一、肝细胞癌组织凋亡基因Bcl-X_L、Bcl-2的表达及意义（论文文献综述）
邓怡[1]（2021）在《XPA通过PI3K/AKT/mTOR诱导自噬和凋亡抑制肝细胞癌的研究》文中研究说明目的:研究XPA在临床肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）患者中的表达情况以及与临床预后的相关性;探讨XPA在HCC中的生物学功能,以及XPA调控HCC自噬活化,从而触发细胞凋亡的机制;通过建立HCC裸鼠皮下成瘤模型,研究靶向XPA是否可成为HCC新的治疗靶点,为开发HCC新的治疗策略提供理论依据。方法:1.生物信息学分析以及XPA相关检测分析:临床HCC患者预后五年生存曲线来自数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,经R语言分析软件分析。WB、qRT-PCR和IHC法检测XPA在不同病理分期的人HCC组织和癌旁非肿瘤肝组织中的表达。WB和qRT-PCR技术检测XPA在人肝肿瘤细胞株Hep3B、Huh7、SMMC7721、SK-Hep-1、Bel7402、HepG2、LM9以及人正常肝细胞株HL7702中的蛋白和m RNA表达水平。2.细胞生物学功能研究:通过慢病毒感染的方式在Hep3B、Huh7肝癌细胞中过表达XPA,通过药物筛选,构建稳定表达XPA的HCC体外细胞实验模型LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7。通过WB和q RT-PCR技术检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中XPA的蛋白和m RNA表达情况。平板细胞克隆形成实验和CCK-8法检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞增殖。WB技术检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中上皮-间充质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）蛋白标志物E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达。Transwell法和细胞划痕实验检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞的侵袭和迁移。3.WB检测LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中自噬相关分子LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达以及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3、Bax和抗凋亡蛋白Bcl2的表达,TUNEL染色检测LV-XPA-Hep3B、LVXPA-Huh7肝癌细胞凋亡的情况。LC3-GFP-m RFP荧光双标慢病毒系统及激光共聚焦显微镜检测自噬流。经RAPA和3-MA处理LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞,通过WB检测自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的表达水平。4.细胞学机制研究:WB检测经IGF-1处理后LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞中自噬分子LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及PI3K/AKT/mTOR信号通路分子AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR的表达水平变化。5.裸鼠皮下成瘤体内实验:用LV-NC-Hep3B和LV-XPA-Hep3B肝癌细胞构建HCC裸鼠皮下成瘤实验模型,测量皮下成瘤瘤体体积、重量,并绘制生长曲线。裸鼠肿瘤组织提取物经WB检测XPA、LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR等蛋白的表达,IHC检测XPA、LC3B的表达,TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡。结果:1.经过TCGA数据库中收集的349个HCC患者的生存数据和基因表达信息分析发现,XPA高表达的HCC患者5年生存率较低表达的患者明显升高,同时我们发现XPA表达水平与年龄相关。2.XPA在人HCC组织中的表达水平低于癌旁非肿瘤肝组织,XPA表达水平越高,HCC患者的总体生存期越高,且疾病预后好。与人正常肝细胞系HL7702相比,人肝肿瘤细胞系SMMC7721、HepG2、SK-Hep-1、LM9、Bel7402、Hep3B和Huh7中XPA m RNA和蛋白水平表达降低,其中以两种HCC细胞株Hep3B和Huh7表达最低。3.通过慢病毒感染的方式在Hep3B和Huh7肝癌细胞中过表达XPA,构建稳定表达XPA的LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝细胞癌体外细胞实验模型。与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中XPA的m RNA和蛋白表达水平均显着上调。4.与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC的细胞增殖受到抑制。LV-XPA组HCC细胞中E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin和vimentin蛋白表达降低。LV-XPA组HCC细胞的侵袭和迁移都被显着抑制。5.与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的蛋白表达水平显着升高,而p62表达水平下降,Cleaved-caspase-3和Bax的蛋白表达水平增加,Bcl2蛋白表达水平降低。TUNEL染色显示,LV-XPA组HCC细胞的凋亡小体数量远高于LV-NC组,表明自噬的激活可能促进细胞凋亡。LC3-GFP-m RFP自噬双标慢病毒系统结果显示,与LV-NC组相比,LV-XPA组HCC细胞中的荧光斑点明显增多,merge后的红色及黄色斑点明显增多,提示自噬流增强,表明过表达XPA能有效增强自噬流。6.使用RAPA和3-MA处理LV-XPA-Hep3B、LV-XPA-Huh7肝癌细胞,结果显示,RAPA和XPA单独作用于HCC细胞时,都能有效诱导HCC细胞致死性自噬,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平升高;当RAPA和XPA共同作用于HCC细胞时,自噬诱导功能更强。3-MA单独作用于HCC时,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达被部分抑制,但是当3-MA与XPA共同作用于HCC细胞时,与LV-XPA组相比,LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平降低,表明3-MA抑制了XPA诱导的自噬激活。7.使用不同浓度IGF-1处理HCC细胞,p-AKT表达水平以IGF-1剂量依赖性方式被上调,并且在200ng/m L和300ng/m L浓度时作用最强,两者没有统计学差异。LV-XPA组HCC细胞中LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平增加,而IGF-1抑制这些蛋白的表达。在HCC细胞中仅过表达XPA时,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平部分降低;相对于IGF-1单独作用,IGF-1和LV-XPA共同作用于HCC细胞时,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平相对降低。结果表明,通过上调XPA来激活HCC细胞自噬,其可能是依赖于调节PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。8.通过构建LV-XPA-Hep3B肝细胞癌裸鼠皮下成瘤模型,研究发现,与LV-NC组裸鼠相比,LV-XPA组裸鼠的平均肿瘤体积和肿瘤重量较小,裸鼠的生存期较长。LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中XPA、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达水平升高,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平降低。IHC与WB结果一致,IHC染色显示XPA表达在LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中显着增加,并且LC3B表达也有所增加。TUNEL染色发现,与LV-NC组相比,LV-XPA组裸鼠肿瘤组织中发生凋亡的细胞数目增加。所有这些数据表明,XPA可以诱导肝细胞癌裸鼠皮下成瘤瘤体组织的自噬和促进凋亡,且该作用可能是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。结论:1.XPA对于临床HCC患者可能是一种预后良好的潜在标志物。2.XPA的表达水平在人HCC组织和人HCC细胞系中对比癌旁非肿瘤肝组织和人正常肝细胞系明显降低。3.成功构建过表达XPA的HCC细胞实验模型,在HCC细胞中上调XPA表达,证实了XPA通过增加E-cadherin蛋白表达和减少N-cadherin、vimentin蛋白表达来抑制HCC细胞EMT。在HCC细胞中上调XPA表达,显着抑制了HCC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。4.过表达XPA通过增加LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin1并降低p62蛋白表达水平来诱导HCC细胞自噬,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体数量与XPA表达水平呈正相关。同时,凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3和Bax的蛋白表达水平增加,Bcl2蛋白表达水平降低,凋亡相关蛋白的表达水平和凋亡小体的数量与XPA表达水平呈正相关,抗凋亡蛋白的表达水平与XPA表达水平呈负相关。XPA诱导HCC细胞自噬的作用可被RAPA增强,被3-MA逆转,表明XPA可以诱导致死性自噬的激活,从而可能促进细胞凋亡,说明致死性自噬在XPA抑制HCC细胞的过程中有着重要作用。5.XPA可以逆转IGF-1对信号通路的激活作用,以及XPA可以逆转IGF-1对自噬的抑制作用,表明XPA可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活达到抑制HCC的目的,这一作用可能是通过诱导HCC致死性自噬发生的。6.成功构建HCC裸鼠皮下成瘤模型,与LV-NC组相比,LV-XPA组裸鼠皮下肿瘤生长被显着抑制,裸鼠生存期明显延长。XPA可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路从而诱导HCC致死性自噬,促进肿瘤细胞凋亡,最终抑制HCC的发生和发展。
张波[2]（2021）在《Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制》文中研究指明邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP]作为最常用邻苯二甲酸酯（phthalate esters,PAEs）类的增塑剂,广泛存在于环境介质中,可通过呼吸、饮食和皮肤接触等途径进入婴幼儿体内。进入体内的DEHP可在肝脏和小肠细胞中首先水解并通过其他代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]对机体产生毒性作用。神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是最常见的小儿颅外恶性肿瘤,严重危害儿童的生命健康。一些环境内分泌干扰物能够促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。DEHP作为一种具有神经毒性作用的环境内分泌干扰物可能影响神经母细胞瘤的增殖和迁移,但其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞并给予MEHP暴露,明确MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖和迁移的影响;通过抑制Notch信号通路,探讨Notch信号通路在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用机制,可为防治神经母细胞瘤和DEHP的健康损害提供科学依据。第一部分 MEHP对SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期和细胞凋亡关键基因在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露,CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率;根据CCK8结果确定染毒剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、低剂量组（10μM MEHP）、中剂量组（50μM MEHP）、高剂量组（250μM MEHP）,暴露时间为12h和24h。采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR方法检测细胞周期、凋亡关键基因C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2 m RNA表达水平;western blot方法检测细胞周期、凋亡关键蛋白C-MYC、Cyclin D1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析,MEHP暴露组和对照组多组间差异比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA）,组间两两比较采用LSD检验法（Least-Significant Difference）,非正态数据采用秩和检验。检验水准为α=0.05。结果:1.MEHP暴露12h和24h后,各染毒剂量组SH-SY5Y细胞存活率均明显高于对照组（P<0.05）;随着暴露时间的增加,32、64、128、250、500和1000μM MEHP组细胞存活率明显升高（P<0.05）。2.MEHP暴露12h和24h后,MEHP暴露组G1期细胞数量均显着减少（P<0.05）,MEHP组细胞S期细胞百分比增加（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h,MEHP暴露组SH-SY5Y细胞凋亡水平显着减低（P<0.05）;且24h组250μM MEHP暴露组细胞凋亡水平低于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组C-MYC、Cyclin D1 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）;CDK4和P27的m RNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞Bax m RNA和蛋白表达水平降低（P<0.05）;Bcl-2 m RNA和蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可以调节SH-SY5Y细胞周期、抑制细胞凋亡,促进SH-SY5Y细胞增殖。2.MEHP暴露能够上调细胞周期关键蛋白C-MYC、Cyclin D1的表达,加速细胞周期,促进SH-SY5Y细胞增殖。3.MEHP暴露能够调节细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,抑制SHSY5Y细胞凋亡,促进神经母细胞瘤增殖。第二部分 MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响,探讨细胞迁移关键基因和趋化因子在其中的作用。方法:SH-SY5Y细胞培养和实验分组与染毒同第一部分。采用ELISA法检测趋化因子VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8分泌水平;划痕实验检测细胞迁移水平;transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;实时荧光定量PCR方法检测细胞迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、TWIST、Vimentin、HIF-1α、GPR81和Versican m RNA表达水平;western blot方法检测细胞迁移关键蛋白表达水平。结果:1.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的迁移距离,MEHP暴露24h后,细胞的迁移距离显着增加（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的侵袭能力,中、高剂量MEHP暴露组细胞侵袭能力显着升高（P<0.05）。3.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的VEGF、PDGF以及TGF-β1的分泌水平,且24h组VEGF、PDGF和TGF-β1水平显着高于12h组（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,中、高剂量组SH-SY5Y细胞E-Cadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着低于对照组和DMSO组（P<0.05）;高剂量组NCadherin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于其余各组（P<0.05）;与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞N-Cadherin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,高剂量组Vimentin基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组、DMSO组和低剂量组;与12h暴露组相比,24h各剂量组Vimentin m RNA的表达水平升高（P<0.05）;中、高剂量组SNAIL基因m RNA和蛋白表达升高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组HIF-1α基因m RNA和蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量组SH-SY5Y细胞HIF-1αm RNA的表达水平更高（P<0.05）;中、高剂量MEHP暴露组Versican基因m RNA和蛋白表达水平显着高于对照组和DMSO组（P<0.05）,与12h暴露组相比,24h高剂量SHSY5Y细胞Versican m RNA的表达水平升高（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。2.MEHP暴露可调控迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、Vimentin、HIF-1α和Versican的表达,促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。3.MEHP暴露可能通过上调趋化因子VEGF、PDGF和TGF-β1的分泌,增强SH-SY5Y细胞的迁移能力。第三部分 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响目的:明确MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响,探讨Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖和迁移以及相关基因表达的关系。方法:实验分组与染毒同第一部分。实时荧光定量PCR方法检测细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平;western blot方法检测细胞Notch信号通路基因的蛋白表达水平。采用Pearson相关分析检验Notch信号通路蛋白表达与SH-SY5Y细胞增殖、迁移及其相关蛋白的相关性。结果:1.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Dll-1和Jagged-2 m RNA表达水平,降低Dll-4 m RNA表达水平（P<0.05）。2.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3和Jagged-2蛋白表达水平,降低Dll-4蛋白表达水平（P<0.05）。3.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4等蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。4.MEHP暴露12h和24h后,细胞周期关键蛋白CDK4表达水平与Dll-1蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Cyclin D1和C-MYC蛋白表达水平与Notch-1、Notch-2、Notch-4、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。MEHP暴露12h和24h后,凋亡相关蛋白Bax的表达水平与Notch-1、Notch-4和Dll-4蛋白表达水平显着相关,Bcl-2的表达水平与Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。5.MEHP暴露12h和24h后,SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力与Notch-1、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。6.MEHP暴露12h和24h后,细胞迁移相关蛋白E-Cadherin表达水平与Notch-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;N-Cadherin蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;SNAIL蛋白表达水平与Notch-4、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Vimentin和HIF-1α蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;Versican蛋白表达水平与Notch-1、Notch-4和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。7.MEHP暴露12h和24h后,趋化因子VEGF的表达水平与Notch-2和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;PDGF的表达水平与Notch-1、Notch-4、Dll-1和Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;TGF-β1的表达水平与Notch-3和Dll-4蛋白表达水平显着相关（P<0.05）;CXCL-8的表达水平与Jagged-2蛋白表达水平显着相关（P<0.05）。结论:1.MEHP暴露可上调Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-2的蛋白表达水平,下调Dll-4的蛋白表达水平。2.MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞的增殖和迁移与Notch通路蛋白表达密切相关。3.Notch信号通路可能通过调节细胞增殖和迁移关键基因的表达在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能通过调节细胞趋化因子的分泌在MEHP促进SHSY5Y细胞迁移中发挥作用。第四部分 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制目的:明确Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制。方法:采用DAPT抑制Notch信号通路表达,western blot方法检测Hes-1蛋白表达水平,检测Notch信号通路的抑制效率。暴露剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、DAPT组（50μM DAPT）、MEHP组（250μM MEHP）和MEHP+DAPT组（50μM DAPT+250μM MEHP）,暴露时间为24h。Western blot方法检测细胞Notch信号通路抑制后细胞增殖和迁移相关蛋白表达水平,其余实验方法同第一部分。数据处理与分析方法同第一部分。结果:1.SH-SY5Y细胞DAPT暴露后24h后,各剂量组（0、5、10、25、50、100μM DAPT）细胞存活率无明显变化（P>0.05）;经50μM DAPT处理的SH-SY5Y细胞内Hes-1蛋白表达水平显着降低（P<0.05）,Notch信号通路被有效抑制。2.DAPT可显着逆转MEHP所致SH-SY5Y细胞S期细胞数量增多。3.细胞凋亡结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞凋亡水平显着降低（P<0.05）。4.细胞迁移情况结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞迁移距离显着增加（P<0.05）;与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞迁移距离降低,差异无统计学意义（P>0.05）。5.细胞侵袭结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞侵袭水平显着增加（P<0.05）,与MEHP组相比,DAPT+MEHP组细胞侵袭水平降低,差异无统计学意义（P>0.05）。6.趋化因子结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8水平显着增加（P<0.05）;且DAPT+MEHP组细胞VEGF和TGF-β1水平显着低于MEHP组（P<0.05）。7.细胞周期和凋亡相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP组细胞C-MYC、Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组C-MYC、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。8.细胞迁移相关蛋白结果显示,MEHP组和DAPT+MEHP细胞Vimentin、SNAIL、HIF-1α和Versican蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;MEHP组和DAPT+MEHP组细胞E-Cadherin蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;DAPT+MEHP组HIF-1α和N-Cadherin蛋白表达水平显着低于MEHP组（P<0.05）。结论:1.Notch信号通路能在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中起正向调控作用。2.Notch信号通路可能通过调节细胞周期关键蛋白Cyclin D1、C-MYC,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖中发挥作用。3.Notch信号通路可能通过调节细胞迁移关键蛋白N-Cadherin的表达在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。4.Notch信号通路可能影响肿瘤细胞趋化因子VEGF和TGF-β1的分泌在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。
许召君,陈小彬,才保加,王成,乔文杰,刘光照,王鑫乐,刘韬,马晓明[3]（2021）在《全反式维甲酸与肝脏疾病的关系及其分子机制研究进展》文中研究指明全反式维甲酸（ATRA）也叫做视黄酸、维生素甲酸,是维生素A主要的生物活性形式,迄今为止ATRA在急性早幼粒细胞白血病（APL）中的应用已超过20年,并仍为APL治疗的标准方案。随着研究的不断深入,ATRA被广泛应用于甲状腺癌、肺癌、胃癌、卡波西氏肉瘤、卵巢癌、膀胱癌、神经母细胞瘤,等肿瘤的治疗中,且正逐步延伸至更多肿瘤的分化治疗。ATRA通过与核维甲酸受体（RAR）或维甲类X受体（RXR）结合并作用于维甲酸反应原件（RARE）从而调节基因的表达,在维持细胞稳态、调节细胞周期、信号转导、转录和翻译、调控肿瘤细胞的生长并促使其凋亡等发面发挥着重要的作用。肝脏是维生素A代谢的主要场所,相关研究显示,ATRA可通过调控相关蛋白（包括chemerin、信号蛋白Smad2/3、IGFBP-3等）以及遗传物质的表达,广泛参与肝炎、肝纤维化以及肝细胞癌的增殖、侵袭、凋亡等生物学过程。此外,ATRA可通过上调chemerin的表达来促进非酒精性脂肪性肝病的进展。肝星状细胞（HSC）也称为窦周细胞,是参与肝纤维化的主要细胞类型,当肝脏受损时,HSC可以转变为激活状态,活化的HSC通过分泌I型胶原蛋白（COL1α1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,导致肝纤维化,而ATRA的活性形式维生素A可逆转HSC的激活和肝纤维化。一方面,Wnt信号通路通过激活HSC参与肝纤维化的形成,而ATRA可通过诱导RORα磷酸化,抑制Wnt/β-catenin的信号传递从而抑制肝纤维化的发生;另一方面,ATRA通过抑制TGF-β1/Smad信号通路的表达,从而发挥其抗肝纤维化作用。本文从多个途径阐述了ATRA抑制肝癌细胞的增殖并诱导其发生凋亡的机理,其中包括ATRA抑制Bcl-2和Bcl-x蛋白的表达从而诱导细胞发生凋亡的一系列过程,或直接充当诱导分化剂,诱导肝癌细胞发生凋亡的过程。此外,ATRA可通过调控相关遗传物质的表达来调节肝癌细胞的增值,其中包括通过抑制胰岛素样生长因子和促进维甲酸诱导基因1甲基化来抑制肝细胞癌的增值等。ATRA在肝癌中的应用是近几年才被初步认识的,目前,关于ATRA与肝脏疾病的关系尚无系统的认识,在肝癌中的具体调控机制有待进一步研究。充分认识ATRA与肝脏疾病的关系及其涉及的相关分子机制,可为肝病（非酒精性脂肪性肝病、肝纤维化、肝细胞癌等疾病）的临床诊疗提供新的策略和方向。
吴杰连[4]（2021）在《p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究》文中认为贝类是水生态系统的初级消费者,在底栖动物中占优势。蓝藻水华产生的微囊藻毒素严重影响了贝类的生存,贝类可以通过直接的摄食活动将MC快速地富集在体内通过产生活性氧簇引起贝类机体氧化系统失衡,以致细胞损伤。选择性自噬和Keap1-Nrf2通路是主要的抗氧化应激途径,氧化剂可通过多条信号途径诱导细胞产生自噬和激活Keap1-Nrf2途径以缓解氧化损伤。Keap1-Nrf2的激活途径分为经典途径和非经典途径。在应激条件下,Keap1构象发生改变,以致Nrf2入核与小Maf形成异源二聚体,诱导Nrf2靶标调控区的抗氧化酶功能,从而保护细胞和组织免受氧化损伤,这是Keap1-Nrf2激活的经典途径。P62是选择性自噬衔接蛋白,通过与泛素蛋白结合穿梭至蛋白酶体或溶酶体,参与泛素-蛋白酶体和自噬溶酶体的蛋白质降解,其表达水平通常与自噬成反比。哺乳动物p62在氧化应激中充当协调自噬和Keap1-Nrf2信号通路的细胞整合点,通过形成p62/Keap1-Nrf2正反馈回路介导细胞自噬上调抗氧化反应元件ARE抗氧化酶和解毒酶来保护细胞免受损伤,此途径被称为Keap1-Nrf2激活的非经典途径。本文以暴露在MC环境下的褶纹冠蚌为研究对象,对褶纹冠蚌p62进行鉴定与功能分析,阐明p62与自噬的关联,以及p62与Keap1-Nrf2通路的调控关系,探讨贝类p62/Keap1-Nrf2途径消减贝类微囊藻毒素引起的应激反应。1、Western Blot、免疫组化及qRT-PCR实验发现MC胁迫蚌24 h,Cp Nrf2蛋白的表达和mRNA转录水平显着增强,Cp Nrf2敲降后,在MC诱导24 h其mRNA和蛋白表达均显着降低;CpKeap1a敲降后MC诱导96 h,Cp Nrf2 mRNA和蛋白表达显着增强。MC促进GOT、GPT及相关抗氧化酶活显着上调,进而通过激活抗氧化酶减轻蚌的肝胰腺受损。荧光素酶报告基因实验表明Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cp NQO1基因启动子的活性上调;在细胞毒性承受范围内,MC以剂量依赖性上调Cp NQO1基因启动子的活性,并且MC促进Cp Nrf2上调Cp NQO1基因启动子的活性。2、构建pGEX 4T-1-CpKeap1a、pET30a-Keap1b和pET-32a-Nrf2表达载体,诱导蛋白表达,纯化GST-CpKeap1a和HIS-Cp Keap1b蛋白,其浓度分别为0.338mg/m L和0.22 mg/m L。GST-pulldown结果表明CpKeap1a与Cp Keap1b形成异源二聚体。构建FLag-CpKeap1a、FLag-Cp Keap1b、HA-CpKeap1a、HA-Cp Keap1b、HA-Cp Nrf2、FLag-Cp Nrf2等表达载体,免疫共沉淀显示CpKeap1a与Cp Keap1b可以形成同源和异源二聚体,Cp Nrf2可以与CpKeap1a和Cp Keap1b相互结合。3、从构建的褶纹冠蚌血细胞转录组文库中筛选p62、LC3、Bcl-2基因片段,克隆了Cpp62、CpLC3和CpBcl-2基因的c NDA序列全长。Cpp62 c DNA全长序列为2484 bp,其5’UTR序列为88 bp,3’UTR序列为1247 bp,ORF序列为1149 bp,编码382个氨基酸,其中包含高度保守的p62-PB1结构域（3-90aa）、ZZ链结构域（102-148）和UBA结构域,预测有LIR结构域而无KIR结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,质谱测定其分子量为42.485 k Da,理论等电点（PI）为5.98。CpLC3 c DNA序列全长为2151 bp,其5’UTR序列为64 bp,3’UTR序列为1721 bp,ORF框长度为366 bp,其编码121个氨基酸,包含一个高度保守Ub1＿ATG8＿MAP1LC3结构域。该蛋白含有一个poly（A）尾,其蛋白质分子量为14.10 k Da,PI为9.39。CpBcl-2 c DNA序列全长为760 bp,其5’UTR为93 bp,3’UTR为132 bp,ORF序列为535 bp,共编码177个氨基酸,其中包含高度保守的Bcl-2样superfamily结构域（44-145aa）,其分子量为20.17 k Da,PI为6.61。4、MC胁迫后,肝胰腺中Cpp62 mRNA的表达在24和48h明显上调,其在肾脏中的表达也均上调;CpKeap1a敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62在24,48和72 h的表达上调,促进肾脏Cpp62在72和96 h表达上调;Cp Nrf2敲降后,MC促进肝胰腺中Cpp62的表达在24、48和72h下调。Western Blot实验结果显示MC促进Cpp62的蛋白表达,褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径正向调控Cpp62蛋白的表达,与荧光定量PCR结果一致。结果表明MC可以激活褶纹冠蚌Keap1-Nrf2途径参与调控Cpp62 mRNA和蛋白的表达。5、克隆褶纹冠蚌p62基因启动子,分析其含有Nrf2、Maf G、Mafk和Nrf2-Maf G二聚体结合元件,并含有4个ARE元件。EMSA表明Cp Nrf2蛋白阻滞Cpp62-ARE迁移,荧光素酶报告基因显示Cp Nrf2以剂量依赖性促进Cpp62-ARE活性上调。但是MC抑制Cp Nrf2上调Cpp62启动子活性。Cpp62启动子ARE元件突变后,其活性被Cp Nrf2转录因子抑制。6、合成褶纹冠蚌p62双链干扰序列（Cpp62-ds RNA）,Cpp62-ds RNA干扰效率在24和48 h分别为64.7%和58.6%,表明Cpp62-ds RNA具有干扰效率,且Cp Nrf2和Cp NQO1的表达在Cpp62-ds RNA处理组显着下调。荧光素酶报告基因实验发现Cpp62可以呈Cp Nrf2浓度依赖性促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性上调。但是,MC抑制Cpp62促进Cpp62启动子的活性上调,且Cpp62抑制ARE元件突变的Cpp62启动子活性。7、Cpp62与CpKeap1a体外不形成二聚体,双荧光素酶报告显示CpKeap1a和Cp Keap1b均不影响Cpp62促进Cp NQO1和Cpp62基因启动子的活性。8、构建自噬抑制剂和自噬激活剂贝类模型,采用qRT-PCR和Western Blot检测发现自噬的动态变化影响了Cpp62的表达;TEM观察MC诱导褶纹冠蚌产生轻度自噬,并且发现Cpp62-ds RNA中自噬溶酶体数量减少,自噬小体消失,表明褶纹冠蚌Cpp62可能介导自噬小体的形成,且贝类存在Cpp62依赖型自噬。9、CpLC3在检测的组织中均有表达,自噬激活剂诱发蚌产生自噬时上调CpLC3的表达,并且MC引起的氧化应激促进CpLC3 mRNA的表达水平显着上调;免疫双荧光定位发现MC促进CpLC3蛋白分别与Cpp62、CpKeap1a蛋白在细胞中发生重叠;免疫共沉淀实验表明CpLC3分别与CpKeap1a、Cp Keap1b和Cpp62结合。结果表明蚌发生自噬和氧化应激均影响CpLC3基因的转录,并促进蚌内p62-Keap1a-LC3聚合体的形成。10、qRT-PCR检测发现自噬缺陷时,CpBcl-2 mRNA的表达水平呈显着性下降;反之,自噬发生时其表达相反。Tunel结果显示3-MA促进细胞发生凋亡,Rap抑制细胞凋亡,并且Cpp62-ds RNA组织中的凋亡细胞数量高于对照组。结果表明MC诱发蚌产生的细胞自噬可以抑制细胞凋亡,揭示褶纹冠蚌p62可以正向调控细胞凋亡。
王延蛟[5]（2021）在《mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响》文中研究说明目的:全球肝癌发病率和死亡率居高不下,每年约有841,000新发病例和782,000死亡病例,其中约50%来自中国,严重威胁到人类的健康。寻找肝癌潜在发病机制及诱发因素,能早发现、早治疗的任务迫在眉睫。DEN（Diethylnitrosamine,二乙基亚硝胺）诱发癌变过程与人肝癌的过程非常相似,是最广泛应用的肝癌模型。而肝癌的发生和发展是一个复杂的多因素过程,涉及细胞和分子水平的异常变化,关于肝癌发病机制的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因表达调控等方面。基因芯片能对基因表达的组织特异性、病变特异性进行综合的分析和判断,并迅速将基因与疾病联系起来。mi RNA虽然与肝癌的发生密切相关,但其无明显的细胞特异性,而存在于生殖细胞piwi蛋白具有组织特异性,近年被发现也存在于癌细胞,与piwi蛋白结合的piRNA（Piwi-interacting RNA）在维持DNA完整、抑制转录、翻译等均有重要作用,但关于piRNA/piwi与肿瘤发生的相关研究还在初始阶段。肝癌化疗失败的主要原因是多重耐药性（multi-drug resistance,MDR）,研究表明紫草素具有抗癌作用,不易产生耐药性且副作用小,但具体机制并不清楚。综上所述,本研究以DEN诱导建立的大鼠肝癌模型作为研究对象,测定血清肝癌标志物、免疫、内分泌及相关指标,寻找肝组织差异表达的mRNA和piRNA及相关蛋白,揭示以上因素与肝癌发生发展的关系;以肝癌细胞CBRH-7919为研究对象,检测紫草素对其增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,为探索肝癌发生的分子机制及临床用药提供理论支持。方法:1)选取40只6周龄雄性健康Wistar大鼠,重量在150克左右,分为肝癌模型组（NC）和正常对照组（Md）,其中,肝癌模型组自由饮用浓度为0.1 mg/m L DEN的无菌水,每24小时更换一次,20周后停药（9-12周断药用水代替）,观察肝脏组织病理形态学的改变以及细胞超微结构的变化;ELISA法检测外周血AFP、ASMA、HSP、IL-1、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT等指标的改变;利用芯片技术检测组间肝组织mRNA的差异表达并筛选候选基因,采用RT-q PCR、免疫组织化学、Western-blot检测肝癌组织中候选基因的mRNA和蛋白质的表达水平;2)利用二代测序法检测肝组织差异表达的piRNA;利用motif短序列模式比配算法辨认piRNA临近调控区域加工区域特征进行富集度解析和聚类,结合piRNA定位进行功能基因的分布总结,利用RT-q PCR对piRNA、mi RNA进行定量,通过免疫组化和Western-blot检测肝组织中piwil2、piwil4等基因蛋白质的表达水平,利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除CBRH-7919细胞中的piwil4基因,利用CCK-8、流式细胞术、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移的变化;3)用MTT、流式细胞术、划痕实验以及transwell小室法观察紫草素作用于CBRH-7919细胞后的细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等变化,通过Western Blot法检测紫草素作用CBRH-7919细胞后STAT3、Cyclin D1、piwil4、Bcl-xl蛋白。结果:1)利用改变饮水方式建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,成癌率为75%,并避免了实验动物中途死亡,肝癌组肝脏表面粗糙度增加,假小叶、增生灶和大量癌结节形成。与正常对照组比较,肝癌模型组血清AFP明显升高,差异显着（P<0.01）;组间血清ASMA无统计学差异,肝癌模型组与正常对照组血清HSP差异显着（P<0.01）。血清免疫学指标IL-1、IL-6水平降低而TNF-α水平升高（P<0.05）,内分泌指标ACTH和CORT的水平降低。mRNA芯片结果显示,31042个mRNA中表达上调的有1639个,表达下调的有360个,应用RT-q PCR法检测结果发现,STAT3和Cyclin D1基因的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）;Igfals、G6PC基因的mRNA表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;免疫组织化学结果显示,正常对照组中STAT3和Cyclin D1蛋白表达量少,肝癌模型组STAT3和Cyclin D1蛋白的高表达主要定位在细胞核。western-blot实验结果显示Igfals、G6PC以及Emp1蛋白表达水平下调,有统计学差异（P<0.05）;2)总计发现符合piRNA序列特征的为27439个,mRNA芯片结果显示,与正常对照组相比发现,肝癌模型组中上调表达的piRNA有4个（P<0.05）,分别是piR-64745（piR-rno-51044）,piR-64265（piR-rno-50623）,piR-79437（piR-rno-48177）,piR-64744（piR-rno-51043）,表达下调的有2个（P<0.01）,分别是piR-64143（piR-rno-50518）和piR-64142（piR-rno-50517）。组间表达异常的piRNA靶基因涉及嘌呤嘧啶代谢、氨基酸降解、黏多糖合成、复制、DNA剪切与修复、RNA和蛋白质降解、MAPK信号通路、Ras信号通路众多途径,RT-q PCR显示,与正常对照组比较,肝癌模型肝组织的piR-79437表达增加（P<0.01）、piR-64143表达降低（P<0.01）,肝癌模型组血清中mi R-133b升高（P<0.05）;在肝癌模型肝脏中Piwil2、Piwil4的蛋白高表达（P<0.01）,Piwil4基因敲除后,与肝癌正常对照组和空载组相比,KO组细胞的增殖活性降低（P<0.05）,KO组细胞凋亡率明显增加（P<0.05）,Piwil4-/-细胞中STAT3、Cyclin D1、Bcl-x L蛋白表达水平均下调,差异显着（P<0.05）;3)紫草素的IC50是11.97μM,作用细胞的浓度确定为5、10、15μM,细胞的存活率随药物浓度的增加而发生梯度变化,具有统计学差异（P<0.05）,FCM结果显示,紫草素浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时候,凋亡细胞数量分别为5.50±0.28%、7.88±0.51%、16.05±1.23%、26.88±0.22%,细胞凋亡率逐步上升,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）,划痕实验结果显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应的迁移率分别为52.10±6.12%、47.01±9.01%、34.11±7.18%、13.98±4.52%,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异（P<0.05）;transwell实验显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应穿过小室膜的细胞数分别为482.33±55.54%、423.00±35.51%、386.33±68.37%、288.67±50.74%,呈现出浓度依赖性,侵袭能力下降,具有统计学差异（P<0.05）;用15μM紫草素处理CBRH-7919细胞48小时后,STAT3、Cyclin D1蛋白表达下调（P<0.05）,piwil4和Bcl-x L与正常对照组无明显变化。结论:1)使用0.1mg/ml的DEN饮用水诱导大鼠肝癌模型20周（9-12周停药）,成癌率为75%（15/20）,效果良好,观察肝脏组织HE病理结果发现肝癌发生,且血清AFP、HSP均升高,是一种较理想的研究肝癌发生发展的大鼠模型。作者认为免疫相关IL-1、IL-6、TNF-α水平的升高,内分泌相关ACTH和CORT水平的降低,提示肝癌模型中免疫和内分泌功能至少在一定程度上发生紊乱;2)模型肝脏中,STAT3,Cyclin D1等癌基因的过表达和促凋亡基因EMP1低表达共同导致细胞的持续增殖,肝癌模型的G6PC表达的降低便于糖异生的中间产物用于肝癌细胞增殖所需能量的供应和物质的生物合成;3)本研究发现piR-79437、piR-64143的异常表达可能与HCC存在关联,在肝癌的发生和发展中起作用,血清mi R-133b可能是肝癌的潜在标志物,PIWIL2和PIWIL4在肝癌模型组的高表达,提示具有促癌作用,PIWIL4基因敲除细胞中STAT3,cyclin D1和Bcl-xl的表达水平低于对照组,表明PIWIL4基因可能通过作用于STAT3/cyclin D1促进肝癌细胞的增殖,通过STAT3/Bcl-x L抑制其凋亡;4)紫草素使STAT3和Cyclin D1蛋白表达下调,提示其对肝癌细胞生长有抑制作用,同时,紫草素可以促进肝癌细胞的凋亡,抑制其迁移及侵袭,呈现浓度依赖性的关系,但其作用细胞后的piwil4和Bcl-x L的表达水平没有变化,提示紫草素不通过Bcl-x L影响细胞凋亡,具体通过什么途径促进肝癌细胞的凋亡,还需进一步研究。
孙晨[6]（2021）在《HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究》文中提出研究目的:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球第六大恶性肿瘤,死亡率排在第三位,给人民健康造成极大威胁[1]。射频消融（Radiofrequency ablation,RFA）作为一种微创的介入治疗技术,对于直径小于3 cm的HCC具有根治性治疗作用,总体疗效也与外科切除术相当,且并发症发生率更低[3]。然而,由于消融能量在肿瘤中的分布不均,对肿瘤边缘癌细胞杀伤效率不高,最后可能导致局部复发,甚至增强癌细胞侵袭性最后导致预后不良[4]。本研究通过构建肝癌体内及体外不全热消融（incomplete RFA,iRFA）模型,进一步探究iRFA后肝癌细胞存活的分子机制;明确热休克蛋白 90（Heat shock protein 90,HSP90）以及 STAT3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3）在热处理条件下抵抗细胞凋亡的内在机制;同时评估新型口服HSP90抑制剂XL888增强iRFA条件下肝癌细胞的热敏感性,为射频联合小分子抑制剂治疗肝癌提供新方向。研究方法:1、采用CCK8检测热处理及药物处理后细胞活性情况;2、集落形成实验检测热处理及药物对细胞增殖的影响;3、应用Hoechst 33258检测药物与热处理后细胞核变化情况;4、蛋白免疫印迹技术（Western blotting）检测目标蛋白的表达;5、构建裸鼠体内iRFA模型用于后续实验验证;6、采用RT-qPCR方法检测目的基因的mRNA水平表达;7、免疫共聚焦检测目标蛋白细胞内表达及定位;8、采用cDNA质粒转染过表达目标蛋白;9、采用免疫共沉淀法分析蛋白质复合物的形成;10、免疫组化检测异体肿瘤组织内蛋白表达情况;结果:1.首先评估HSP90与STAT3在肝癌临床组织中的相关性。TCGA数据库临床肝癌mRNA数据分析显示,HSP90与STAT3二者相关系数为0.32,存在相关性;2.肝癌组织免疫组化结果提示HSP90及STAT3肿瘤内协同表达增高。其中在高表达HSP90的标本内STAT3表达也上调,且二者与肿瘤分期、高AFP密切相关;3.构建体外亚致死热处理模型。应用CCK8检测不同温度及时间梯度处理后细胞活性情况,在48℃及以上温度条件下,细胞活性明显受到抑制,而在46℃及以下温度时,细胞活性几乎未受影响,同理选取10min持续处理时间作为后续亚致死处理条件;4.亚致死热处理条件下HSP90与STAT3互作增强。IP结果证实生理条件下HSP90与STAT3存在相互结合,而热处理增加了二者之间的结合作用,并且Western blotting结果提示STAT3蛋白表达增高,同时其下游重要抗凋亡蛋白Mcl-1（myeloidcell lekemia-1）及Bcl-xL表达也有所升高,并且在mRNA水平也证实二者表达增高;5.热处理条件下STAT3活化情况增多并促进p-STAT3入核。提取核蛋白行Western blotting结果显示热处理诱导p-STAT3入核增加,并发挥转录因子活性;6.热处理条件下HSP90与STAT3的结合在体内发挥抗凋亡活性。我们应用裸鼠皮下成瘤方式,成功在小鼠体内移植肝癌细胞系,待肿瘤最大径长至0.8cm时,应用有效射频直径1cm的射频针穿刺至小鼠体内,按照5W、60s的条件进行不全射频消融,随后剖开肿瘤可见肿瘤内部凝固型坏死周围过渡带,并且小鼠存活良好无感染等并发症,显示成功构建体内不全射频模型;7.不全RFA刺激肿瘤向恶性表型转化。每周测量肿瘤最大径及垂直横径,结果显示在iRFA早期,肿瘤体积较对照组明显缩小,但随着喂养时间延长,肿瘤生长速度明显加快,虽然至喂养结束时体积仍小于对照组,但是增长速率已经明显增快,免疫组化结果显示Ki-67在iRFA表达增多;8.XL888对肝癌细胞杀伤呈现浓度依赖及时间依赖性。首先在体外应用不同浓度XL888及不同时间处理肝癌细胞后,CCK8检测细胞活性变化情况,结果提示随着XL888浓度升高及时间延长,对细胞活性抑制逐渐明显;9.热处理联合XL888促进肝癌细胞凋亡。在选取100nm作为处理浓度后,CCK8结果提示联合处理细胞活性较单独加药及热处理组明显减低,并且随着XL888浓度升高,联合处理组杀伤肿瘤作用更加明显,Hoechst 33258染色结果提示联合处理可诱导细胞核固缩,提示XL888可增强肝癌细胞热敏感性;10.XL888联合热处理通过活化Bcl-2通路及诱导caspase3活化促进肝癌细胞凋亡。Western blotting结果提示联合处理条件下BCL-2家族重要成员Mcl-1及Bcl-xL变化显着,同时caspase3及PARP明显活化;11.XL888通过破坏HSP90-STAT3相互结合从而促进肝癌细胞的热敏感性。IP结果提示XL888处理后HSP90与STAT3结合明显减少,同时蛋白水平检测发现STAT3及p-STAT3活性明显减低;12.联合处理抑制p-STAT3入核。提取核蛋白并检测p-STAT3表达发现其核内表达明显减少,且下游靶蛋白Mcl-1及Bcl-xL表达减低;13.XL888联合热处理通过STAT3发挥促凋亡作用。在联合处理的肝癌细胞内转染STAT3 cDNA后,CCK8检测发现细胞活性较联合处理组有所恢复,同时凋亡相关蛋白表达相应减少;14.XL888在体内增强iRFA杀伤肿瘤作用。体外构建不全RFA模型同时联合XL888灌胃处理后,定期测量小鼠肿瘤直径并于21天后处死小鼠,结果发现小鼠肿瘤体积及重量较对照组及单独处理组明显减少;15.XL888对小鼠正常肝肾组织无明显损伤。在安全性方面,分离得到小鼠肝肾组织行免疫组化,HE染色结果可见所有加药处理组小鼠未见明显组织损伤及坏死。结论:肝癌组织内HSP90与STAT3表达存在相关性,并且在肝癌细胞系内二者存在直接结合作用;此外,热处理可增强HSP90与STAT3的直接结合作用,并且这种结合作用可诱导STAT3活化并入核,增加STAT3下游抗凋亡蛋白Mcl-1及Bcl-xL的表达,从而在热激条件下抑制肝癌细胞凋亡;而联合应用新型HSP90抑制剂XL888可破坏HSP90-STAT3复合物形成,增强Bcl-2家族凋亡蛋白表达,活化caspase3及PARP蛋白,从而增加肝癌细胞的热敏感性。
李永红[7]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中提出研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
姚宏伟[8]（2020）在《白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究》文中研究说明肾细胞癌作为肾癌最常见的亚型,对放疗、化疗均不敏感,早期局限性肾细胞癌以手术切除为主。30%的患者被确诊为肾细胞癌时已经发生转移,并且一部分患者术后仍会发生转移,转移性肾细胞癌患者预后极差。目前分子靶向药物治疗肾细胞癌取得了一定的进展,但疗效并不令人满意,因此发展新的药物具有重要的临床意义。自然化合物是新的药物发展的宝贵资源,白藜芦醇（Resveratrol,Res）作为一种天然类化合物,分布于多种植物中。已有的研究显示Res能够通过引起细胞周期阻滞,诱导凋亡,抑制侵袭、转移等多种机制,对多种类型的肿瘤细胞体外具有抑制作用,并且在体内同样具有抗肿瘤活性。目前Res在肾细胞癌中的相关研究较少,并且由于Res复杂的药理活性,其作用机制尚不清楚。本研究观察Res对肾细胞癌的作用,并探讨相关的作用机制,为发展新的药物治疗肾细胞癌提供理论基础。第一部分白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用背景:研究显示Res对多种类型的肿瘤具有抑制作用,但在肾细胞癌中的作用目前研究较少,需进一步阐释。目的:探讨Res对人肾细胞癌的作用。方法:给予Res处理人肾细胞癌786-O细胞,使用CCK8检测细胞活性;流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期;细胞划痕及transwell实验分析迁移及侵袭能力;Western blot检测MMP2（基质金属蛋白酶2）及MMP9（基质金属蛋白酶9）蛋白的表达;建立786-O细胞裸鼠移植肿瘤模型,观察Res体内对肾细胞癌生长的作用。结果:Res呈浓度及时间关系减少786-O细胞的活性。给予48 h的处理,20μM及40μM浓度的Res诱导细胞凋亡,10μM的Res对凋亡无明显影响,但引起S期周期阻滞。Res抑制786-O细胞的迁移及侵袭能力,并且下调MMP2及MMP9蛋白的表达。Res在裸鼠体内抑制移植肿瘤的生长,减少肿瘤的体积及重量。结论:Res在体外及体内对人肾细胞癌均具有抗肿瘤作用。第二部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:细胞凋亡是一个主动过程,涉及一系列信号因子的激活、表达以及调控。积累的证据证实Res能诱导肿瘤细胞的凋亡,但由于其复杂的药理活性,诱导凋亡的具体分子机制仍需进一步的阐释。目的:体外探讨Res诱导786-O细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞技术检测线粒体膜电位、凋亡、caspase3活性及ROS（活性氧）水平;免疫荧光检测ROS及细胞色素C;Western blot分析GAPDH、COXⅣ、细胞色素C、PARP、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38蛋白的表达。结果:Res下调786-O细胞的线粒体膜电位水平,促进细胞色素C的胞浆释放,上调caspase3活性,引起PARP蛋白的裂解。Z-VAD-FMK,一个pan-caspase抑制剂,显着抑制Res诱导的凋亡。进一步的实验显示Res促进786-O细胞ROS的产生,抗氧化剂NAC（N-乙酰半胱氨酸）能够改善线粒体膜电位,下调caspase3活性,减少PARP蛋白的裂解,抑制Res诱导的凋亡。最后我们发现Res通过ROS抑制ERK（细胞外信号调节激酶）,激活JNK（c-jun氨基末端激酶）及p38（p38丝裂原活化蛋白激酶）,SP600125（JNK抑制剂）对凋亡无明显影响,SB203580（p38抑制剂）减少Res诱导的786-O细胞凋亡。结论:1、Res引起线粒体损伤,激活caspase3导致786-O细胞凋亡。2、Res上调786-O细胞的ROS水平,升高的ROS促进凋亡。3、Res通过ROS激活p38,激活的p38促进Res诱导的786-O细胞凋亡。第三部分自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:自噬作为进化过程中的保守机制,普遍存在于各种生物细胞中。当细胞受到各种压力,能够激活自噬,维持内环境的稳态,有利于细胞在压力环境下的存活;但在一些情况下,极度的自噬能导致损伤的进一步加重,促进细胞的死亡。研究报道Res能通过多种途径影响自噬,发挥促存活或促死亡的作用,但在肾细胞癌中的作用并不清楚。目的:体外探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。方法:流式细胞技术及免疫荧光检测Cyto-ID荧光分析细胞自噬体形成;western blot检测GAPDH、LC3BII、P62、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、BCL2、p-BCL2、Becline1以及PARP蛋白的表达;流式细胞技术检测细胞凋亡;si RNA干扰技术敲低Beclin1蛋白的表达,探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。结果:Res上调786-O细胞自噬水平;Res诱导的自噬需要ROS,抗氧化剂NAC减少Res上调的自噬;Res对p-AMPK及p-S6蛋白的表达没有影响,JNK阻滞剂SP600125下调自噬,相反p38阻滞剂SB203580进一步促进Res诱导的自噬;自噬阻滞剂CQ（氯喹）进一步促进Res诱导的凋亡,上调PARP蛋白的裂解,并且Beclin1si RNA上调Res引起的PARP蛋白的裂解。结论:1、Res在786-O细胞中激活自噬。2、Res通过ROS-JNK路径激活自噬。3、自噬抑制Res诱导的786-O细胞凋亡。第四部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老背景:细胞衰老是指细胞从生长状态进入不可逆转的生长停滞状态。在一定条件下,如化疗药物、电离辐射以及氧化损伤等因素可以诱导肿瘤细胞进入衰老。研究证实Res在体外能够诱导肿瘤细胞进入衰老,抑制肿瘤细胞的生长增殖,但是否能够引起肾细胞癌细胞的衰老迄今未见相关报道。目的:体外探讨Res对肾细胞癌786-O细胞衰老的影响。方法:流式细胞技术检测细胞周期,凋亡及ROS水平;免疫荧光分析p-H2AX;EDU增殖实验检测细胞增殖;SA-β-Gal染色检测细胞衰老;western blot检测GAPDH、p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1、p38、p-p38及p21蛋白的表达水平;荧光定量PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达,ELISA分析IL-6、IL-8蛋白的分泌水平。结果:给予10μM的Res持续处理786-O细胞4 d,Res增加p-H2AX阳性的细胞,上调p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,引起持续的S期周期阻滞,减少EDU阳性的细胞,增加SA-β-Gal染色阳性的细胞,诱导786-O细胞衰老,未引起明显细胞凋亡。Res诱导786-O细胞衰老需要上调的ROS,NAC降低Res上调的p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,恢复细胞增殖,下调SA-β-Gal染色阳性的细胞。进一步来说,衰老的细胞上调IL-6、IL-8 mRNA以及蛋白分泌水平（衰老相关的分泌表型,SASP）,上调的IL-6、IL-8mRNA及蛋白分泌需要ROS激活的p38活性,SB203580（p38阻滞剂）抑制IL-6、IL-8 mRNA及蛋白分泌水平。结论:1、Res在体外能够诱导786-O细胞衰老。2、Res上调的ROS促进786-O细胞衰老。3、Res通过ROS-p38路径促进SASP。
罗艺[9]（2020）在《基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制》文中指出目的:肝癌是全球最常见的癌症之一,目前虽然肝癌的诊断和治疗取得了很大的进展,但复发率仍然很高,总体生存率较低。因此,迫切需要开发新的治疗肝癌的药物,降低肝癌的死亡率,改善预后。隐丹参酮（Cryptotanshinone,CPT）是从中药丹参中分离得到的一种天然脂溶性二萜类化合物,已被证明对多种癌症具有治疗作用。然而,隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制仍不明确。因此,本研究旨在通过将网络药理学和实验验证相结合探讨隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制。方法:在本研究中,首先我们采用网络药理学的方法,通过对药物-药物靶点网络、蛋白与蛋白互作网络、靶点-功能网络以及通路富集的分析,预测隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其可能的相关分子机制。其次,在体外,采用MTT实验和平板克隆实验检测隐丹参酮对肝癌Huh7细胞的抗增殖作用和细胞毒性。采用流式细胞术实验观察隐丹参酮对肝癌Huh7细胞凋亡的影响。采用透射电镜和共聚焦显微镜观察隐丹参酮对肝癌Huh7细胞自噬的影响。通过使用自噬抑制剂氯喹和3-MA,采用流式细胞术实验、Western blot实验和MTT实验探讨隐丹参酮诱导的自噬和凋亡之间的关系。通过Western blot实验检测凋亡和自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路上的蛋白表达水平。最后,在体内通过构建裸鼠异位皮下移植瘤模型,探讨隐丹参酮对肝癌Huh7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,并通过Western blot实验检测凋亡和自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路上的蛋白表达水平,通过TUNEL实验检测细胞凋亡。结果:首先,通过利用PubChem、STITCH、HIT、TCMSP和PharmMapper数据库,我们总共获取隐丹参酮靶点296个。通过利用GeneCards、OMIM、Liverromme和OncoDB.HCC数据库,我们总共获取肝癌相关靶点10363个。通过对隐丹参酮-隐丹参酮靶点网络的分析,我们发现隐丹参酮可以通过多个靶点作治疗疾病,如AKT1、PIK3R1、CASP3、GSK3B、HSP90AA1、ESR1、TNF、IL12B。通过对蛋白与蛋白互作靶点网络的分析,我们发现 AKT1、ALB、MAPK1、TNF、EGFR、SRC、STAT3、HRAS、ESR1、HSP90AA1 这些靶点可能在隐丹参酮治疗肝癌中发挥关键作用。通过对隐丹参酮靶点-功能网络的分析,我们发现隐丹参酮可能通过血管生成、自噬、免疫、炎症、细胞增殖、细胞周期、凋亡过程、细胞迁移和侵袭和代谢过程这9个生物学功能模块发挥治疗肝癌的作用。通过对通路富集的分析,我们发现隐丹参酮可能通过FoxO信号通路、Prolactin信号通路、Thyroid hormone信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、HIF-1信号通路、T cell receptor信号通路、ErbB信号通路和VEGF信号通路等信号通路发挥治疗肝癌的作用。其次,体外实验结果表明,隐丹参酮对肝癌Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用,并且我们发现隐丹参酮能够诱导肝癌Huh7细胞凋亡和自噬。运用自噬抑制剂氯喹和3-MA,我们发现抑制隐丹参酮诱导的自噬能够促进隐丹参酮诱导的肝癌细胞凋亡,说明隐丹参酮诱导的自噬对肝癌Huh7细胞具有一定的保护作用。此外,通过使用PI3K激活剂IGF-I,我们发现隐丹参酮能够通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬。最后,体内实验结果表明,隐丹参酮能够抑制肝癌细胞Huh7裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:隐丹参酮能够诱导肝癌Huh7细胞发生凋亡和自噬,其机制可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的,这为今后隐丹参酮的进一步科学研究和运用于临床上治疗肝癌提供一定的参考价值。
王芝蕾[10]（2020）在《咖啡因协同促进5-氟尿嘧啶的抗肝癌作用及机制研究》文中研究说明【背景】原发性肝细胞癌是全球普遍存在的恶性肿瘤,因其起病急、诊断率低,手术治疗有极大的局限性。药物治疗是肝癌晚期患者治疗的主要手段,临床各项研究表明多药物的联合治疗对肝癌具有一定的疗效。5-氟尿嘧啶是一种经典的抗癌药物,然而临床应用发现其存在耐药性和细胞毒性等问题,使得其抗癌功效有限。近年来,5-FU（5-fluorouracil）与其他药物联合使用已被广泛用于各种癌症的临床治疗。咖啡因是一种结构明确,作用广泛的甲基黄嘌呤类精神药物,近年来越来越多的报道表明,咖啡因除了传统意义上的致兴奋作用,还能降低各类癌症的风险,如胶质母细胞瘤、结肠直肠癌、肝癌等。有研究表明,咖啡因联合顺铂及阿糖胞苷不仅能显着抑制裸鼠皮下成瘤模型中胰腺肿瘤的生长,还能增加顺铂对肝癌细胞的抑增殖和促凋亡作用,该实验证实咖啡因可以通过促进肿瘤对化疗药物的敏感性而改善患者的耐受性、延长生存期。以上研究为5-FU和咖啡因的新组合提供了理论依据。因此,我们研究5-FU和咖啡因联合应用协同抗肝癌作用和机制。【目的】探讨咖啡因和5-氟尿嘧啶联合应用的抗肝癌作用及分子机制。【研究方法】1.MTS实验检测咖啡因和5-FU单独处理对肝癌细胞增殖作用的影响。2.MTS实验检测咖啡因和5-FU联合用药OD值、计算联合指数CI值,采用平板克隆实验评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞增殖抑制的协同效应。3.采用TUNEL/DAPI染色法评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞凋亡的影响。4.采用Western Blot实验检测药物作用对肝癌细胞凋亡、周期相关蛋白表达的影响。5.采用Transwell实验观察咖啡因联合5-FU对肝癌细胞侵袭、迁移的影响。6.采用DCFH-DA（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate）流式细胞技术评价咖啡因联合5-FU对肝癌细胞活性氧（ROS,Reactive oxygen species）生成的影响。7.采用Western Blot实验方法评价咖啡因联合5-FU对MAPK（Mitogen-activat ed protein kinase）通路的影响。8.采用裸鼠皮下成瘤方法评价咖啡因联合5-FU对体内肝癌细胞增殖、凋亡作用的影响。【结果】1.咖啡因能抑制肝癌细胞SMMC-7721、Hep3B的活性,具有剂量依赖性,随着浓度增加,抑制增殖能力增强,其IC50分别为2.211mM、2.026mM。5-FU剂量依赖性地抑制肝癌细胞SMMC-7721、Hep3B的增殖作用,其IC50分别为135.2μM、158μM。2.咖啡因（0,0.5,1mM）和5-FU（0,25,50μM）联合应用后,能抑制肝癌细胞的增殖能力,联合组克隆形成率明显减少,联合指数CI值均<1,差异有统计学意义。选择联合应用抑制率约为50%且CI值<1的1mM咖啡因和25μM 5-FU联合应用进行后续研究。3.TUNEL/DAPI双染检测结果显示,咖啡因联合5-FU可明显诱导肝癌细胞的凋亡发生,差异有统计学意义。4.Western Blot实验结果显示咖啡因联合5-FU后凋亡蛋白明显高于对照组、单药组,并且能下调周期蛋白。5.Transwell实验结果显示咖啡因联合5-FU可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移,差异有统计学意义。6.咖啡因联合5-FU作用ROS生成明显高于对照组、单药组,差异有统计学意义。7.咖啡因联合5-FU可以影响MAPK信号通路蛋白。8.咖啡因与5-FU联合用药可抑制裸鼠皮下瘤的生长。【结论】1.咖啡因和5-FU联合使用抑制肝癌细胞的增殖作用具有剂量依赖性和时间依赖性。2.咖啡因与5-FU联合使用可通过抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡发挥协同抗肝癌作用。3.咖啡因与5-FU联合使用发挥协同抗癌作用可能与诱导ROS生成及影响MAPK信号通路有关。
二、肝细胞癌组织凋亡基因Bcl-X_L、Bcl-2的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞癌组织凋亡基因Bcl-X_L、Bcl-2的表达及意义（论文提纲范文）
（1）XPA通过PI3K/AKT/mTOR诱导自噬和凋亡抑制肝细胞癌的研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 XPA在肝细胞癌中的表达情况 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 XPA调控肝细胞癌自噬和凋亡的机制 |
| 前言 |
| 第一节 XPA抑制肝细胞癌增殖、侵袭和迁移 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 XPA激活肝细胞癌自噬,促进肝细胞癌细胞凋亡 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第三节 XPA通过调节 PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导肝细胞癌自噬 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 第三部分 建立肝细胞癌裸鼠皮下成瘤模型验证XPA调控肝细胞癌自噬和细胞凋亡的机制 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 XPA的生物学功能与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的研究成果及发表的论文 |
（2）Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 神经母细胞瘤概述 |
| 1.1.1 神经母细胞瘤的现状 |
| 1.1.2 神经母细胞瘤发病机制 |
| 1.1.3 神经母细胞瘤危险因素 |
| 1.2 DEHP与神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 DEHP概述 |
| 1.2.2 DEHP对神经母细胞瘤的影响 |
| 1.3 Notch信号通路与神经母细胞瘤 |
| 1.4 DEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 第2章 MEHP对 SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SH-SY5Y细胞株的体外培养 |
| 2.2.2 MEHP染毒剂量的确定和实验分组 |
| 2.2.3 SH-SY5Y细胞周期检测 |
| 2.2.4 SH-SY5Y细胞凋亡情况检测 |
| 2.2.5 SH-SY5Y细胞周期和凋亡相关基因m RNA表达水平检测 |
| 2.2.6 SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达水平检测 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关基因m RNA表达水平的影响 |
| 2.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖相关蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖的影响 |
| 2.4.2 细胞周期关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.4.3 细胞凋亡关键基因在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 MEHP对 SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制 |
| 3.1 主要仪器和材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞迁移距离测定 |
| 3.2.2 细胞侵袭能力测定 |
| 3.2.3 细胞趋化因子测定 |
| 3.2.4 细胞迁移相关基因m RNA表达水平检测 |
| 3.2.5 细胞迁移相关蛋白表达水平检测 |
| 3.2.6 数据处理与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.3.2 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关基因m RNA表达的影响 |
| 3.3.3 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移相关蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞趋化因子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 MEHP暴露对SH-SY5Y细胞迁移的影响 |
| 3.4.2 迁移关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.3 肿瘤微环境关键基因在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.4.4 趋化因子在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响 |
| 4.1 主要仪器和材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达的影响检测 |
| 4.2.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达的影响检测 |
| 4.2.3 数据处理与分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路基因m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.2 MEHP对 SH-SY5Y细胞Notch信号通路蛋白表达水平的影响 |
| 4.3.3 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖的关系 |
| 4.3.4 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞迁移的关系 |
| 4.3.5 Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞趋化因子的关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 MEHP对 Notch信号通路的影响 |
| 4.4.2 Notch信号通路与细胞增殖的关联性 |
| 4.4.3 Notch信号通路与细胞迁移的关联性 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制 |
| 5.1 主要仪器和材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 DAPT对 SH-SY5Y细胞存活率的影响 |
| 5.2.2 Notch信号通路抑制效率检测 |
| 5.2.3 实验分组 |
| 5.2.4 指标检测 |
| 5.2.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 DAPT剂量确定 |
| 5.3.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用 |
| 5.3.3 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用 |
| 5.3.4 Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞趋化因子中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖中的作用及机制 |
| 5.4.2 Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中的作用及机制 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 环境内分泌干扰物与儿童神经系统疾病 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）全反式维甲酸与肝脏疾病的关系及其分子机制研究进展（论文提纲范文）
| 1 ATRA的代谢 |
| 2 ATRA对非酒精性脂肪性肝病调控机制研究 |
| 3 ATRA对肝纤维化调控机制研究 |
| 3.1 ATRA通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抗肝纤维化 |
| 3.2 ATRA通过TGF-β-Smad信号通路抗肝纤维化 |
| 4 ATRA对肝癌调控机制研究 |
| 4.1 ATRA相关代谢酶与肝癌细胞的关系 |
| 4.2 ATRA对肝癌细胞凋亡调控相关分子机制 |
| 4.3 通过介导胰岛素样生长因子（IGF）促生存作用来调控细胞的增殖 |
| 4.4 通过介导维甲酸诱导基因1(RIG1）甲基化来调节细胞的增殖 |
| 5 总结与展望 |
（4）p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 p62/Keap1-Nrf2通路 |
| 1.2.1 p62基因的概述 |
| 1.2.2 Keap1-Nrf2信号通路抗氧化应激 |
| 1.2.3 p62/Keap1-Nrf2信号通路的研究进展 |
| 1.3 细胞自噬的研究进展 |
| 1.4 细胞自噬与凋亡之间的串扰 |
| 1.4.1 p62串扰自噬和凋亡 |
| 1.4.2 氧化应激、自噬和凋亡串扰的调控机制 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第2章 贝类Keap1-Nrf2通路的抗氧化应激作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验样品处理 |
| 2.2.4 组织模板cDNA的制备 |
| 2.2.5 CpNrf2和CpKeap1a mRNA的表达 |
| 2.2.6 MC胁迫下Cp Nrf2蛋白的表达 |
| 2.2.7 MC胁迫下褶纹冠蚌相关酶活性测定 |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因分析CpNQO1启动子活性 |
| 2.2.9 体内分析CpNrf2与CpKeap1a、CpKeap1b及亚型二聚体的形成 |
| 2.2.10 体外检测CpKeap1a与CpKeap1b二聚体的形成 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CpNrf2和CpKeap1a mRNA的表达 |
| 2.3.2 CpNrf2蛋白的表达 |
| 2.3.3 肝胰腺GOT和GPT活性测定 |
| 2.3.4 相关抗氧化酶活性测定 |
| 2.3.5 MC和CpNrf2对CpNQO1基因启动子活性的影响 |
| 2.3.6 体内CpKeap1a蛋白与CpKeap1b蛋白的互作 |
| 2.3.7 体外CpKeap1a与CpKeap1b二聚体的形成 |
| 2.3.8 体内CpNrf2与CpKeap1a、CpKeap1b的相互结合 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 Keap1-Nrf2途径介导p62促进贝类抗氧化应激 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验动物与材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 引物序列 |
| 3.2.4 Cpp62cDNA全长克隆 |
| 3.2.5 Cpp62基因的结构特征分析 |
| 3.2.6 Cpp62基因组织特异性表达 |
| 3.2.7 Cpp62原核表达和蛋白纯化 |
| 3.2.8 Cpp62蛋白抗体制备 |
| 3.2.9 MC胁迫下Keap1-Nrf2途径对Cpp62表达的影响 |
| 3.2.10 Cpp62基因启动子的克隆 |
| 3.2.11 CpNrf2蛋白与Cpp62启动子的亲和分析 |
| 3.2.12 CpNrf2蛋白对Cpp62启动子活性的调控 |
| 3.2.13 检测ARE元件突变的Cpp62启动子活性 |
| 3.2.14 考察Cpp62对CpNrf2mRNA和蛋白表达的调控 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 肝胰腺总RNA的提取 |
| 3.3.2 Cpp62基因全长的克隆 |
| 3.3.3 Cpp62序列及推导的氨基酸序列 |
| 3.3.4 Cpp62氨基酸推导序列的相似性比对 |
| 3.3.5 Cpp62系统发育分析 |
| 3.3.6 Cpp62基因的组织表达 |
| 3.3.7 Cpp62蛋白的原核表达、纯化及抗体制备 |
| 3.3.8 MC胁迫下Keap1-Nrf2途径对Cpp62的表达影响 |
| 3.3.9 Cpp62基因启动子的克隆 |
| 3.3.10 CpNrf2蛋白与Cpp62启动子的亲和性分析 |
| 3.3.11 CpNrf2蛋白对Cpp62启动子的活性调控 |
| 3.3.12 检测Cpp62启动子ARE元件突变后的活性 |
| 3.3.13 Cpp62对CpNrf2和CpNQO1表达的调控 |
| 3.3.14 Cpp62对CpNQO1和Cpp62启动子活性的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 贝类p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进抗氧化应激 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验动物与仪器 |
| 4.2.2 CpLC3基因cDNA全长克隆 |
| 4.2.3 CpLC3基因的结构特征分析 |
| 4.2.4 CpLC3基因组织特异性表达 |
| 4.2.5 MC诱导褶纹冠蚌自噬的发生 |
| 4.2.6 自噬对p62/Keap1-Nrf2通路关键基因表达调控 |
| 4.2.7 自噬对蚌抗氧化酶活性的影响 |
| 4.2.8 Cpp62与CpKeap1a的互作分析 |
| 4.2.9 Cpp62和CpNQO1启动子的活性检测 |
| 4.2.10 Cp LC3与CpKeap1a、Cpp62的细胞分布 |
| 4.2.11 Cpp62/CpKeap1a与 CpLC3之间的调控关系 |
| 4.2.12 COIP分析Cp LC3与CpKeap1、Cpp62的相互作用 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CpLC3基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 4.3.2 CpLC3序列相似性比对及系统发育分析 |
| 4.3.3 CpLC3基因的组织表达 |
| 4.3.4 TEM观察自噬小体和自噬溶酶体 |
| 4.3.5 自噬对Cpp62mRNA和蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 MC胁迫下自噬调控CpNrf2和Cpp62 mRNA的表达 |
| 4.3.7 自噬对抗氧化蛋白酶活性的影响 |
| 4.3.8 体外Cpp62与CpKeap1a的互作 |
| 4.3.9 CpKeap1对Cpp62和CpNQO1启动子活性的影响 |
| 4.3.10 CpKeap1a和自噬对CpLC3 mRNA表达的影响 |
| 4.3.11 TEM观察Cpp62对褶纹冠蚌自噬的影响 |
| 4.3.12 Cpp62对CpKeap1a和 CpLC3表达的调控 |
| 4.3.13 CpLC3与CpKeap1a、Cpp62的定位分析 |
| 4.3.14 CpLC3分别与Cpp62和CpKeap1b的相互作用 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 氧化应激诱发贝类细胞自噬与凋亡的交互 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验动物与仪器 |
| 5.2.2 CpBcl-2基因cDNA全长克隆 |
| 5.2.3 CpBcl-2基因的结构特征分析 |
| 5.2.4 qRT-PCR分析CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.2.5 Tunel实验检测细胞凋亡 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CpBcl-2基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 5.3.2 CpBcl-2基因序列及推导的氨基酸序列 |
| 5.3.3 MC和自噬影响CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.3.4 Tunel检测MC和自噬引起的细胞凋亡 |
| 5.3.5 Cpp62对CpBcl-2mRNA的表达 |
| 5.3.6 调控Tunel检测Cpp62双链RNA干扰后细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（5）mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 DEN诱导大鼠肝癌模型的建立及mRNA芯片分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 piRNA/piwi与肝癌的关系研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 紫草素对肝癌细胞CBRH-7919 的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 piRNA/piwi 在癌症中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:亚致死热处理促进HSP90与STAT3 结合并抑制肝癌细胞凋亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞培养及热处理 |
| 2.4 Hoechst33258 染色 |
| 2.5 细胞活力测定 |
| 2.6 免疫共沉淀 |
| 2.7 蛋白质印迹 |
| 2.8 免疫组织化学染色 |
| 2.9 患者样本 |
| 2.10 免疫共聚焦 |
| 2.11 RNA提取和实时逆转录PCR |
| 2.12 细胞转染cDNA用于过表达STAT3 蛋白 |
| 2.13 体内实验 |
| 2.14 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝癌组织内HSP90与STAT3 存在相关性 |
| 3.2 构建体外热处理模型 |
| 3.3 热处理诱导HSP90-STAT3 结合增加, |
| 3.4 热处理条件下促进抗凋亡蛋白表达 |
| 3.5 热处理后p-STAT3 入核增加 |
| 3.6 裸鼠不全RFA后 HSP90与STAT3 结合增加 |
| 3.7 裸鼠iRFA后促进肿瘤进展 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:亚致死热处理条件下HSP90 抑制剂XL888 通过破坏HSP90-STAT3 结合增强肝癌细胞热敏感性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 细胞培养和热处理 |
| 2.4 Hoechst33258 染色 |
| 2.5 细胞活力测定 |
| 2.6 流式细胞仪 |
| 2.7 蛋白质印迹 |
| 2.8 IHC染色 |
| 2.9 免疫共聚焦 |
| 2.10 集落形成试验 |
| 2.11 RNA提取和实时逆转录PCR |
| 2.12 细胞转染cDNA用于过表达STAT3 蛋白 |
| 2.13 体内实验 |
| 2.14 免疫共沉淀 |
| 2.15 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 XL888 分子结构 |
| 3.2 XL888 诱导肝癌细胞凋亡 |
| 3.3 热处理后XL888 增强肿瘤杀伤作用 |
| 3.4 热处理联合XL888 诱导BCL-2 通路活化 |
| 3.5 XL888 破坏HSP90-STAT3 结合,抑制STAT3 磷酸化 |
| 3.6 热处理联合XL888 抑制p-STAT3 入核 |
| 3.7 热处理条件下XL888 通过STAT3 发挥抗肿瘤作用 |
| 3.8 体内实验证实不全RFA后联合XL888 抑制肿瘤生长 |
| 3.9 评估XL888 对肝肾功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 热休克蛋白与肝癌 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用 |
| 一、体外实验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 二、体内实验 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 白藜芦醇抑癌作用及相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 凋亡、自噬及衰老与肿瘤 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌的研究进展 |
| 一、肝癌的概述 |
| 二、肝癌的危险因素 |
| 三、肝癌的诊断 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 第二节 中医药与肝癌 |
| 一、肝癌的病因病机 |
| 二、隐丹参酮与肝癌 |
| 第三节 细胞自噬和细胞凋亡在肝癌中的作用 |
| 一、细胞自噬与肝癌 |
| 二、细胞凋亡与肝癌 |
| 三、细胞自噬与细胞凋亡在肝癌中的关系 |
| 第二章 隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制的网络药理学研究 |
| 第一节 隐丹参酮靶点和肝癌相关靶点获取 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 隐丹参酮-隐丹参酮靶点网络的分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 蛋白与蛋白互作靶点网络分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 隐丹参酮靶点-功能网络的分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第五节 通路富集分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三章 隐丹参酮通过调控PI3K/AKT/mTOR通路诱导肝癌Huh7细胞自噬和凋亡 |
| 第一节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞增殖的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞凋亡的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞自噬的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第四节 隐丹参酮诱导的肝癌Huh7细胞凋亡和自噬的关系 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第五节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第六节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（10）咖啡因协同促进5-氟尿嘧啶的抗肝癌作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 攻读学位期间的获得奖励 |
| 致谢 |
四、肝细胞癌组织凋亡基因Bcl-X_L、Bcl-2的表达及意义（论文参考文献）
- [1]XPA通过PI3K/AKT/mTOR诱导自噬和凋亡抑制肝细胞癌的研究[D]. 邓怡. 重庆医科大学, 2021
- [2]Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制[D]. 张波. 吉林大学, 2021(01)
- [3]全反式维甲酸与肝脏疾病的关系及其分子机制研究进展[J]. 许召君,陈小彬,才保加,王成,乔文杰,刘光照,王鑫乐,刘韬,马晓明. 中国普通外科杂志, 2021(07)
- [4]p62/Keap1-Nrf2途径介导自噬促进贝类抗氧化应激研究[D]. 吴杰连. 南昌大学, 2021(02)
- [5]mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响[D]. 王延蛟. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]HSP90通过STAT3调控不全热消融术后肝癌细胞凋亡的机制研究[D]. 孙晨. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [8]白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究[D]. 姚宏伟. 苏州大学, 2020(06)
- [9]基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制[D]. 罗艺. 广州中医药大学, 2020(06)
- [10]咖啡因协同促进5-氟尿嘧啶的抗肝癌作用及机制研究[D]. 王芝蕾. 广州医科大学, 2020(01)