一、酶基因工程的研究现状及进展（论文文献综述）
王超,徐静[1]（2021）在《重组微生物修复 U（Ⅵ）污染的研究进展》文中研究说明铀及其化合物引起的环境污染问题日渐严重,微生物修复在其治理方面表现出优越性能。相比较于野生型微生物,重组微生物表现出更好的环境适用性及更优异的重金属污染修复潜力,在环境治理领域有更高的应用价值。本文分析了微生物与U（Ⅵ）相互作用的机理及基因工程菌在重金属污染修复中的应用,为发掘高效、经济的处理重金属污染方法提供重要依据。
王婕妤[2]（2021）在《阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的异源表达及酶学特性分析》文中研究说明阿魏酸酯酶属于羟基肉桂酸酯酶亚类,除了可以水解多糖阿魏酸酯和低聚糖阿魏酸酯中的酯键,某些类型的阿魏酸酯酶还可以水解绿原酸中的酯键,在食品医药等行业具有广阔应用前景。本实验室前期筛得一株棘孢曲霉,可产具有水解绿原酸活力的酶,该酶比活力为4.35 U/g,发酵周期为11天,经全基因组测序分析,确认该酶为阿魏酸酯酶。在大肠杆菌中进行表达时,由于E.coli缺少真核表达系统的蛋白加工修饰功能,所以胞内产生较多没有生物活性的包涵体,酶活和表达量提高有限。因此,本论文通过全基因组测序分析,在毕赤酵母表达系统中将编码阿魏酸酯酶的基因进行异源表达,对诱导条件进行优化,对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征并开展高密度发酵策略优化研究。首先将全基因组测序所得的蛋白一级结构与几种被报道且被应用的阿魏酸酯酶的氨基酸序列进行序列比对表明,本研究中的阿魏酸酯酶与其他阿魏酸酯酶的氨基酸序列保守区高度重合,可认定为一种新型的阿魏酸酯酶,并对其高级结构进行预测。然后以棘孢曲霉（A.aculeatus SD14）的基因组序列为模板,设计引物扩增获得基因组中具有阿魏酸酯酶的注释基因,构建基因工程菌并最终在毕赤酵母真核表达系统中进行表达。其中基因工程菌Fae-p PICZαA/Pichia pastoris GS115所表达的重组阿魏酸酯酶命名为re Fae。其次从接种量、诱导pH、诱导温度、甲醇添加量以及诱导时长五个方面对Fae-p PICZαA/Pichia pastoris GS115进行诱导发酵条件优化,对接种量、诱导pH、诱导温度、甲醇添加量这四个重要因素进行了正交实验,确定了最佳诱导条件为:接种量为5%,pH为6.0,保持诱导剂甲醇的浓度为1%,在28℃下诱导72 h。最终阿魏酸酯酶比活力为3423.71 U/g。通过镍柱对重组酶进行分离纯化,纯化所得re Fae相对分子质量约为56 k Da。重组酶的最适反应温度为50℃,且在20℃～50℃条件下呈现良好的热稳定性。最适pH值为7.0,在pH在3.0～10.0范围内具有一定程度的稳定性。一价金属离子基本不会影响酶活,Mn2+和Ca2+对re Fae有一定程度的激活作用,其他二价金属离子会对酶活造成不同程度的抑制,三价金属离子会对酶活产生较大影响,re Fae在Fe3+处理后酶活几乎为零。EDTA处理对re Fae活性基本没有影响。最后利用3 L体系高密度发酵培养提高了重组酶的表达量,通过对选择发酵培养基的组成成分、发酵过程中保持的pH环境以及补料流加阶段的碳源进行研究,最终表达菌株的发酵上清液中蛋白浓度最高可达到1.31 g/L;最高酶活为42.78 U/m L。本论文成功构建能够表达阿魏酸酯酶的工程菌,经诱导条件优化及高密度发酵得到的re Fae与野生酶相比,酶活得到显着提高,发酵周期大幅缩减。为重组酶的分子改造以及工业化应用奠定基础。
刘婉颐[3]（2020）在《P450单加氧酶催化拆分2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的研究》文中研究指明目的:以P450单加氧酶为生物催化剂,通过P450催化的C-N键氧化反应,实现2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的动力学拆分,为手性2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉类化合物的制备发展一种生物催化合成新路线。方法:1.酶的筛选:以2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉（2-MTHQ）为模板底物,P450单加氧酶整细胞为生物催化剂对实验室构建的自给型P450单加氧酶和非自给型P450单加氧酶工程菌及其突变体进行筛选,获得可以立体选择性氧化拆分2-MTHQ的生物酶。2.反应条件优化:以优良P450单加氧酶整细胞为生物催化剂,对P450酶工程菌的发酵产酶条件和动力学拆分2-MTHQ的反应条件进行系统考察,建立P450单加氧酶的最优培养条件及其对2-MTHQ立体选择性氧化拆分最适反应体系。3.底物普适性考察:在最适反应体系,对多类型2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉底物的动力学拆分过程进行考察。结果:1.以（rac）-2-MTHQ为底物,P450整细胞为生物催化剂,对实验室保藏的P450单加氧酶进行筛选,包括P450PL2系列（5株）、P450PL7系列（5株）、P450pyr-L系列（13株）、P450PL2-2突变体（9株）、P450DA及其突变体（13株）。发现P450PL2-SM3以优良的（S）-立体选择性氧化得到（R）-2-MTHQ,ee值为88%。另发现P450pyr-L-13以（R）-立体选择性氧化拆分2-MTHQ得到（S）-2-MTHQ,ee值为41%。2.建立P450PL2-SM3氧化拆分合成手性（R）-2-MTHQ的最佳培养体系和最佳反应体系。最佳培养体系:诱导剂浓度0.1 mM、诱导温度25℃、诱导时间8h;最优反应体系:反应温度15℃、缓冲溶液PBS pH 8.0,细胞浓度10g cdw/L、底物浓度2mM,反应时间1.5小时,ee值达93%,转化率80%。3.建立P450pyr-L-13氧化拆分合成（S）-2-MTHQ的最佳培养体系和最佳反应体系。最佳培养体系:诱导剂浓度0.2mM、诱导温度25℃、诱导时间12h;最优反应体系:反应温度35℃、缓冲溶液Gly-Na OH pH 8.0、细胞浓度10 g cdw/L,底物浓度2mM,反应时间24小时,ee值47%,转化率60%。4.在最佳反应体系下,分别考察了P450PL2-SM3和P450pyr-L-13对2-取代1,2,3,4-四氢喹啉类化合物氧化拆分的底物谱普适性。发现P450PL2-SM3对苯环取代的底物（1f、1g、1j、1k）对映选择性较高,氧化拆分后得到（R）-构型底物ee值可达60-92%,对于2-位取代基为环丙基（1b）、正丁基（1c）、异丁基（1d）、叔丁基（1e）均表现出较低的氧化拆分活性。此外,P450pyr-L-13底物普适性较差,仅对2-环丙基取代（1b）和6-F取代（1g）底物展现一定立体选择性,反应后得到（S）-1b和（S）-1g,ee值分别为48%和37%。结论:以（rac）-2-MTHQ为底物,对实验室保藏的P450单加氧酶进行筛选,获得了（S）-立体选择性生物催化剂P450PL2-SM3和（R）-立体选择性生物催化剂P450pyr-L-13,为手性2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉氧化拆分建立了立体选择性互补的生物催化合成路线。在P450PL2-SM3对2-MTHQ进行选择性C-N氧化过程中,由于其催化功能的混杂性,同时对2-MTHQ进行了苄位羟化,生成了2-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-4-醇,但P450pyrL-13在其催化过程中未见对2-MTHQ的羟化活性。本课题首次发现P450单加氧酶可通过C-N键的立体选择性氧化反应实现2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的动力学拆分,拓展了P450单加酶在生物催化反应中的新应用。
郑佳豪[4]（2020）在《隆线溞和老年低额溞几丁质酶重组蛋白的抗体制备与应用》文中指出为高效生产特异性抗体,利用已知基因序列设计好的引物RT-PCR直接扩增出了隆线溞Daphnia carinata和老年低额溞Simocephalus vetulus几丁质酶（chitinase,EC 3.2.1.14）基因序列全长（隆线溞1149bp,老年低额溞1086bp）。然后通过双酶切几丁质酶基因和pCold表达载体并将两者连接,构建出重组表达载体。重组载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导培养后得到了两种生物的重组几丁质酶蛋白。将重组几丁质酶蛋白经过纯化处理后作为抗原,免疫新西兰白兔,最终分别得到效价约1:158000和1:134000的兔抗重组隆线溞和老年低额溞几丁质酶多克隆抗体。应用间接非竞争ELISA方法对于抗原抗体最适反应浓度进行了测量。其中,隆线溞几丁质酶抗体的最适稀释倍数为1:16000(浓度4.75×10-5mg·mL-1),测定重组几丁质酶的标准曲线为y=1.4711×(1-e-1.5431x)(R=0.9892,S=0.0915,最低检测限24.1 ng·mL-1);老年低额溞几丁质酶抗体的最适稀释倍数为1:14000(浓度4.36×10-5 mg·mL-1),测定重组几丁质酶的标准曲线为y=1.8204×(1-e-0.8393x)(R=0.9854,S=0.125,最低检测限35.2 ng·mL-1)。以抗原生物作为参照,将获得的抗体与隆线溞、老年低额溞、掌肢新米虾、锯缘真剑水蚤、中华薄壳介体内的几丁质酶进行交叉反应。对隆线溞几丁质酶抗体而言,除与老年低额溞几丁质酶具有10.46%的交叉反应率外,其与其他生物的交叉反应率均低于0.28%;相应地,老年低额溞几丁质酶抗体与隆线溞几丁质酶具有20.26%的交叉反应率,其与其他生物的交叉反应率均低于0.24%。以毒死蜱作为受试农药,对建立的隆线溞和中华薄壳介Dolerocypris sinensis混合种群进行了测试,指标包括种群数量（即丰度）、游离态N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAGase）比活力和游离态几丁质酶免疫可反应蛋白含量（chitinase-IR）。其中对chitinase-IR的测量采用以原核表达的隆线溞几丁质酶作为免疫原制备而成的基因工程抗体。测试结果表明,当以实测浓度为衡量基准时,毒死蜱对隆线溞以及中华薄壳介种群数量的无可观察效应浓度（NOEC）和最低可观察效应浓度（LOEC）分别为0.075和0.172以及0.014和0.051μg·L-1,毒死蜱在群落层次（CaseR.1）的NOEC和LOEC分别为<0.084和<0.200μg·L-1,毒死蜱对chitinase-IR以及NAGase比活力的NOEC和LOEC分别为0.061和0.133以及<0.041和<0.084μg·L-1。研究结果表明chitinase-IR能够有效指示农药引起的种群变化,给农药水生生态风险评估提供了一种方法参考。
苏少锋[5]（2019）在《蒙古马胃肠道细菌群落组成及纤维素分解菌的研究》文中认为马产业是我国近年来大力扶持的产业,研究国内地方特色马种的耐粗饲生物学特性,对于提高饲草料的利用率,促进我国马产业的转型升级和可持续发展具有重要意义。蒙古马原产于蒙古高原,是世界上较古老的草原马种,是中国重要的、优秀的地方马品种资源之一,具有较强的适应性、抗病性和耐粗饲等优良特征。蒙古马的耐粗饲性必然与其独特的胃肠道微生物密切相关。为了进一步揭示蒙古马耐粗饲特性的相关机制,本研究从蒙古马胃肠道的细菌种群组成多样性,纤维素分解菌株的筛选分离,纤维素酶的酶学特性,纤维素酶基因的密码子优化、克隆,以及表达纤维素酶的食品级工程乳酸菌的构建等方面进行了较为全面而系统的研究,试验结果如下:（1）采用Thermo Ion S5 XL平台,利用高通量测序技术研究在草原上自由放牧的5匹蒙古马胃肠道6个不同区段（胃、空肠、回肠、盲肠、腹结肠和背结肠）中的细菌群落组成及多样性,发现从蒙古马胃肠道内容物中得到的细菌16S rDNA V3～V4高变区获得可注释信息的reads数目为1 355 813个,平均为45 194个,OTUs聚类数目（相似性为97%）为24602个,平均为820个。蒙古马胃肠道不同部位的微生物群落均存在着显着性差异,胃中微生物组成在马匹个体之间差异最大,小肠和大肠之间微生物组成划分明显,盲肠和结肠内微生物结构相似。在前肠道内容物中以厚壁菌门（Firmicutes,65%）和变形菌门（Proteobacteria,23%）比例最高,后肠道则以厚壁菌门（Firmicutes,45%）和拟杆菌门（Bacteroidetes,42%）为主。在科水平上,后肠道微生物主要包括瘤胃菌科（Ruminococcaceae,P=0.203）、毛螺菌科（Lachnospiraceae,P=0.157）、理研菌科（Rikenellaceae,P=0.122）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae,P=0.068）。在属水平上,盲肠中纤维杆菌属（Fibrobacter）和腹结肠中瘤胃球菌属（Ruminococcus）等纤维素降解菌的相对丰度高于胃肠道其他部位,说明发酵植物性纤维的主要部位在后肠。.腹结肠中与机体健康相关的Akkermansiaspp.（5.7%）相对丰度较高。在功能预测方面,蒙古马胃肠道中微生物功能丰度在不同部位比例相似,这也许能够表征蒙古马特有的胃肠道微生物结构。可见,蒙古马的食草性和适应性不仅与其独特的胃肠道微生物群落结构有关,还可能与长期采食并消化粗饲料而形成的特殊生理有关。（2）采用羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板法和刚果红染色法从蒙古马盲肠内容物中分离、筛选纤维素降解菌,获得了2株能高效降解纤维素的细菌,经革兰氏染色、生理生化鉴定以及16S rDNA PCR及序列分析分别鉴定为Microbacterium arborescens（树状微杆菌 C6）和Bacillus amyloliquefaciens C14（解淀粉芽孢杆菌C14）。树状微杆菌C6生长速度慢,发酵周期长,对数期为8～120 h,稳定期为120～124 h,124 h以后逐渐下降;解淀粉芽孢杆菌C14生长速度快,接种后8～36 h进入对数期,36 h以后进入稳定期,未见衰退期。解淀粉芽孢杆菌C14产生的纤维素酶反应的最适条件为pH值4.8、55℃和反应5 min,有较强的耐酸碱性和热稳定性,有较好的深度开发和纤维素酶工业化的生产潜力。（3）从蒙古马源解淀粉芽孢杆菌C14基因组DNA中克隆到纤维素酶基因egl-BA，长度为1 500 bp,编码499个氨基酸。序列分析预示,纤维素酶基因egl-BA所编码的纤维素酶是由跨膜结构域（transmembrane region,7～29 aa）、纤维素酶的结构功能域（cellulase,50～297 aa）和N末端的纤维素结合结构域区域（CBM-3,356～437 aa）组成的,含有信号肽的亲水、分泌型、空间结构较复杂的蛋白质。最后,以乳酸菌为宿主对该基因进行密码子优化,为后期的异源表达奠定了基础。（4）成功构建具有纤维素降解能力的食品级工程乳酸菌NN1-EGL（pMG36e-Emr+p32+usp45+melA+NisI+egl）；其酶活力为 0.92 U/m L,高于原始菌株（0.60 U/mL）。为后续食品级工程菌的进一步研制奠定了基础,也为其产业化开发提供必要的试验依据。
邓涵中[6]（2019）在《卤醇脱卤酶的分子改造及在不对称合成手性环氧氯丙烷中的应用》文中认为手性环氧氯丙烷（Epichlorohydrin,ECH）是一种手性三碳合成子,广泛应用于手性医药、化工制造和高端材料等领域。卤醇脱卤酶（Halohydrin dehalogenases,HHDHs,EC 4.5.1.X）可催化前手性1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dicholro-2-propanol,1,3-DCP）不对称脱卤制备手性ECH,具有较大的应用潜力。但是,该工艺中逆反应的存在导致产物稳定性差、光学纯度低等问题,严重限制了其工业化应用。本论文开展卤醇脱卤酶的分子改造与光学纯（S）-ECH的生物合成工作,主要包括以下内容:以实验室前期构建的卤醇脱卤酶HheC（P175S/W249P）(HheCPS)为模板,对其内部卤素离子通道和底物构象作用关键位点进行探究,应用定点饱和突变、迭代饱和突变等手段进行分子改造,获得高立体选择性卤醇脱卤酶突变体HheCPS I81W、HheCPS E85P、HheCPS F86N和HheCPS V94R,用于高光学纯度（S）-ECH的生物合成,催化活性分别为HheCPS的34.65%、69.15%、39.78%以及25.43%。对HheCPS及突变体进行重组表达、分离纯化与动力学参数研究。HheCPSS I81W、HheCPS E85P、HheCPS F86N和HheCPS V94R的正反应米氏常数(Km（1,3-DCP）)分别由20.83 mM降至19.35 mM、20.72 mM、16.87 mM以及15.84 mM。HheCPSS I81W、HheCPS E85P、HheCPS F86N和HheCPS V94R的催化效率(kcat（1,3-DCP）/Km（1,3-DCP）)分别为0.73 mM-1s-1、0.71 mM-1s-1、0.64 mM-1s-1和0.32mM-1s-1,分别为HheCPS的0.88倍、0.85倍、0.77倍以及0.36倍。HheCPS I81W、HheCPS E85P、HheCPS F86N和HheCPS V94R的逆反应米氏常数(Km（（S）-ECH）)由1.38 mM分别提高至4.01 mM、6.14 mM、7.31 mM以及6.75 mM,为HheCPS的2.91倍、4.45倍、5.30倍和4.89倍,催化效率(kcat（（S）-ECH）/Km（（S）-ECH）)由0.13mM-1s-1分别降至0.05 mM-1s-1、0.03 mM-1s-1、0.03 mM-1s-1和0.03 mM-1s-1,分别为HheCPS的0.38倍、0.23倍、0.23倍以及0.23倍。各突变体不对称合成（S）-ECH反应的逆反应动力学过程抑制程度明显大于正反应,产物（S）-ECH的光学纯度大幅提升。应用HheCPS I81W、HheCPS E85P、HheCPS F86N和HheCPS V94R催化1,3-DCP不对称合成高光学纯度（S）-ECH。在37oC,20 mM的1,3-DCP反应条件下,四株突变体首次制备得到对映体过量值（e.e.）>99.99%的（S）-ECH,产率分别为63.45%、69.15%、67.58%和57.50%。通过同源建模与分子对接揭示卤醇脱卤酶的立体选择性催化机制。第81位、第86位和第94位氨基酸残基通过影响卤素离子通道的形成,第85位氨基酸残基通过影响底物口袋中（S）-ECH的构象,调节酶的正、逆反应动力学过程,进而提高酶的立体选择性,实现了光学纯（S）-ECH的生物合成。
马锁[7]（2019）在《海参i-型溶菌酶基因工程菌的发酵及产品特性分析》文中研究表明溶菌酶,又称N-乙酰胞壁质肽聚糖水解酶,是一种无害、无毒,不会残留在体内的天然蛋白质。其广泛分布于不同生物体中,是一种能水解微生物细胞壁黏多糖的碱性水解酶。2007年,本实验室首次分离和鉴定了海参i-型溶菌酶基因,并已在原核细胞和真核细胞中高效表达其目的蛋白。该研究以本实验室已构建的能高效表达的海参i-型溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌HS3-1为发酵出发菌株,运用发酵罐对该工程菌进行发酵生产。发酵液经过一系列分离纯化后得到海参i-型溶菌酶产品。利用高效液相色谱和MALDI-TOF质谱技术对海参i-型溶菌酶产品进行分析测定,通过利用分子动力学模拟的方法对该酶热稳定性进一步研究。研究结果如下:（1）5 L发酵罐初始为3 L BSM基础盐培养基,发酵过程控制条件为温度30℃,pH6.0,搅拌转速400 r/min,溶解氧DO 30%;发酵过程分为三个阶段,即细胞生长阶段、甘油流加阶段和甲醇诱导产物分泌阶段。发酵结束后,分析该发酵液的溶菌酶产量为58mg/L。最后生产的海参i-型溶菌酶产品,其酶活力为1246 U/mg。高效液相色谱分析结果显示,该溶菌酶产品与蛋清溶菌酶标准品的出峰时间相同,而且无其他杂峰。MALDI-TOF质谱分析结果显示,该海参i-型溶菌酶的分子量为14708.7 Da,与其氨基酸组成的理论计算值相符合,这说明该产品为海参i-型溶菌酶。（2）利用生物信息学方法,对海参i-型溶菌酶蛋白进行分析。通过一级结构分析确定了,海参i-型溶菌酶的氨基酸种类、数量及占比;二级结构预测分析可推断,该溶菌酶蛋白中α-螺旋,β-折叠,β-转角及无规则卷曲的比例及位置。通过三级结构预测可推断该溶菌酶活性中心及活性位点在亚基结构中所处的位置。（3）在酶学性质研究方面,确定海参i-型溶菌酶的最适温度为35℃,在65-80℃较高温度下有较好的热稳定性;最适pH为6.5,pH在5.0-8.0之间稳定性较好。通过分子动力学模拟,发现该溶菌酶的三级结构存在“螺旋-环-螺旋”（HLH）,推测该酶的抗菌活性与此结构有关,这个结果与国外学者Zavalova等对水蛭溶菌酶单个螺旋肽形成的HLH构象具有活性的研究结果相符合。进一步分析比较确定该溶菌酶两个活性位点（Glu 19和Asp 31）分别位于“H2-L3-H3”构象中的2个螺旋区域上。“螺旋-环-螺旋”构象在高温下使其仍具有很强的抗菌活性,这表明该酶具有良好的热稳定性,与不同温度下抑菌试验结果相符。这个研究为进一步探讨海参i-型溶菌酶的分子作用机理奠定良好的理论基础,该酶的热稳定性优势对食品工业及动物饲料加工业非常有利,所以它具有很大的应用价值。
王伟,王永花[8]（2019）在《纤维素酶基因的研究进展》文中提出纤维素酶作为重要的糖苷水解酶,对纤维素有较好的水解作用。目前已知的天然纤维素酶已广泛应用于各方面,但其产量难以达到生产需求,造成了大量资源的浪费。为了充分利用纤维素资源,获得高产的纤维素酶菌株,目前国内外对纤维素酶基因工程的研究已成为热点。本文对纤维素酶基因及其表达系统进行综述,总结近几年来纤维素酶基因工程的研究进展,为后续研究提
张卫卫[9]（2017）在《酶法制备D-丙氨酸研究》文中研究表明D-丙氨酸（D-Alanine）有杀菌、镇痛等作用,是一种重要的有机手性源,广泛应用于医药、食品、农药、化妆品等领域。目前工业生产制备D-丙氨酸的方法主要是酶拆分法,这种方法需要化学制备DL-丙氨酸衍生物,反应过程复杂。本论文旨在寻找一种廉价高效的生物酶法制备D-丙氨酸方法,即利用基因工程技术在原核和酵母表达系统分别重组表达了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶,并对双酶联合反应制备D-丙氨酸进行了考察。主要实验研究工作如下:1.在原核表达系统中重组表达了天冬氨酸消旋酶（AspR）和带His标签的D-氨基酸转氨酶（DaaT）,并考察了双酶级联反应制备D-Ala工艺。AspR全细胞催化消旋反应的最佳条件:pH=7.0,温度40℃,底物L-Asp质量浓度为100 g/L。纯化后的DaaT酶液催化转氨反应的最佳条件:4 mmol/LPLP,pH=8.0,温度42℃,底物D-Asp与丙酮酸的摩尔比10:1,底物D-Asp质量浓度为25 g/L。AspR全细胞和DaaT纯化酶液级联反应制备D-Ala,催化25 mL 10%Asp,D-Ala 的产量可达 12.1 g/L。2.利用酵母表达系统分泌表达了天冬氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶,并考察了双酶偶联法制备 D-Ala 工艺。X-33/pPICZαA-DaaT 和 X-33/pPICZαA-AspR酵母基因工程菌分别用甲醇诱导发酵120 h,DaaT发酵上清目的蛋白浓度可达0.58 mg/mL,AspR发酵上清液浓缩十倍后目的蛋白浓度为0.12 mg/mL。用X-33/pPICZαA-AspR发酵上清和浓缩后的X-33/pPICZαA-DaaT发酵上清偶联反应制备D-Ala,催化1%L-Asp反应20 h,D-Ala产率为82%。3.建立了一种生物酶法级联催化高效制备D-Ala的工艺。分别对基因工程菌BL21/pET-Duet-AspR和X-33/pPICZαA-DaaT进行发酵条件优化。前者的最佳发酵条件为:30℃,pH 8.0,装液量25 mL/250 mL,摇床转速200 r/min发酵13 h。后者的最佳发酵条件为:温度30℃,pH 6.0,装液量75 mL/500 mL,转速250 r/min,每隔12 h补加甲醇至终浓度1.25%,发酵144 h。然后,用最优发酵条件下得到的AspR全细胞和DaaT发酵上清级联反应制备D-丙氨酸,D-丙氨酸产量可达14.47 g/L,用阳离子交换树脂分离得到D-丙氨酸6.7 g,收率78%,对映体过量值（ee值）=98%。
王秋文[10]（2016）在《纤维素酶基因优化及在植物乳酸杆菌中的表达》文中研究表明纤维素是一种最大天然的可循环能源,人类对其的应用已有很久的时间。合理地开发与利用纤维素资源能够有效地应对能源危机、粮食短缺、环境污染等危机。现今使用微生物及其分泌的纤维素酶来分解纤维素是一种高效并且结果显着的方式。作为一种饲料添加剂,纤维素酶具有能够显着提高饲料的消化和利用率、改善饲料品质、促进动物生产等功能,在畜牧业中有着广阔的应用前景,但由于它的酶活性低、成本高等原因,使它的不能被很好的被使用。目前,利用体外定向进化技术改造纤维素酶基因及构建高产纤维素酶的基因工程菌,已经获得研究人员的关注。本试验从能够有效产纤维素酶的菌康氏木霉（T.koningii）及黑曲霉（Aspergillus niger）的DNA文库中通过PCR获得外切葡聚糖酶CBHⅠ基因,并对其进行DNA改组,构建重组表达质粒pMG36e-CBHⅠ,并利用高压电击手段转入到植物乳酸杆菌中,实现CBHⅠ基因在植物乳酸杆菌中的表达。主要内容以下:（1）使用RT-PCR技术成功克隆得到康氏木霉黑曲霉CBHⅠ基因,两种纤维素酶基因与NCBI公布的纤维素基因同源性均大于99%。（2）对克隆得到的两种纤维素酶基因进行DNA改组,将改组纤维素酶基因与pMD19-T质粒连接并转入大肠杆菌中,得到两株纤维素酶基因改组I号（g1）和改组II号（g2）。g1在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨酸;在636位点碱基由A变为G,氨基酸由丝氨酸变为脯氨酸;g2在172位点碱基由G变为A,氨基酸由精氨酸变为色氨;在554位点碱基由G变为A,氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸;在1114位点碱基由T变为C,氨基酸未发生变化,均为谷氨酰胺。将改组的纤维素酶基因与表达载体pMG36e连接,构建可在乳酸杆菌中表达的重组质粒载体。（3）将重组质粒载体通过电击转化转入植物乳酸杆菌中,并通过红霉素抗性筛选及质粒PCR选出重组菌,并对其分泌的纤维素酶活进行测定。结果显示,在低糖MRS培养基中,g1的滤纸酶活最高可达4.83 U/L,g2的滤纸酶活最高可达4.19 U/L;两者的最适反应温度均为50℃,g1的最适pH为5.0,g2的最适pH为5.5。
二、酶基因工程的研究现状及进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、酶基因工程的研究现状及进展（论文提纲范文）
（1）重组微生物修复 U（Ⅵ）污染的研究进展（论文提纲范文）
| 1 核素污染的治理方法及现状 |
| 2 微生物与铀相互作用机理 |
| 3 工程菌在环境污染修复中的应用 |
| 3.1 工程菌宿主菌的类型 |
| 3.1.1 枯草芽孢杆菌 |
| 3.1.2 大肠杆菌 |
| 3.1.3 耐辐射奇球菌 |
| 3.2 与核素(重金属)相互作用的基因及其功能 |
| 3.3 基因工程菌的构建策略 |
| 3.3.1 构建穿梭表达载体 |
| 3.3.2 构建融合蛋白 |
| 3.3.3 利用基因整合平台系统 |
| 3.4 转基因微生物在处理重金属污染时的应用 |
| 3.4.1 转特异性金属转运酶基因工程菌 |
| 3.4.2 转金属络合物基因工程菌 |
| 3.4.3 转金属沉淀酶基因工程菌 |
| 4 结语 |
（2）阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的异源表达及酶学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 阿魏酸酯酶概述 |
| 1.1.1 阿魏酸酯酶的定义 |
| 1.1.2 阿魏酸酯酶的来源 |
| 1.1.3 阿魏酸酯酶的应用现状 |
| 1.1.4 阿魏酸酯酶的分类 |
| 1.1.5 阿魏酸酯酶的基因工程进程研究 |
| 1.2 绿原酸概述 |
| 1.2.1 绿原酸的定义 |
| 1.2.2 绿原酸的影响 |
| 1.2.3 绿色醌类物质的水解 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 |
| 1.3.1 表达系统概述 |
| 1.3.2 甲醇代谢途径 |
| 1.3.3 感受态与载体 |
| 1.3.4 外源基因的整合 |
| 1.3.5 影响表达的因素 |
| 1.3.6 高密度发酵 |
| 1.4 立题依据与研究意义 |
| 1.5 论文主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株与质粒 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 主要试剂与工具酶 |
| 2.2.2 主要溶液及培养基 |
| 2.2.3 主要设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 A.aculeatus SD14 基因组提取 |
| 2.3.2 棘孢曲霉阿魏酸酯酶基因的克隆及优化 |
| 2.3.3 酶活的测定 |
| 2.3.4 毕赤酵母重组工程菌的构建 |
| 2.3.5 重组阿魏酸酯酶的发酵优化 |
| 2.3.6 重组阿魏酸酯酶的分离纯化 |
| 2.3.7 重组阿魏酸酯酶的酶学性质研究 |
| 2.3.8 重组阿魏酸酯酶的高密度发酵 |
| 2.4 数据处理与分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 A.aculeatus SD14 基因序列分析 |
| 3.2 重组阿魏酸酯酶的载体构建及阳性转化子的筛选 |
| 3.3 重组阿魏酸酯酶的诱导表达 |
| 3.4 重组阿魏酸酯酶的诱导条件优化 |
| 3.4.1 p PICZαA/Pichia pastoris GS115 的生长曲线 |
| 3.4.2 最适甲醇添加量 |
| 3.4.3 培养基最适pH |
| 3.4.4 最适诱导产酶温度 |
| 3.4.5 最适诱导时长 |
| 3.4.6 最适接种量的确定 |
| 3.4.7 正交实验优化 |
| 3.5 重组阿魏酸酯酶的分离纯化以及酶学性质研究 |
| 3.5.1 重组酶的分离纯化 |
| 3.5.2 重组酶的最适反应pH与pH稳定性 |
| 3.5.3 重组酶的最适反应温度与温度稳定性 |
| 3.5.4 金属离子对重组酶水解活力的影响 |
| 3.6 重组阿魏酸酯酶的高密度发酵 |
| 3.6.1 三种培养基对重组工程菌高密度发酵的影响 |
| 3.6.2 不同的诱导pH对重组工程菌高密度发酵的影响 |
| 3.6.3 补料策略对重组工程菌高密度发酵的影响 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）P450单加氧酶催化拆分2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 高效液相分析图谱 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）隆线溞和老年低额溞几丁质酶重组蛋白的抗体制备与应用（论文提纲范文）
| 术语及缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 几丁质酶系的研究概况 |
| 1.1.1 几丁质概述 |
| 1.1.2 几丁质酶概述 |
| 1.1.3 几丁质酶在生物体内的作用 |
| 1.1.4 几丁质酶系的分子生物学研究概况 |
| 1.2 浮游生物研究进展 |
| 1.2.1 隆线溞 |
| 1.2.2 老年低额溞 |
| 1.2.3 中华薄壳介 |
| 1.3 抗原和抗体的制备 |
| 1.3.1 抗原的制备 |
| 1.3.2 抗体的制备 |
| 1.4 毒死蜱概况 |
| 1.4.1 毒死蜱的毒理机制 |
| 1.4.2 毒死蜱的毒性 |
| 1.4.3 毒死蜱的降解 |
| 1.4.4 固相萃取-气相色谱法 |
| 1.5 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 1.5.1 双抗体夹心法/双抗原夹心法 |
| 1.5.2 间接法 |
| 1.5.3 竞争法 |
| 1.6 本研究的立题依据及主要内容 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 研究的主要内容 |
| 1.6.3 预期目标 |
| 第2章 隆线溞和老年低额溞几丁质酶的基因克隆与蛋白表达 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验试剂 |
| 2.1.3 试验仪器与设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 几丁质酶基因的获得 |
| 2.2.3 原核表达载体构建 |
| 2.2.4 蛋白诱导 |
| 2.2.5 超声破碎 |
| 2.2.6 亲和层析柱纯化蛋白 |
| 2.2.7 蛋白浓缩 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA的提取 |
| 2.3.2 原核表达载体构建 |
| 2.3.3 几丁质酶诱导表达 |
| 2.3.4 超声破菌 |
| 2.3.5 蛋白过柱纯化 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 2.4.1 小结 |
| 2.4.2 讨论 |
| 第3章 隆线溞和老年低额溞几丁质酶抗体的制备 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验试剂 |
| 3.1.3 试验仪器与设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 酶联免疫间接非竞争ELISA检测 |
| 3.2.3 Western blot检测 |
| 3.2.4 抗体纯化 |
| 3.2.5 抗原抗体最适反应浓度选择 |
| 3.2.6 间接非竞争ELISA标准方程的建立灵敏度检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 血清抗体效价检测结果 |
| 3.3.2 Western Blot结果 |
| 3.3.3 抗原抗体最适反应浓度选择 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 小结 |
| 3.4.2 讨论 |
| 第4章 几丁质酶抗体的特异性研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验试剂 |
| 4.1.3 试验仪器与设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 试验动物体内几丁质酶的制备 |
| 4.2.2 NAGase活性测定 |
| 4.2.3 隆线溞和老年低额溞几丁质酶抗体的特异性测定(交叉反应) |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 酶活力标准曲线 |
| 4.3.2 隆线溞和老年低额溞几丁质酶抗体的特异性分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 4.4.1 小结 |
| 4.4.2 讨论 |
| 第5章 毒死蜱对隆线溞-中华薄壳介混合种群动态的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验试剂 |
| 5.1.3 试验容器 |
| 5.1.4 试验仪器与设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 测试系统构建 |
| 5.2.2 取样 |
| 5.2.3 施药方法 |
| 5.2.4 农药检测 |
| 5.2.5 动物计数 |
| 5.2.6 水体酶活检测 |
| 5.2.7 Chitinase-IR检测 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 毒死蜱暴露浓度 |
| 5.3.2 生物效应 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 5.4.1 小结 |
| 5.4.2 讨论 |
| 第6章 总结 |
| 6.1 隆线溞和老年低额溞几丁质酶的基因克隆和蛋白表达 |
| 6.2 隆线溞和老年低额溞几丁质酶多克隆抗体的制备 |
| 6.3 几丁质酶抗体的应用性研究 |
| 6.4 创新点与不足 |
| 6.4.1 创新点 |
| 6.4.2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）蒙古马胃肠道细菌群落组成及纤维素分解菌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 中国马种的概述 |
| 1.2 马胃肠道的结构及消化特点 |
| 1.2.1 马前肠系统 |
| 1.2.2 马后肠系统 |
| 1.3 后肠微生物的研究进展 |
| 1.3.1 后肠微生物的作用 |
| 1.3.2 马后肠微生物的多样性 |
| 1.4 肠道微生物多样性的研究方法 |
| 1.4.1 纯培养分离和鉴定技术 |
| 1.4.2 分子生物学技术在微生物中的应用 |
| 1.5 纤维素分解菌的研究和作用 |
| 1.6 纤维素酶的研究进展 |
| 1.6.1 纤维素酶的作用机制 |
| 1.6.2 纤维素酶在行业中的应用 |
| 1.6.3 纤维素酶的基因工程学研究进展 |
| 1.7 乳酸菌食品级表达载体系统的研究进展 |
| 1.7.1 乳酸菌食品级选择性标记 |
| 1.7.2 乳酸菌食品级表达系统 |
| 1.7.3 食品级纤维素酶基因工程菌的构建及应用 |
| 1.8 本实验的目的及意义 |
| 1.9 研究的技术路线 |
| 2 蒙古马胃肠道不同区段细菌群落多样性及组成研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 马匹及样本收集 |
| 2.2.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 DNA提取与PCR扩增 |
| 2.2.5 文库构建和上机测序 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.2.7 数据统计方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 测序结果与OTU聚类 |
| 2.3.2 Alpha多样性分析 |
| 2.3.3 基于OTU的肠道细菌群落结构分析 |
| 2.3.4 不同部位间差异菌种分析 |
| 2.3.5 PICRUSt基因功能预测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 蒙古马胃肠道中细菌群落组成与食草特性 |
| 2.4.2 蒙古马胃肠道中细菌群落的多样性与抗病性 |
| 2.4.3 蒙古马胃肠道中细菌群落的功能分析 |
| 2.5 小结 |
| 3 蒙古马盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定及生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 样品采集 |
| 3.2.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2.3 培养基和试剂的配制 |
| 3.2.4 纤维素分解菌的分离和筛选 |
| 3.2.5 CMCase(羧甲基纤维素酶)活力的测定 |
| 3.2.6 纤维素分解菌的种属鉴定 |
| 3.2.7 纤维素分解菌的生长曲线 |
| 3.2.8 纤维素分解菌的酶学分析 |
| 3.2.9 数据的整理与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 葡萄糖标准曲线的制作 |
| 3.3.2 纤维素分解菌的分离及筛选 |
| 3.3.3 纤维素分解菌的形态学和生理生化鉴定 |
| 3.3.4 16S rDNA PCR及测序鉴定 |
| 3.3.5 纤维素分解菌的生长特性 |
| 3.3.6 纤维素分解菌产纤维素酶的酶学特性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 纤维素分解菌的分离和鉴定 |
| 3.4.2 Bacillus amylolquefaciens C14的生长特性 |
| 3.4.3 pH值对纤维素酶活性的影响 |
| 3.4.4 温度对纤维素酶活性的影响 |
| 3.5 小结 |
| 4 蒙古马源Bacillus amyloliquefaciens C14纤维素酶基因的克隆与密码子优化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2.3 培养基和试剂的配制 |
| 4.2.4 纤维素酶基因的克隆 |
| 4.2.5 纤维素酶基因的蛋白质序列分析及密码子优化 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Bacillus amyloliquefaciens C14纤维素酶eg1-BA基因的克隆 |
| 4.3.2 纤维素酶基因eg1-BA的DNA序列分析 |
| 4.3.3 纤维素酶基因eg1-BA的蛋白质序列基本性质分析 |
| 4.3.4 蛋白质结构功能域预测及motif搜索 |
| 4.3.5 蛋白质空间结构预测 |
| 4.3.6 纤维素酶基因eg1-BA的密码子优化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 纤维素酶基因的克隆 |
| 4.4.2 纤维素酶蛋白的结构预测 |
| 4.4.3 纤维素酶基因的密码子优化 |
| 4.5 小结 |
| 5 表达纤维素酶eg1-BA的双筛选标记的食品级表达载体的构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 载体 |
| 5.2.3 主要试剂及仪器 |
| 5.2.4 培养基和试剂的配制 |
| 5.2.5 细菌基因组DNA和质粒的提取 |
| 5.2.6 启动子p32、信号肽usp45基因序列的克隆 |
| 5.2.7 含有启动子p32和信号肽usp45的pMG36e表达载体的改造 |
| 5.2.8 含有p32+usp45片段的pMG36e表达载体的构建 |
| 5.2.9 植物乳杆菌melA基因为筛选标记的表达载体构建 |
| 5.2.10 NisI和melA基因为双筛选标记的表达载体的构建 |
| 5.2.11 双筛选标记分泌型表达载体的构建 |
| 5.2.12 me1A(半乳糖苷酶)基因作为筛选标记物活性检测 |
| 5.2.13 乳酸乳球菌MG1363和粪肠球菌19855抗Nisin敏感实验 |
| 5.2.14 食品级双筛选标记分泌型表达载体的构建 |
| 5.2.15 表达纤维素酶eg1-BA的双筛选标记食品级表达载体的构建 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 微生物基因组和质粒的提取 |
| 5.3.2 启动子p32、信号肽usp45基因的克隆 |
| 5.3.3 含有启动子p32和信号肽usp45的pMG36e表达载体的改造 |
| 5.3.4 melA基因为筛选标记的食品级表达载体的构建 |
| 5.3.5 melA和NisI基因为双筛选标记的表达载体构建 |
| 5.3.6 melA基因作为筛选标记物活性检测 |
| 5.3.7 乳酸乳球菌MG1363和粪肠球菌19855抗Nisin敏感实验 |
| 5.3.8 食品级双筛选标记分泌型表达载体的构建 |
| 5.3.9 表达纤维素酶eg1-BA的双筛选标记食品级载体的构建 |
| 5.3.10 粪肠球菌中纤维素酶活测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 乳酸菌作为宿主菌的优势 |
| 5.4.2 基因工程重组乳酸菌 |
| 5.5 小结 |
| 6 全文讨论 |
| 7 结论、创新性及工作展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新性 |
| 7.3 工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）卤醇脱卤酶的分子改造及在不对称合成手性环氧氯丙烷中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环氧氯丙烷的概述 |
| 1.2 手性ECH的制备方法 |
| 1.2.1 手性ECH的化学法制备 |
| 1.2.2 手性ECH的生物法制备 |
| 1.3 卤醇脱卤酶简介 |
| 1.3.1 卤醇脱卤酶的分类 |
| 1.3.2 卤醇脱卤酶的结构及催化机制 |
| 1.3.3 卤醇脱卤酶制备光学纯手性ECH |
| 1.3.4 卤醇脱卤酶的分子改造 |
| 1.4 本论文的研究目的及意义 |
| 第二章 卤醇脱卤酶的分子改造 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株来源 |
| 2.2.2 培养基及溶液配制 |
| 2.2.3 主要工具酶与化学试剂 |
| 2.2.4 主要实验仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 卤醇脱卤酶HheC_(PS)三维结构模型的建立及关键突变氨基酸残基的选择 |
| 2.3.2 菌种的活化、培养及诱导表达 |
| 2.3.3 重组质粒的提取 |
| 2.3.4 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变文库的构建及筛选 |
| 2.3.5 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备及化学转化 |
| 2.3.6 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变文库筛选及活性检测 |
| 2.3.7 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变体对(S)-ECH稳定性探究 |
| 2.3.8 产物检测及计算方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 卤醇脱卤酶HheC_(PS)同源建模及关键氨基酸残基的选择 |
| 2.4.2 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变文库的构建 |
| 2.4.3 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变文库的筛选 |
| 2.4.4 关键位点氨基酸定点饱和突变及催化特性比较 |
| 2.4.5 卤醇脱卤酶HheC_(PS)离子通道处蛋白迭代饱和突变 |
| 2.4.6 卤醇脱卤酶HheC_(PS)突变体对(S)-ECH稳定性探究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 卤醇脱卤酶突变体的酶学性质及催化过程研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌种与培养基 |
| 3.2.2 溶液配制 |
| 3.2.3 主要实验试剂 |
| 3.2.4 实验仪器和设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体粗酶液的制备 |
| 3.3.2 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体蛋白纯化 |
| 3.3.3 SDS-PAGE蛋白电泳 |
| 3.3.4 蛋白质浓度的测定 |
| 3.3.5 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体动力学参数测定 |
| 3.3.6 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体合成(S)-ECH过程比较 |
| 3.3.7 蛋白二级结构的检测方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体的纯化和SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.4.2 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体正反应动力学分析 |
| 3.4.3 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体逆反应动力学分析 |
| 3.4.4 卤醇脱卤酶HheC_(PS)及其突变体合成手性ECH过程探究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 卤醇脱卤酶突变体催化机理的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 过程与方法 |
| 4.2.1 3D结构模型化及评估 |
| 4.2.2 卤醇脱卤酶突变体蛋白内部通道分析 |
| 4.2.3 卤醇脱卤酶与底物及产物分子对接 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 4.3.1 同源建模及评估 |
| 4.3.2 反应动力学调控策略制备光学纯(S)-ECH |
| 4.3.3 底物构象调整策略制备光学纯(S)-ECH |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 3 发明专利 |
| 学位论文数据集 |
（7）海参i-型溶菌酶基因工程菌的发酵及产品特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 溶菌酶简述 |
| 1.1.2 溶菌酶的结构性质及催化机制 |
| 1.1.3 溶菌酶的生物学功能 |
| 1.2 溶菌酶的分类 |
| 1.2.1 动物溶菌酶 |
| 1.2.2 植物溶菌酶 |
| 1.2.3 细菌和真菌溶菌酶 |
| 1.2.4 噬菌体溶菌酶 |
| 1.3 溶菌酶的应用 |
| 1.3.1 溶菌酶在食品领域的应用 |
| 1.3.2 溶菌酶在医疗领域的应用 |
| 1.3.3 溶菌酶在生物学领域的应用 |
| 1.4 溶菌酶的分离纯化 |
| 1.4.1 亲和层析法 |
| 1.4.2 超滤法 |
| 1.4.3 膜色谱法 |
| 1.5 分子动力学模拟 |
| 1.5.1 分子动力学的发展 |
| 1.5.2 GROMACS简介及特点 |
| 1.5.3 分子动力学模拟的应用 |
| 1.6 研究目的和内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究目的和内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料及方法 |
| 2.1.1 实验菌株 |
| 2.1.2 实验药品与试剂 |
| 2.1.3 常用缓冲液及培养基 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 5L发酵罐发酵培养 |
| 2.2.1 菌种活化及种子液培养 |
| 2.2.2 发酵罐灭菌及电极标定 |
| 2.2.3 发酵罐中培养基接种 |
| 2.2.4 细发酵罐中菌体培养及中间补料 |
| 2.2.5 发酵罐中产物诱导发酵 |
| 2.3 海参i-型溶菌酶的分离纯化 |
| 2.4 发酵表达产物的分析 |
| 2.4.1 TCA法沉淀蛋白 |
| 2.4.2 SDS-PAGE凝胶配制 |
| 2.4.3 凝胶电泳法 |
| 2.4.4 抑菌活性法 |
| 2.4.5 溶菌酶酶活力检测 |
| 2.4.6 高效液相与MALDI-TOF质谱分析法 |
| 2.5 海参i-型溶菌酶特性分析 |
| 2.5.1 海参i-型溶菌酶最适pH的确定 |
| 2.5.2 海参i-型溶菌酶的pH稳定性 |
| 2.5.3 海参i-型溶菌酶最适温度的确定 |
| 2.5.4 海参i-型溶菌酶的热稳定性 |
| 2.6 分子动力学模拟 |
| 2.6.1 蛋白质分子结构准备 |
| 2.6.2 分子动力学模拟方法及过程 |
| 2.6.3 分子动力学结果分析 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 5L发酵罐培养 |
| 3.1.1 发酵过程及工艺参数的控制 |
| 3.1.2 发酵过程中菌体量及酶活力检测 |
| 3.1.3 不同时期诱导产物的SDS-PAGE分析 |
| 3.1.4 发酵产品分离和纯化 |
| 3.2 海参i-型溶菌酶产品分析 |
| 3.2.1 抑菌活性分析 |
| 3.2.2 高效液相色谱分析 |
| 3.2.3 MALDI-TOF质谱结果分析 |
| 3.3 海参i-型溶菌酶的生物信息学分析 |
| 3.3.1 海参i-型溶菌酶一级结构分析 |
| 3.3.2 海参i-溶菌酶亲水性和疏水性分析 |
| 3.3.3 海参i-型溶菌酶二级结构分析 |
| 3.3.4 海参i-型溶菌酶蛋白三级结构分析 |
| 3.4 海参i-性溶菌酶特性分析 |
| 3.4.1 最适pH及其稳定性的确定 |
| 3.4.2 最适温度及其热稳定性的确定 |
| 3.4.3 分子动力学模拟结果分析 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 展望 |
| 参考文献 |
| 研究生期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）纤维素酶基因的研究进展（论文提纲范文）
| 1 纤维素酶研究进展 |
| 1.1 纤维素酶简介 |
| 1.1.1 内切葡聚糖酶 |
| 1.1.2 外切葡聚糖酶 |
| 1.1.3 β-葡萄糖苷酶 |
| 1.2 纤维素酶的应用 |
| 1.2.1 食品工业的应用 |
| 1.2.2 饲料工业的应用 |
| 1.2.3 其他方面的应用 |
| 2 纤维素酶及其基因的研究进展 |
| 2.1 纤维素酶的研究概况 |
| 2.1.1 国外研究 |
| 2.1.2 国内研究 |
| 2.2 纤维素酶基因的研究现状 |
| 3 纤维素酶基因工程的研究进展 |
| 3.1 纤维素酶基因克隆 |
| 3.2 纤维素酶基因原核表达系统 |
| 3.3 纤维素酶基因真核表达系统 |
| 4 总结 |
（9）酶法制备D-丙氨酸研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 D-丙氨酸概述 |
| 1.1.1 D-丙氨酸理化性质 |
| 1.1.2 D-丙氨酸应用 |
| 1.1.3 D-丙氨酸的制备方法 |
| 1.2 生物酶 |
| 1.2.1 天冬氨酸消旋酶 |
| 1.2.2 D-氨基酸转氨酶 |
| 1.3 多酶联合催化反应体系 |
| 1.3.1 多酶偶联反应 |
| 1.3.2 多酶级联反应 |
| 1.4 大肠杆菌蛋白表达系统及其应用 |
| 1.5 毕赤酵母蛋白表达系统及其应用 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 原核表达AspR和DaaT级联制备D-丙氨酸 |
| 第一节 AspR和DaaT原核工程菌构建 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 AspR和DaaT级联反应制备D-丙氨酸 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 酵母表达AspR和DaaT偶联反应制备D-丙氨酸 |
| 第一节 AspR和DaaT酵母工程菌的构建和筛选 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 AspR和DaaT偶联反应制备D-丙氨酸 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.3 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 一种高效制备D-丙氨酸的新工艺 |
| 第一节 天冬氨酸消旋酶工程菌发酵优化 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 结论 |
| 第二节 D-氨基酸转氨酶工程菌发酵优化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三节 一种高效制备的D-丙氨酸的新工艺 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.3 结论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 攻读硕士学位期间发表论文与申请专利 |
| 致谢 |
（10）纤维素酶基因优化及在植物乳酸杆菌中的表达（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 纤维素资源概述 |
| 1.1 纤维素资源现状 |
| 1.2 纤维素的理化特性 |
| 2 纤维素酶研究进展 |
| 2.1 纤维素酶的微生物来源 |
| 2.2 纤维素酶的理化性质 |
| 2.3 纤维素酶的作用机理 |
| 2.4 纤维素酶的克隆及外源表达 |
| 3 DNA改组研究进展 |
| 3.1 DNA改组的基本原理 |
| 3.2 DNA改组技术的特点 |
| 3.2.1 DNA改组技术可在短时间内实现蛋白质分子的定向进化 |
| 3.2.2 DNA改组技术提高了分子进化的成功率 |
| 3.2.3 DNA改组对筛选技术的要求较高 |
| 4 乳酸杆菌表达系统 |
| 5 本试验目的和意义 |
| 第二章 康氏木霉及黑曲霉中CBHⅠ基因的克隆及鉴定 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 方法和步骤 |
| 1.5.1 引物设计 |
| 1.5.2 康氏木霉及黑曲霉中总RNA的提取 |
| 1.5.3 纤维素酶基因的RT-PCR |
| 1.5.3.1 纤维素酶基因的c DNA文库建立 |
| 1.5.3.2 纤维素酶基因的PCR扩增 |
| 1.5.4 RT-PCR产物的纯化与回收 |
| 1.5.5 纤维素酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 1.5.6 连接产物的转化 |
| 1.5.7 阳性克隆子的筛选与鉴定 |
| 1.5.7.1 蓝白斑筛选 |
| 1.5.7.2 重组质粒提取 |
| 1.5.7.3 重组质粒的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 康氏木霉及黑曲霉中总RNA的提取 |
| 2.2 纤维素酶基因RT-PCR的扩增结果 |
| 2.3 重组质粒的蓝白斑筛选 |
| 2.4 纤维素酶基因重组克隆的鉴定 |
| 2.5 纤维素酶基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 纤维素酶CBHⅠ基因的DNA改组 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种与质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 试验方法和步骤 |
| 1.5.1 基因准备 |
| 1.5.2 纤维素酶基因的片段化 |
| 1.5.2.1 DnaseⅠ内切酶反应条件的确定 |
| 1.5.2.2 基因片段化 |
| 1.5.3 无引物PCR |
| 1.5.4 有引物PCR |
| 1.5.5 改组纤维素酶基因与pMD19-T载体的连接 |
| 1.5.6 连接产物的转化 |
| 1.5.7 重组质粒提取和序列测定 |
| 1.5.8 改组纤维素酶基因序列对比和分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 康氏木霉和黑曲霉纤维素酶基因准备 |
| 2.2 纤维素酶基因片段化 |
| 2.3 纤维素酶基因片段化的无引物PCR |
| 2.4 纤维素酶基因片段化的有引物PCR |
| 2.5 改组纤维素酶基因序列分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 纤维素酶CBHⅠ改组基因真核表达载体的构建 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 表达质粒pMG36e的图谱 |
| 1.5 培养基和溶液 |
| 1.6 方法和步骤 |
| 1.6.1 改组纤维素酶基因及真核表达载体p MG36e质粒的纯化和回收 |
| 1.6.2 改组纤维素酶基因与真核表达载体pMG36e质粒的连接 |
| 1.6.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α及重组转化子的筛选 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组克隆的构建结果 |
| 2.2 重组表达载体pMG36e-CBHⅠ的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 纤维素酶CBHⅠ改组基因在植物乳酸杆菌中的表达 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试验菌种和质粒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 培养基和溶液 |
| 1.5 方法和步骤 |
| 1.5.1 乳酸菌感受态的制备 |
| 1.5.2 pMG36e-CBHⅠ电转化植物乳杆菌 |
| 1.5.3 利用菌液PCR检测转化的乳酸菌 |
| 1.5.4 SDS-PAGE检测目的蛋白 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 红霉素抗性筛选结果 |
| 2.2 菌落PCR检测结果 |
| 2.3 蛋白电泳检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 重组植物乳酸杆菌产酶能力及酶活性质研究 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 培养基和溶液 |
| 1.3 方法和步骤 |
| 1.3.1 重组植物乳杆菌纤维素酶活性的测定 |
| 1.3.1.1 粗酶液的制备 |
| 1.3.1.2 纤维素酶活力测定 |
| 1.3.2 重组植物乳杆菌产纤维素酶酶学性质分析 |
| 1.3.2.1 纤维素酶最适反应温度的测定 |
| 1.3.2.2 纤维素酶最适反应pH的测定 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组植物乳杆菌纤维素酶活性测定结果 |
| 2.1.1 滤纸酶测定结果 |
| 2.1.2 pH变化曲线 |
| 2.2 改组纤维素酶酶学性质分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
四、酶基因工程的研究现状及进展（论文参考文献）
- [1]重组微生物修复 U（Ⅵ）污染的研究进展[J]. 王超,徐静. 山东化工, 2021(16)
- [2]阿魏酸酯酶在毕赤酵母中的异源表达及酶学特性分析[D]. 王婕妤. 江南大学, 2021(01)
- [3]P450单加氧酶催化拆分2-取代-1,2,3,4-四氢喹啉的研究[D]. 刘婉颐. 遵义医科大学, 2020(01)
- [4]隆线溞和老年低额溞几丁质酶重组蛋白的抗体制备与应用[D]. 郑佳豪. 浙江大学, 2020(01)
- [5]蒙古马胃肠道细菌群落组成及纤维素分解菌的研究[D]. 苏少锋. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [6]卤醇脱卤酶的分子改造及在不对称合成手性环氧氯丙烷中的应用[D]. 邓涵中. 浙江工业大学, 2019(02)
- [7]海参i-型溶菌酶基因工程菌的发酵及产品特性分析[D]. 马锁. 大连工业大学, 2019(08)
- [8]纤维素酶基因的研究进展[J]. 王伟,王永花. 山东畜牧兽医, 2019(02)
- [9]酶法制备D-丙氨酸研究[D]. 张卫卫. 南京大学, 2017(01)
- [10]纤维素酶基因优化及在植物乳酸杆菌中的表达[D]. 王秋文. 河南农业大学, 2016(05)