.3.7 半巢式PCR检测方法的应用 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 最佳PCR反应条件 |
| 3.4.2 PCR特异性试验 |
| 3.4.3 PCR敏感性试验 |
| 3.4.4 PCR重复性试验 |
| 3.4.5 临床样品检测 |
| 3.4.6 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（5）猪德尔塔冠状病毒免疫应答的初步评价及感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 外文缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪肠道冠状病毒概述 |
| 2 猪德尔塔冠状病毒概述 |
| 3 PDCoV病原学 |
| 3.1 PDCoV基因组和结构 |
| 3.2 PDCoV蛋白功能 |
| 3.3 PDCoV流行与传播 |
| 3.4 PDCoV致病性和组织嗜性 |
| 3.5 PDCoV感染年龄依赖性 |
| 3.6 PDCoV与PEDV和TGEV抗原交叉反应 |
| 4 PDCoV诊断技术 |
| 4.1 电子显微镜 |
| 4.2 PCR检测 |
| 4.2.1 泛-冠状病毒RT-PCR |
| 4.2.2 常规RT-PCR |
| 4.2.3 Real-time RT-PCR |
| 4.2.4 反转录绝缘等温PCR |
| 4.3 免疫组化和原位杂交 |
| 4.4 病毒分离 |
| 4.5 猪生物测定 |
| 4.6 免疫荧光试验 |
| 4.7 病毒中和试验 |
| 4.8 ELISA |
| 4.9 荧光免疫微球分析 |
| 5 蛋白质组学技术及其应用 |
| 5.1 蛋白质组学概述 |
| 5.2 蛋白质组学在冠状病毒研究中的应用 |
| 5.3 TMT定量蛋白质组学与PRM相结合的策略 |
| 6 本研究目的与意义 |
| 第二章 PDCoV LFD-RPA快速检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料、载体、细胞和临床样品 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂及耗材 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床腹泻样品处理、引物与探针设计 |
| 2.2 总病毒RNA的提取 |
| 2.3 重组质粒标准品p MD-19T-N构建 |
| 2.3.1 反转录 |
| 2.3.2 PCR扩增 |
| 2.3.3 PCR产物纯化 |
| 2.3.4 目的片段加“A”反应 |
| 2.3.5 p MD-20T-N载体构建 |
| 2.3.6 转化 |
| 2.3.7 p MD-20T-N质粒提取 |
| 2.3.8 p MD-20T-N质粒双酶切验证 |
| 2.4 LFD-RPA检测PDCoV反应体系及条件的建立 |
| 2.5 优化LFD-RPA反应温度 |
| 2.6 优化LFD-RPA反应时间 |
| 2.7 LFD-RPA重复性试验 |
| 2.8 LFD-RPA灵敏性试验 |
| 2.9 LFD-RPA特异性试验 |
| 2.10 LFD-RPA临床样品检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PDCoV N基因的扩增 |
| 3.2 p MD-20T-N标准质粒DNA的构建 |
| 3.3 优化LFD-RPA反应温度 |
| 3.4 优化LFD-RPA反应时间 |
| 3.5 LFD-RPA重复性试验 |
| 3.6 LFD-RPA灵敏性试验 |
| 3.7 LFD-RPA特异性试验 |
| 3.8 LFD-RPA临床样品检测 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 PDCoV毒株的分离、鉴定及生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病料、菌株及载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 临床腹泻样品处理 |
| 2.2 RNA提取、反转录及RT-PCR检测 |
| 2.3 病毒分离与传代 |
| 2.4 间接免疫荧光(IFA) |
| 2.5 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株TCID50测定 |
| 2.6 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株生长曲线测定 |
| 2.7 透射电子显微镜检测病毒粒子 |
| 2.8 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株全基因组序列测定 |
| 2.8.1 引物设计 |
| 2.8.2 RNA提取、反转录、RT-PCR及PCR产物回收 |
| 2.8.3 克隆反应及序列测定 |
| 2.9 序列分析及基于S基因构建系统进化树 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床样品RT-PCR检测 |
| 3.2 PDCoV细胞病变 |
| 3.3 PDCoV RT-PCR检测 |
| 3.4 免疫荧光鉴定 |
| 3.5 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株TCID50测定 |
| 3.6 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株生长曲线测定 |
| 3.7 PDCoV CH/XJYN/2016 电镜观察 |
| 3.8 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株全基因组序列测定 |
| 3.9 S基因序列及系统进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 PDCoV对不同日龄仔猪的致病性分析及免疫应答的初步评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 ELISA检测 |
| 2.2 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株感染哺乳仔猪致病性分析 |
| 2.3 组织病理学和免疫组化(IHC)分析 |
| 2.4 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株接种断奶仔猪PDD50测定 |
| 2.5 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株接种后保护效应及抗体水平变化 |
| 2.6 病毒中和试验(VN) |
| 2.7 检测细胞因子IFN-γ |
| 2.8 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株免疫应答的初步评价 |
| 2.8.1 灭活疫苗的制备 |
| 2.8.2 动物免疫保护实验 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株感染哺乳仔猪致病性分析 |
| 3.2 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株接种断奶仔猪PDD50测定 |
| 3.3 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株接种后的保护效应 |
| 3.4 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株两次接种后抗体水平变化 |
| 3.5 病毒中和试验 |
| 3.6 口腔黏膜免疫反应 |
| 3.7 细胞因子(IFN-γ)检测 |
| 3.8 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株免疫应答的初步评价 |
| 3.8.1 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株灭活疫苗免疫原性评价 |
| 3.8.2 PDCoV CH/XJYN/2016 毒株灭活疫苗保护效果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 PDCoV感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 PDCoV最佳感染时间的确定 |
| 2.2 蛋白质组学分析样品的收集 |
| 2.3 细胞总蛋白提取和定量分析 |
| 2.4 胰酶酶解 |
| 2.5 TMT标记 |
| 2.6 高效液相色谱仪分级 |
| 2.7 液相色谱-质谱联用分析 |
| 2.8 数据库搜索 |
| 2.9 差异表达蛋白的鉴定和注释 |
| 2.10 差异表达蛋白功能富集聚类和互作网络分析 |
| 2.11 PRM验证 |
| 2.11.1 液相色谱-质谱联用分析 |
| 2.11.2 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 最佳感染时间的确定 |
| 3.2 鉴定蛋白的基本信息 |
| 3.2.1 质谱鉴定的基本信息 |
| 3.2.2 质谱鉴定到肽段的长度分布 |
| 3.2.3 质谱鉴定到蛋白分子量与覆盖度的关系 |
| 3.2.4 质谱仪的质量精度分布 |
| 3.2.5 样品重复性检测 |
| 3.2.6 鉴定差异表达蛋白 |
| 3.3 差异表达蛋白分析 |
| 3.4 差异表达蛋白聚类和网络互作分析 |
| 3.5 PRM对候选差异表达蛋白的验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（6）抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 流行病学 |
| 1.1 临床流行病学 |
| 1.2 分子流行病学 |
| 2 PEDV病原学 |
| 2.1 PEDV分类 |
| 2.2 形态结构 |
| 2.3 理化性质 |
| 2.4 细胞培养特性 |
| 2.5 基因组结构 |
| 2.5.1 ORF3基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.2 PEDV ORF1ab基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.3 PEDV S基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.4 M基因与相关蛋白功能 |
| 2.5.5 PEDV E基因与编码蛋白功能 |
| 2.5.6 PEDV N基因与编码蛋白功能 |
| 3 PEDV的病理变化与发病机理 |
| 4 变异株的流行特征 |
| 5 PED的诊断技术 |
| 5.1 病毒的分离鉴定 |
| 5.2 血清学检测方法 |
| 5.3 病毒核酸检测 |
| 6 疫苗研究进展 |
| 6.1 灭活疫苗 |
| 6.2 弱毒疫苗 |
| 6.3 联苗 |
| 6.4 基因工程苗 |
| 7 单抗在PEDV诊断中的应用 |
| 引言 |
| 试验1 基于PEDVN蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒和血清 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组N(rN)蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 1.2.4 间接ELISA方法条件的优化 |
| 1.2.5 阴性样品临界值的确定 |
| 1.2.6 特异性分析 |
| 1.2.7 敏感性分析 |
| 1.2.8 重复性分析 |
| 1.2.9 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 PEDV N基因的扩增及表达载体的构建 |
| 2.2 rN蛋白的表达、纯化及western blot分析 |
| 2.3 间接ELISA方法优化结果 |
| 2.4 阴性样品临界值的确定 |
| 2.5 特异性试验结果 |
| 2.6 敏感性试验结果 |
| 2.7 重复性试验结果 |
| 2.8 临床样品检测结果 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验2 抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 免疫抗原的制备 |
| 1.2.2 小鼠的免疫 |
| 1.2.3 免疫小鼠血清效价的检测 |
| 1.2.4 建立杂交瘤细胞株 |
| 1.2.4.1 先制备饲养细胞 |
| 1.2.4.2 SP2/0细胞的准备 |
| 1.2.4.3 脾细胞的制备 |
| 1.2.4.4 细胞融合 |
| 1.2.4.5 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.2.4.6 亚型的鉴定 |
| 1.2.4.7 亚克隆 |
| 1.2.5 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 1.2.6 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 1.2.7 腹水的制备及纯化 |
| 1.2.8 纯化腹水的效价测定 |
| 1.2.9 纯化腹水的特异性检测 |
| 1.2.10 纯化腹水的稳定性检测 |
| 1.2.11 阻断ELISA方法的初步鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠效价检测结果 |
| 2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.3 单抗亚型的鉴定 |
| 2.4 杂交瘤细胞特异性检测 |
| 2.5 杂交瘤细胞稳定性检测 |
| 2.6 腹水的制备及纯化 |
| 2.7 纯化腹水的效价测定 |
| 2.8 纯化腹水的特异性测定 |
| 2.9 纯化腹水的稳定性测定 |
| 2.10 阻断ELISA方法的鉴定 |
| 3 讨论与分析 |
| 试验3 PEDV(变异毒株)灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 仔猪攻毒试验 |
| 1.2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 1.2.3 仔猪腹泻发病指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 仔猪攻毒实验 |
| 2.2 妊娠母猪攻毒仔猪获得免疫保护试验 |
| 3 讨论与分析 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 个人简历 |
（7）猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 主要缩略词英汉对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.PEDV 的分类 |
| 2.PEDV基因组结构和功能 |
| 3.PEDV编码蛋白和功能 |
| 4.PED流行病学 |
| 4.1 国外PED流行病学 |
| 4.2 国内PED流行病学 |
| 5.PEDV进入细胞的影响因素 |
| 5.1 病毒受体的作用 |
| 5.2 激活水解 S 蛋白的条件 |
| 5.3 PEDV 病毒复制的环境要求 |
| 6.PEDV疫苗研究历史 |
| 6.1 北美PEDV疫苗研究历 |
| 6.2 亚洲PEDV疫苗研究历 |
| 7.PEDV的病原学和血清学诊断方法 |
| 7.1 PEDV病毒感染动力学和宿主对感染的反应 |
| 7.2 PEDV诊断 |
| 7.2.1 病毒学试验检测PEDV和病毒抗原 |
| 7.2.2 PCR检测PEDV核酸 |
| 7.2.3 检测PEDV特异性抗体的血清学试验 |
| 8.免疫色谱法或侧向流分析法 |
| 8.1 常规侧向流分析法(LFA) |
| 8.2 荧光微球免疫分析LFAs |
| 8.3 LFA材料 |
| 8.4 纳米颗粒 |
| 8.5 LFA检测 |
| 8.6 先进分析优化工具 |
| 9.本研究的目的意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒N基因的克隆、鉴定及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 目的基因、菌种和载体 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 1.5 仪器和设备 |
| 1.6 目的基因的扩增 |
| 2 结果 |
| 2.1 基因扩增 |
| 2.2 重组质粒的构建 |
| 2.3 目的基因核苷酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒N基因原核表达、纯化以及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株、主要试剂 |
| 1.2 常用缓冲溶液和培养基的制 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 表达载体的构建与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pET-32a-N的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的诱导表达和纯化 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的制备 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 细胞系、试验动物和病毒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 单抗制备常用溶液及其配制 |
| 1.5 动物免疫 |
| 1.6 骨髓瘤细胞的准备 |
| 1.7 饲养层细胞的制备 |
| 1.8 脾细胞的准备 |
| 1.9 细胞融合 |
| 1.10 杂交瘤细胞的制备 |
| 1.11 间接ELISA检测方法的建立 |
| 1.12 杂交瘤细胞的筛选 |
| 1.13 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 1.14 杂交瘤细胞的冻存和复苏 |
| 1.15 腹水的制备及抗体效价测定 |
| 1.16 单抗亚类的鉴定 |
| 1.17 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 1.18 单克隆抗体Western blot鉴定 |
| 1.19 杂交瘤细胞株稳定性检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.2 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3 单抗效价测定 |
| 2.4 单抗亚类鉴定 |
| 2.5 单克隆抗体特异性鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体Western blot鉴定 |
| 2.7 单克隆抗体的IFA分析 |
| 2.8 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性 |
| 3 讨论 |
| 第五章 猪流行性腹泻病毒的金标试纸检测方法的初步建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 样品稀释 |
| 1.4 氯金酸水溶液 |
| 1.5 毒株 |
| 1.6 胶体金制备 |
| 1.7 胶体金标记抗体的制备 |
| 1.7.1 单抗纯化 |
| 1.7.2 免疫胶体金的制备和纯化 |
| 1.7.3 检测单抗及质控二抗标记量的确定 |
| 1.7.4 金标检测试纸条的组装 |
| 1.7.5 金标试纸条检测结果的判定 |
| 1.7.6 金标试纸条评价试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 单抗纯化效果鉴定 |
| 2.2 胶体金的制备 |
| 2.3 免疫胶体金的制备 |
| 2.4 检测带和质控带的硝酸纤维素膜(NC膜)蛋白浓度确定 |
| 2.5 金标试纸条评价试验 |
| 3 讨论 |
| 第六章 猪流行性腹泻病毒不同时间毒株S基因的同源性和遗传分析 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 31 株PEDV参考毒株S基因的核苷酸序列分析 |
| 2.2 31 株PEDV参考毒株S蛋白序列分析 |
| 3 讨论 |
| 第七章 猪流行性腹泻病毒S1优化基因在重组杆状病毒的表达与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组杆状病毒转移载体构建和鉴定 |
| 2.2 重组杆粒构建和鉴定 |
| 2.3 重组杆状病毒滴度的测定 |
| 2.4 表达蛋白间接免疫荧光鉴定 |
| 2.5 纯化蛋白SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.6 重组蛋白Western Blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第八章 猪流行性腹泻病毒亚单位纳米佐剂疫苗免疫评价 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠中和抗体检测结果 |
| 2.2 猪不同免疫组中和抗体检测结果 |
| 2.2.1 无免疫佐剂组IFN-γ含量检测 |
| 2.2.2 无免疫佐剂组IL-4 含量检测 |
| 3 讨论 |
| 第九章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 导师简介 |
（8）猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap蛋白的原核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 概况 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒分类和由来 |
| 1.2.2 理化特性 |
| 1.2.3 培养特性 |
| 1.2.4 病毒的致病机理 |
| 1.2.5 基因组结构及功能 |
| 1.3 PCV3流行病学调查 |
| 1.3.1 传染源 |
| 1.3.2 传播途径 |
| 1.3.3 易感动物 |
| 1.3.4 发生与分布 |
| 1.4 PCV3检测技术研究进展 |
| 1.4.1 聚合酶链式反应 |
| 1.4.2 巢式PCR |
| 1.4.3 荧光定量PCR |
| 1.4.4 原位杂交技术 |
| 1.4.5 LAMP技术 |
| 1.4.6 ELISA技术 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样本信息 |
| 2.1.2 毒株、菌株及质粒 |
| 2.1.3 主要试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 主要试剂与培养基的制备 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要分子生物学软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病料样品的处理 |
| 2.2.2 病毒核酸的提取 |
| 2.2.3 PCV3 PCR方法的建立 |
| 2.2.4 PCV2和PCV3双重PCR鉴别方法的建立与应用 |
| 2.2.5 2016~2018年我国多个地区PCV3的流行病学调查 |
| 2.2.6 PCV3全基因组测序及鉴定 |
| 2.2.7 PCV3 Cap蛋白的原核表达 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 PCR检测 |
| 3.2 鉴别PCV2和PCV3双重PCR方法的建立与应用 |
| 3.2.1 双重PCR检测的引物浓度优化 |
| 3.2.2 鉴别PCV2和PCV3双重PCR引物的特异性试验 |
| 3.2.3 鉴别双重PCR的敏感性试验 |
| 3.2.4 鉴别双重PCR最佳退火温度的优化 |
| 3.2.5 鉴别双重PCR重复性试验结果 |
| 3.2.6 鉴别PCR的临床检测试验 |
| 3.3 阳性率检测 |
| 3.3.1 我国部分地区PCV3阳性率的检测 |
| 3.3.2 发病猪场不同阶段猪群感染PCV3阳性率的检测 |
| 3.4 PCV3 全基因及Cap基因扩增结果 |
| 3.4.1 PCV3全基因扩增结果 |
| 3.4.2 PCV3 Cap基因扩增结果 |
| 3.5 PCV3遗传进化分析 |
| 3.5.1 PCV3全基因遗传相似性分析 |
| 3.5.2 PCV3全基因遗传进化树分析 |
| 3.5.3 PCV3 Cap基因遗传相似性分析 |
| 3.5.4 PCV3 Cap基因遗传进化树分析 |
| 3.6 Cap蛋白原核表达结果 |
| 3.6.1 目的基因的扩增 |
| 3.6.2 重组表达载体菌落PCR鉴定及双酶切鉴定 |
| 3.6.3 基因序列测序及分析 |
| 3.6.4 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定 |
| 3.6.5 最佳重组蛋白诱导条件的确定 |
| 3.6.6 重组蛋白的表达形式 |
| 3.6.7 阳性血清的鉴定 |
| 3.6.8 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 4.全文讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 PCV2与PCV3双重方法的建立 |
| 4.1.2 PCV3的流行病学调查 |
| 4.1.3 PCV3的遗传进化分析 |
| 4.1.4 PCV3 Cap蛋白原核表达 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士研究生期间所获科研成果 |
（9）猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一部分 文献综述 |
| 1 多重探针扩增技术的研究进展 |
| 2 猪流行性腹泻病毒研究 |
| 3 猪传染性胃肠炎病毒研究 |
| 4 猪轮状病毒研究 |
| 5 猪Delta冠状病毒研究 |
| 6 诺如病毒研究 |
| 7 博卡病毒研究 第二部分 试验研究 |
| 第一章 检测6种猪病毒性腹泻疾病病原的MLPA研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒及临床样品 |
| 1.2 试剂订购 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 MLPA基础探针设计 |
| 1.5 一步法预扩增引物设计 |
| 1.6 目的基因片段的质粒构建 |
| 1.7 预扩增目的片段 |
| 1.8 MLPA试验步骤 |
| 1.9 MLPA探针的优化 |
| 1.10 特异性试验 |
| 1.11 灵敏度试验 |
| 1.12 重复性试验 |
| 1.13 临床样品检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 阳性标准品的制备与验证 |
| 2.2 MLPA探针的优化 |
| 2.3特异性实验 |
| 2.4 灵敏度试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 临床样品检测 |
| 3 讨论 |
| 第二章 一步法双重荧光定量RT-PCR检测PEDV变异毒株与疫苗毒株的方法建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒和细菌 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要试验仪器 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 阳性模板制备 |
| 1.6 变异毒株和疫苗毒株反应条件的优化 |
| 1.7 标准曲线的建立 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 灵敏度试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 临床样品检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 阳性模板的制备 |
| 2.2 反应条件的优化 |
| 2.3 标准曲线的建立 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 灵敏度试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 临床样品检测 |
| 3 讨论 结论 参考文献 个人简历 致谢 |
（10）同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1.猪病毒性腹泻病毒的研究进展 |
| 1.1 猪流行性腹泻病毒概述 |
| 1.2 猪传染性胃肠炎病毒概述 |
| 1.3 猪轮状病毒A型概述 |
| 1.4 猪delta冠状病毒概述 |
| 1.5 猪病毒性腹泻传统诊断方法 |
| 2.基因芯片技术及其在病原诊断上的应用 |
| 本研究的目的与意义 |
| 1.材料 |
| 1.1 阳性病料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 临床样品 |
| 2.方法 |
| 2.1 目的基因重组质粒的构建 |
| 2.2 寡核苷酸探针设计和合成 |
| 2.3 芯片的制备 |
| 2.4 不对称PCR引物浓度的优化 |
| 2.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片检测步骤 |
| 2.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的条件优化 |
| 2.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的评价及应用 |
| 3.结果 |
| 3.1 靶基因阳性质粒提取结果 |
| 3.2 不对称PCR扩增体系的条件优化结果 |
| 3.3 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片探针浓度的选择 |
| 3.4 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交时间选择 |
| 3.5 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片杂交温度选择 |
| 3.6 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片酶浓度的选择 |
| 3.7 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片显色时间的选择 |
| 3.8 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的特异性检测结果 |
| 3.9 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的敏感性检测结果 |
| 3.10 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的保存期检测结果 |
| 3.11 PEDV-TGEV-GAR-PDCoV共检芯片的临床样品检测结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 靶基因的选择 |
| 4.2 寡核苷酸探针的设计 |
| 4.3 不对称PCR扩增技术的讨论 |
| 4.4 可视化芯片条件优化的讨论 |
| 4.5 关于可视化芯片质量评估结果的讨论 |
| 4.6 关于可视化芯片临床应用评价的讨论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 ：探针基因序列 |
| 附录二 ：试验试剂的配置 |
| 附录三 ：部分临床样品可视化基因检测结果 |
| 作者简历 |
四、用原位杂交试验检测猪腹泻病毒（论文参考文献）
- [1]猪流行性腹泻病毒SIgA抗体和抗原诊断方法的建立及其S蛋白中和构象表位研究[D]. 刘建波. 中国农业科学院, 2020
- [2]猪消化道主要病毒性疫病mPCR诊断方法的建立及应用[D]. 郭倩妤. 贵州大学, 2020
- [3]猪细小病毒、猪圆环病毒病Ⅱ型和副猪嗜血杆菌SYBR Green Ⅰ多重荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 胡斌. 河南科技学院, 2020
- [4]猪传染性胃肠炎病毒HQ2016毒株全基因组测序及半巢式RT-PCR检测方法建立[D]. 李明月. 黑龙江八一农垦大学, 2020(10)
- [5]猪德尔塔冠状病毒免疫应答的初步评价及感染LLC-PK细胞的蛋白质组学分析[D]. 高翔. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [6]抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备及PEDV灭活疫苗免疫攻毒保护效果的研究[D]. 杨朋霞. 河南农业大学, 2020(06)
- [7]猪流行性腹泻病毒金标试纸检测方法的建立及新型亚单位疫苗的研究[D]. 祁光宇. 甘肃农业大学, 2019(02)
- [8]猪圆环病毒3型分子流行病学调查及Cap蛋白的原核表达[D]. 俞丽. 华南农业大学, 2019(02)
- [9]猪病毒性腹泻疾病病原核酸检测技术的研究[D]. 刘正奎. 浙江农林大学, 2019(06)
- [10]同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用[D]. 刘志鹏. 四川农业大学, 2018(02)