一、MOLECULAR CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-4 GENE（论文文献综述）
孙加雯[1]（2021）在《外周血差异表达的miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍发病机制中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的1.基于生物信息学探寻ADHD（Attention Deficit Hyperactive Disorder,ADHD）患儿外周血差异表达miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍的可能作用途径。2.观察ADHD模型SHR（Spontaneously Hypertensive Rat）大鼠及对照WKY（Wistar Kyoto）大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF表达水平的差异。3.外周循环差异表达的miR-30d-5p作用于BDNF（Brain–derived neurotrophic-factor）调控ADHD行为变化的研究。方法1.在前期的研究中本课题组发现miRNA在ADHD的发病机制中具有重要的作用,之后本课题组收集了20例ADHD患儿和60名健康对照儿童的血清样本,通过miRNA芯片筛选出了表达差异有统计学意义的miRNA,其中miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641,fold change﹥2倍,且经实时荧光定量PCR验证差异显着。2.通过生物信息网站中miRNA数据库对miR-30d-5p的靶基因进行预测,将各个miRNA数据库预测靶基因取交集后,使用生物信息学软件对miR-30-5p的靶基因进行GO富集和KEGG富集分析,并构建关键基因的蛋白互作网络（PPI）,进而筛选出前10位关键基因（hub gene）。3.通过ADHDgene数据库获取ADHD相关基因,基于miR-30d-5p靶基因的PPI构建ADHD相关基因的PPI,并与miR-30d-5p靶基因中的关键基因进行分析,找出其可能作用最大的靶基因。4.比较WKY和SHR大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF表达水平差异。取PFC脑组织,RT-q PCR（荧光定量聚合链式反应）检测miR-30d-5p的表达差异,同时分别在mRNA和蛋白水平检测BDNF的表达量。5.体外分别转染miR-30d-5p过表达质粒和腺相关病毒载体,收集细胞检测BDNF在mRNA和蛋白水平的表达变化。6.SHR大鼠PFC注射腺相关病毒miR-30d-5p载体,通过旷场实验和迷宫实验观察SHR大鼠ADHD样行为变化;取PFC脑组织,分别在mRNA和蛋白水平检测BDNF的表达量。结果:1.在Target Scan7.2数据库中获得miR-30d-5p预测靶基因1 579个,miRDB数据库中1539个,miRTar Base数据库中369个。取三个数据库的两两交集去掉重复后共有1 142个靶基因纳入研究。2.对筛选出的1142个靶基因进行GO功能富集分析显示:靶基因定位到核质、细胞内细胞器、轴突、细胞膜等细胞结构,并在神经系统中广泛参与到神经元的发育、分化、神经元发生的调节、神经元投射发育、顺式调控区结合及顺式调控区序列特异性DNA结合等生物学过程;KEGG信号通路富集显示:靶基因主要富集在Fox O信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路这4条通路中。3.通过生信相关软件构建miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI,并筛选出了前10位关键基因:NOTCH1、KRAS、SIRT1、MAPK8、SOCS3、NEDD4、SKP2、BDNF、NEDD4L、SOCS1。4.与ADHDgene数据库中基因对比发现,靶基因中有33个基因与ADHD的发病机制相关。基于miR-30d-5p靶基因蛋白的PPI构建33个靶基因PPI网络图。筛选出的关键基因中的BDNF可能为miR-30d-5p作用的ADHD发病机制相关的基因。5.SHR大鼠PFC（prefrontal cortex）中miR-30d-5p和BDNF在mRNA和蛋白表达水平明显低于WKY大鼠。细胞实验中转染miR-30d-5p过表达质粒和腺相关病毒后,BDNF较对照组升高。6.注射miR-30d-5p病毒载体组大鼠在旷场实验和迷宫实验中,多动症状和注意力表现明显好于对照组。对注射转染组和对照组的PFC检测发现,与对照组相比,转染组大鼠PFC中miR-30d-5p和BDNF的表达水平明显升高,与体外细胞实验结果一致。结论1.miR-30d-5p在ADHD患儿外周血清中差异表达显着,具有作为ADHD诊断生物标记物的潜力。2.通过生物信息学分析和实验验证发现miR-30d-5p在ADHD中直接或间接作用于BDNF基因参与注意缺陷多动障碍疾病的发生发展。
贾玉峰[2]（2021）在《以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究》文中研究指明研究背景抑郁症（Depression）是一种常见并且严重的神经障碍类疾病,临床表现为持续的情绪低落、思维迟缓和生活无意义感。而重症抑郁症患者甚至会产生自杀的倾向,严重危害人类健康。目前抑郁症的治疗主要以药物缓解为主,已有的抗抑郁药物（选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）再摄取抑制剂）主要通过提升突触间隙兴奋性神经递质的浓度发挥抗抑郁作用。但普遍存在见效时间长、副作用大以及人群药物敏感性差异大等问题。因此,揭示新的抑郁症发病机制和寻找新靶标,对抗抑郁药物研发和疾病的治疗有重要价值。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4,PDCD4）是一个重要的蛋白质翻译抑制因子。已有研究表明PDCD4直接或间接调控细胞约1/3蛋白的表达,参与细胞因子表达调控及细胞生长、代谢等多个过程。我们实验室长期从事PDCD4与疾病的关系和分子机制研究,已发现PDCD4可通过负向调控不同的靶分子参与肿瘤、脂质代谢（动脉粥样硬化和肥胖）等多种疾病的发生与发展。更重要的是最近我们意外发现PDCD4与抑郁症的发生密切相关:1)PDCD4在抑郁症病人海马脑区（hippocampus,HIP）高表达,慢性束缚应激（chronic restraint stress,CRS）诱导抑郁症时可上调小鼠HIP中PDCD4的表达;2)PDCD4敲除小鼠能够抵抗CRS诱导的抑郁样行为,而于HIP过表达PDCD4,小鼠可出现自发性抑郁样行为;3)分子机制探索中我们发现PDCD4主要通过结合蛋白质翻译起始因子4A（eukaryotic initiation factor4A,eIF4A）进而抑制脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）翻译的起始促进抑郁症的发展。这些结果表明PDCD4是诱导抑郁症发生的新基因,可能成为抗抑郁药物研发的新靶点并为新型抗抑郁药物的设计和研究奠定理论基础。本文的目的是在已有研究的基础上,以PDCD4为靶点、以PDCD4调控BDNF表达的分子机制为理论基础。利用小干扰RNA沉默PDCD4表达、利用干扰肽和小分子化合物干扰PDCD4与下游靶基因的相互作用。设计、筛选和制备相关药物并通过体外细胞模型和CRS诱导的小鼠抑郁模型,分析这些候选药物对PDCD4下游靶分子BDNF表达的影响以及在抑郁症治疗中的作用,为新型抗抑郁药物的研发奠定基础。本项目的研究内容包括以下三个方面:一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究;二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究;三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究。研究方法一、PDCD4特异性小干扰RNA（siPdcd4）制备、修饰及抗抑郁作用研究1.PDCD4小干扰RNA的制备及其对神经细胞BDNF表达影响（1）筛选PDCD4的特异性小干扰RNA（siPdcd4）,转染细胞,采用RT-PCR和免疫印迹检测siPdcd4的沉默效率;（2）脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,24h后免疫印迹检测其对PDCD4下游靶基因BDNF表达的影响。2.探究PDCD4小干扰RNA对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响（1）脂质体法将siPdcd4转染至小胶质细胞,24h后添加LPS和ATP刺激,收取不同时间梯度的细胞培养上清和总RNA;（2）RT-PCR和ELISA检测siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子（IL-6、IL-1β）表达的影响。3.siPdcd4神经靶向修饰和干扰效率检测（1）合成狂犬病毒糖蛋白靶向运输多肽（RVG-9dR）;（2）体外将Cy5荧光素标记的siPdcd4（Cy5-siPdcd4）进行神经靶向运输修饰（RVG/Cy5-siPdcd4）;（3）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞,高内涵成像检测红色荧光信号在细胞内的分布;（4）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞48h后,RT-PCR和免疫印迹检测神经细胞中PDCD4表达变化。4.神经细胞mTORC1失活时RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响（1）mTORC1特异性抑制剂rapamycin阻断神经细胞mTORC1信号通路,免疫印记检测不同时间梯度BDNF和PDCD4表达的变化;（2）RVG/siPdcd4沉默神经细胞内源性PDCD4,24h后,添加rapamycin阻断mTORC1信号通路,免疫印迹检测RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响。5.检测RVG/siPdcd4能否跨过血脑屏障靶向入脑及对PDCD4和BDNF表达的影响（1）将50μg RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,6h、24h、48h、和72h分别通过小动物活体成像系统检测红色荧光在体内的分布;（2）RT-PCR和免疫印迹检测海马区和前额叶皮质PDCD4的沉默效率和BDNF表达变化;（3）RVG/siPdcd4浓度梯度实验,通过PDCD4的沉默效率和BDNF的表达变化确定体内实验最优RVG/siPdcd4使用浓度。6.行为学评价RVG/siPdcd4对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。将RVG/siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,RT-PCR检测海马区和前额叶皮质中PDCD4的沉默效率,免疫印迹和ELISA检测海马中BDNF表达的变化;（2）ELISA检测海马和外周血中炎性细胞因子表达的变化,明确RVG/siPdcd4对抑郁症炎性水平的影响;（3）脑组织进行高尔基染色,通过神经元树突棘密度评价神经突触可塑性的改变;（4）通过悬尾实验、强迫游泳实验和蔗糖水偏好实验评价RVG/siPdcd4对小鼠抑郁样行为的影响。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究1.筛选特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的氨基酸序列（1）构建 eIF4A-HA、PDCD4-FLAG 和 BDNF-GFP 过表达载体;（2）查阅文献和蛋白结构数据库找到PDCD4与eIF4A相互作用的关键氨基酸位点及主要作用结构域（氨基酸序列）;（3）利用分子克隆构建关键结构域（氨基酸序列）与GFP的融合蛋白表达载体;（4）通过免疫共沉淀和免疫印迹实验,筛选能够特异性干扰PDCD4与eIF4A结合并且上调BDNF的表达的结构域（氨基酸序列）;（5）将筛选的氨基酸序列与跨膜序列相偶联（N端）,合成相应的干扰多肽。2.干扰多肽对PDCD4与eIF4A结合的影响（1）免疫荧光实验检测干扰多肽的跨膜效率、细胞内稳定性以及与PDCD4蛋白的结合情况;（2）免疫共沉淀及双荧光分子互补实验,检测干扰多肽对PDCD4和eIF4A结合的影响。3.干扰多肽对BDNF表达的影响（1）将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP共同过表达于HEK-293细胞,免疫印迹检测干扰多肽对BDNF表达的影响;（2）免疫印迹及ELISA实验检测干扰多肽对神经细胞BDNF表达的影响;（3）ELISA检测神经细胞培养上清中分泌性BDNF和炎性细胞因子表达的变化。4.神经细胞mTORC1失活时干扰多肽对BDNF表达的影响在原代海马神经元mTORC1信号通路完全阻断的情况下,免疫印迹检测干扰多肽对神经元内源性BDNF表达的影响。5.海马定点注射干扰多肽对CRS诱导的焦虑及抑郁样行为的影响（1）野生型4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠,慢性束缚应激诱导抑郁模型;（2）根据小鼠冠状脑图谱,于海马脑区腹侧埋下微型给药管,免疫荧光检测干扰多肽在海马组织中的扩散情况;（3）于抑郁小鼠海马区定点注射干扰多肽,治疗完成后免疫印迹实验和ELISA检测BDNF表达的变化;（4）小鼠脑组织进行高尔基染色,统计分析海马神经元轴突树突棘密度,评价干扰多肽对神经突触可塑性的影响;（5）干扰多肽治疗结束后进行行为学检测,评价干扰多肽对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究1.PDCD4配体小分子的筛选基于高斯过程的定量结构-活性关系回归预测（Gaussian process-based QSAR）在类药物生物源化合物文库中进行高通量虚拟筛选。根据与靶蛋白的主要结合位置,筛选在微摩尔水平上与PDCD4蛋白具有高或中等亲和力的小分子化合物。2.PDCD4配体小分子功能检测（1）免疫共沉淀实验检测PDCD4配体小分子对PDCD4与eIF4A结合的影响;（2）免疫印迹实验检测PDCD4配体小分子对神经细胞BDNF表达的影响;（3）将PDCD4-FALG和BDNF-GFP过表达载体共同转染至HEK-293细胞,免疫印迹检测PDCD4过表达时PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响;（4）免疫印迹检测神经细胞mTORC1失活时PDCD4配体小分子对BDNF的表达影响。3.PDCD4配体小分子对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型,将不同浓度的PDCD4配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内。免疫印迹实验和ELISA检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质BDNF表达的变化;（2）脑组织进行高尔基染色,通过神经元轴突树突棘密度评价神经突触可塑性的变化;（3）对小鼠进行行为学检测评价PDCD4配体小分子对抑郁样行为的影响。结果一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究前期研究结果显示抑郁症患者海马区PDCD4表达升高,于海马区过表达PDCD4后野生型小鼠出现自发抑郁样行为。而PDCD4敲除小鼠则完全抵抗慢性束缚应激导致的抑郁行为的产生,提示PDCD4是治疗抑郁症的重要靶点。为此,本部分利用PDCD4小干扰RNA干扰中枢神经系统PDCD4的表达,研究其抑郁症的治疗效应。（一）siPdcd4干扰效率检测及其对PDCD4下游靶基因表达的影响（1）首先通过对PDCD4的mRNA核酸序列进行分析,从核酸数据库筛选、合成了 PDCD4小干扰RNA（siPdcd4）,并通过细胞学实验证明能有效沉默PDCD4的表达。（2）siPdcd4对BDNF表达的影响:通过脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,免疫印迹实验检测siPdcd4对下游靶基因BDNF表达的影响。结果显示siPdcd4沉默PDCD4后可明显上调神经细胞BDNF的表达。（3）siPdcd4对炎性细胞因子表达的影响:PDCD4不仅可抑制BDNF,而且可负向调控促炎性细胞因子的表达。因此,我们进一步探究siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响,结果显示siPdcd4能够明显抑制LPS和ATP刺激诱导的IL-6和IL-1β的表达。（二）siPdcd4神经细胞靶向修饰及特异性检测（1）siPdcd4神经细胞靶向修饰:为了解决siPdcd4静脉注射不能通过血脑屏障入脑的技术瓶颈,我们合成了嗜神经的狂犬病毒糖蛋白多肽（RVG-9dR）。已经证明RVG-9dR多肽的9个D-精氨酸通过电荷相吸与siPdcd4结合,能够对siPdcd4进行神经靶向修饰（RVG/siPdcd4）。另外,为了便于体内示踪,采用Cy5荧光素（红色）对siPdcd4进行了标记（Cy5-siPdcd4）,制备了既具有神经特异性又可示踪的RVG/Cy5-siPdcd4复合物。（2）RVG/siPdcd4神经细胞靶向的特异性检测:为了检测RVG-9dR修饰后的siPdcd4（RVG/siPdcd4）神经靶向特异性,我们用RVG/Cy5-siPdcd4分别去处理具有乙酰胆碱受体的神经细胞（SH-SY5Y、HT-22）和小胶质细胞（BV2）以及不表达乙酰胆碱受体的非神经细胞Hela。通过高内涵成像系统检测Cy5-siPdcd4在细胞的分布,结果显示,神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2的细胞浆中均能够观察到带红色荧光的siPdcd4,而非神经细胞HeIa的细胞浆中无明显红色荧光信号。（3）沉默效率检测:RT-PCR和免疫印迹结果显示RVG/siPdcd4能够在转录和翻译水平沉默神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2内源性PDCD4的表达,而对非神经细胞HeIa的PDCD4无明显沉默作用。以上结果表明,RVG-9dR多肽修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）特异性进入神经细胞并且沉默PDCD4的表达。（三）RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用我们前期机制研究发现,抑郁症时脑内PDCD4表达升高是由于mTORC1活性降低导致PDCD4磷酸化-泛素化降解途径受阻的结果。故我们用mTORC1特异性抑制剂rapamycin去抑制海马神经元细胞HT-22和小胶质细胞BV2的mTORC1活性,建立模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。我们发现与体内结果一致mTORC1被抑制后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。在相同的实验体系下,我们发现RVG/siPdcd4能够逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（四）RVG/siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑为了检测RVG-9dR能否携带siRNA跨过血脑屏障。我们将RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,通过活体成像系统进行体内示踪。结果显示6h时RVG/Cy5-siPdcd4已经由外周输运至脑组织但是进入剂量较少,此时Cy5-siPdcd4主要存在于小鼠的腹部。而24h时RVG/Cy5-siPdcd4则主要聚集于脑内,腹部无明显荧光。48h时脑内红色荧光依然存在但是与24h相比明显减弱。72h时脑内无可检测到的红色荧光信号。上述结果提示RVG/Cy5-siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑并且具有良好的稳定性。与此同时,在RVG/siPdcd4注射48h后通过RT-PCR和免疫印迹实验检测了海马和前额叶皮质中BDNF的表达变化。结果显示RVG/siPdcd4注射至小鼠体内通过沉默海马和前额叶皮质中的PDCD4上调BDNF的表达。（五）静脉注射RVG/siPdcd4可治疗慢性束缚应激诱导的抑郁症为了探究RVG/siPdcd4对抑郁症的治疗效果,慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。诱导成功后通过尾静脉注射RVG/siPdcd4进行抗抑郁治疗:（1）RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,RVG/siPdcd4能有效沉默抑郁小鼠海马和前额叶皮质中的PDCD4、降低促炎性细胞因子IL-6和IL-1 β表达并显着提升BDNF的表达;（2）脑组织高尔基染色实验结果显示,RVG/siPdcd4可增加海马神经元轴突树突棘的密度,改善神经突触可塑性;（3）行为学检测结果表明,RVG/siPdcd4能够降低悬尾实验、强迫游泳实验小鼠的不动时间,增加抑郁小鼠的蔗糖水偏好指数。以上结果表明,RVG/siPdcd4通过沉默PDCD4、抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达、上调BDNF的表达和修复神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究前期机制的探索发现PDCD4通过结合eIF4A进而抑制BDNF的翻译促进抑郁症的发展。提示,如果干扰PDCD4和eIF4A的结合将解除PDCD4对BDNF的抑制作用进而治疗抑郁症。因此本部分根据PDCD4和eIF4A结合的位点筛选能够干扰二者相互作用的干扰多肽并对其抗抑郁作用进行研究。（一）eIF4A结合PDCD4关键序列的筛选通过分析已有的研究结果我们发现eIF4A的P56、K83、G137、T159和R360是eIF4A与PDCD4结合的关键氨基酸位点。根据氨基酸位点所在位置我们设计了4段可能结合PDCD4的序列,分别命名为eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI。为了验证各个氨基酸序列的功能,我们构建了 eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI与GFP的融合蛋白表达载体,采用免疫共沉淀和免疫印迹实验确定这些基序对PDCD4与eIF4A结合的影响。结果显示,eIF4A-VI干扰PDCD4与eIF4A结合的能力最强,并且能明显上调BDNF的表达。而eIF4A-Q、eIF4A-l和eIF4A-la虽然能够干扰PDCD4与eIF4A的结合,但是对BDNF的表达有明显的抑制作用。因此,eIF4A-VI成为后续研究的候选序列。（二）eIF4A-VI的跨膜修饰及其对PDCD4与eIF4A结合的影响由于PDCD4与eIF4A的结合主要发生于细胞浆内。为了使筛选的序列进入细胞发挥作用,将具有跨膜效应的9个精氨酸（9 Arginine）偶联在eIF4A-VI的N端,合成了具有跨膜特性的9R-eIF4A-VI干扰多肽。另外,为了证明9R-eIF4A-VI干扰多肽的特异性,我们将363号氨基酸由R363突变为Q363合成了突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI作为对照。免疫荧光结果表明,干扰多肽能在1h内跨过细胞膜进入细胞浆并在细胞内能够稳定存在48h,进一步研究发现9R-eIF4A-VI干扰多肽与PDCD4蛋白存在明显的共定位。与此同时,免疫共沉淀与双荧光分子互补实验结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着干扰PDCD4与eIF4A的结合,但相同的突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI却无此效应。以上结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽通过靶向PDCD4特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合。（三）干扰多肽特异性上调BDNF的表达将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体按照3:1的质量比共转染于HEK-293细胞,6h后添加9R-eIF4A-VI干扰多肽,免疫印迹实验检测BDNF表达的变化。结果表明,9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用,但相同浓度的Mu-9R-eIF4A-VI多肽对BDNF表达的上调作用消失。为了明确干扰多肽对神经细胞内源性BDNF表达的影响。不同浓度的9R-eIF4A-VI干扰多肽处理神经细胞（原代海马神经元、小鼠海马神经元细胞HT-22和小胶质BV2）。免疫印迹结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着上调神经细胞内源性BDNF的表达。与此同时,通过炎性细胞因子的表达水平评价了 9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经细胞的副反应。ELlSA结果显示,9R-eIF4A-VI干扰多肽并不会诱发炎性相关细胞因子lL-6和IL-10表达上调。（四）干扰多肽逆转海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用在前期的工作中,我们在海马神经细胞系和小胶质细胞中用mTORC1活性抑制剂成功构建了模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。为了探究9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经元BDNF表达的影响,我们用rapamycin去抑制原代海马神经元mTORC1的活性。我们发现与前期结果一致,mTORC1失活后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。而9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转原代海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（五）海马区注射干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为为了检测9R-eIF4A-VI干扰多肽对焦虑和抑郁样行为的影响。通过CRS诱导小鼠抑郁模型,模型构建成功后,通过脑立体定位将9R-eIF4A-VI干扰多肽定点注射至抑郁小鼠的海马区:（1）脑组织免疫荧光结果显示干扰多肽能够通过定位注射扩散至整个海马组织;（2）免疫印迹实验和ELISA结果显示干扰多肽能够显着上调抑郁小鼠海马中BDNF的表达;（3）脑组织高尔基染色结果表明干扰多肽通过增加神经元突触棘密度,改善神经突触可塑性;（4）行为学结果显示,干扰多肽治疗组小鼠在悬尾实验、强迫游泳实验中与CRS组相比不动时间明显减少。蔗糖水偏好实验中干扰多肽治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。旷场实验和高架十字实验干扰多肽治疗组小鼠中央区的停留时间显着低于CRS组。以上结果表明,海马区定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽通过上调BDNF表达、改善神经突触可塑性,缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究尽管干扰多肽和siRNA药物有特异性高、免疫原性低等优势,但制备成本高、不能口服用药,将来临床应用会受到一定限制。为了克服这种不足,在本部分研究工作中,我们主要探索PDCD4配体小分子化合物治疗抑郁症的可行性（一）PDCD4配体小分子的筛选已有研究报道,通过高通量虚拟筛选从类药物小分子文库中筛选了 6种可能与PDCD4结合的小分子化合物。进一步研究发现,一种小分子化合物与PDCD4具有高亲和力,另一种小分子与PDCD4具有中等亲和力。模拟结果显示这两种化合物主要通过氢键和π-π键与PDCD4 C端MA-3结构域的氨基酸相连接,但是结合后的功能尚不清楚。故本课题选择这两种小分子为候选化合物（分别命名为ZHJ-204和ZHJ-690）检测其对PDCD4靶分子BDNF表达的影响。（二）PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响（1）首先,我们检测了小分子ZHJ-204和ZHJ-690对神经细胞内源性BDNF表达的影响,结果显示10pM至1nM的ZHJ-204和ZHJ-690能显着上调HT-22和BV2 BDNF的表达,并且具有浓度依赖性;（2）神经细胞mTORC1失活体外抑郁模型结果表明,ZHJ-204和ZHJ-690能够解除rapamycin对BDNF的抑制作用,而且小分子ZHJ-204相较于ZHJ-690对BDNF的上调作用更为显着;（3）在PDCD4过表达模型中,我们发现小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用。以上结果表明,PDCD4配体小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够上调BDNF的表达。（三）PDCD4配体小分子抗抑郁作用研究通过CRS诱导小鼠抑郁模型,诱导完成后进行配体小分子的干预治疗。我们将不同浓度的配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内,对照组注射等量的生理盐水,每天注射一次共10次,治疗完成后进行抑郁行为学评价和脑组织生化标志物分析。（1）首先,我们检测了抑郁症相关脑区海马和前额叶皮质中BDNF表达的变化。免疫印迹结果显示,持续的CRS能够降低海马和前额叶皮质中BDNF的含量,而ZHJ-204（5mg/kg）的治疗能够显着上调抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF的表达。（2）行为学结果表明,ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间与CRS组相比显着降低。蔗糖水偏好实验结果显示ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。以上结果表明,腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。结论1.神经靶向修饰的PDCD4小干扰RNA（RVG/siPdcd4）通过特异性沉默PDCD4、抑制促炎性细胞因子表达、上调BDNF表达、改善神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。2.海马定位注射特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽,通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。3.腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调海马和前额叶皮质中BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。创新性及意义1.我们首次将小核酸药物用于抑郁症的治疗,并且通过体外修饰解决了 siRNA神经靶向问题。并且发现经过脑内靶向修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）通过静脉注射能够缓解CRS诱导的抑郁样行为,RVG/siPdcd4有可能成为新的抗抑郁药物。2.在多肽类抗抑郁药物的研究中,我们筛选并设计了能特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽。体内实验证明海马定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。进一步证明了 PDCD4促进抑郁症的分子机制并为抗抑郁药物的研究提供了新的策略,同时为干扰多肽类的抗抑郁药物的研发奠定了基础。3.在小分子类抗抑郁药的研究中,我们从类药物小分子文库中筛选了 PDCD4的配体小分子,并且证明了腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。我们的工作为研究新型小分子抗抑郁药物提供了前期工作基础。局限性1.RVG/siPdcd4药代动力学,药物安全评价等相关研究尚未完成。2.尽管脑内注射9R-eIF4A-VI干扰多肽显现出明显的抗抑郁效应,但外周用药的修饰和效应尚需进一步研究。3.虽然已经证明PDCD4配体小分子有一定抗抑郁作用,但仍需要对小分子化合物进行进一步的改造和修饰,以便提高其活性和成药性。
庞云丽[3]（2020）在《胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化》文中指出Dok（downstream of tyrosine kinase/Docking protein）是酪氨酸激酶下游蛋白,在细胞信号转导中至关重要。该家族包含了 Dok1至Dok7共7个成员,它们具有相似的结构特征:N端PH结构域、中央PTB结构域以及C末端区域。PH结构域可以帮助某些蛋白定位于质膜上,中央PTB结构域主要结合磷酸化的酪氨酸,C末端可以结合信号分子调节下游信号通路。Dok5是Dok家族成员之一,已有研究报道,Dok5 可以结合 c-Ret（proto-oncogene encodes receptor tyrosine kinase,Ret）受体,通过 GDNF（Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor,GDNF）信号通路促进神经细胞分化;同时也是受体酪氨酸激酶中的原肌球蛋白相关激酶（tropomyosin-related kinase,Trk）受体的底物,能通过PTB结构域的酪氨酸磷酸化与 TrkB/C 结合,并激活 MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路,参与神经细胞的分化和凋亡;并且可以被胰岛素受体磷酸化,参与胰岛素信号通路。这些信号通路均在神经系统的发育中发挥重要功能,因此,推测Dok5是一个神经发育相关蛋白。但目前关于Dok5在机体内的功能和分子机制研究未见报道。首先,我们对Dok5基因的序列和编码的氨基酸序列进行了分析。Dok5长度为921 bp,含8个外显子和7个内含子。编码306个氨基酸,包含PH结构域、PTB结构域和C末端区域。其相对分子质量为35.453 kDa,理论pI为9.0,其氨基酸序列在不同物种中高度保守。SignalP信号肽和TM跨膜域预测结果显示Dok5既没有信号肽结构,也没有跨膜区。通过ProtParam和Protscale在线分析显示,Dok5的不稳定系数为42.69,总平均亲水性系数为-0.519,尽管C端富含疏水区,但整体上仍是一个稳定的亲水性蛋白。NetPhos3.1 Server在线预测显示,Dok5含有50个潜在的磷酸化位点,其中包含33个丝氨酸磷酸化位点,14个苏氨酸磷酸化位点,3个酪氨酸磷酸化位点。作为一个信号蛋白,Dok5的众多磷酸化位点很可能作为信号分子的停泊位点,激活下游信号通路。这些基本信息为后续的蛋白表达提供指导意义。一方面,为了寻找Dok5的相互作用蛋白以揭示其在信号转导过程中的分子机制,我们在原核表达系统进行了 Dok5不同结构域蛋白的表达。分析了用PCR方法分别扩增编码Dok5全长（FL）、PTB/PH/C结构域的cDNA,并将其克隆入表达载体pGEX 6p-1中,获得了原核表达质粒pGEX 6p-1-Dok5 FL、pGEX 6p-1-Dok5 PH、pGEX 6p-1-Dok5 PTB、pGEX 6p-1-Dok5 C。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,筛选高效表达GST融合蛋白的菌株。在0.1mM IPTG、16℃条件下,在大肠杆菌BL21中获得Dok5 FL、Dok5 PH、Dok5 PTB蛋白的表达,并进行了Glutathion Sepharose 4B亲和层析柱纯化。用Dok5特异性抗体进行Western blot检测,结果表明所表达纯化的融合蛋白与Dok5抗体具有良好的反应性,为后续通过GST pull down寻找Dok5相互作用蛋白奠定了实验基础。另一方面,原核表达蛋白缺少翻译后修饰,不能得到正确折叠的活性蛋白。为了进行Dok5在体水平的功能研究,获得能特异性识别Dok5的抗体至关重要。目前规模化生产的抗体均是用C末端的部分合成多肽免疫动物所得的多克隆抗体,能够识别原核表达的蛋白,但在哺乳动物细胞和动物组织中没有良好的特异性。而昆虫表达系统由于具有翻译后修饰功能,所获得的蛋白更接近于天然蛋白,以此为抗原制备的抗体能够特异识别天然蛋白。因此,我们在昆虫细胞表达系统中进行了 Dok5 FL和C端蛋白的表达,以作为抗原在后续工作中进行抗体的制备。将Dok5 FL和C端分别克隆到pFastBac1载体上,构建了 pFastBac1-Dok5 FL、pFastBac1-Dok5 C质粒。将重组质粒转化DH10感受态细胞,通过蓝白斑筛选得到高效产Bacmid的菌株,用Bacmid转染昆虫细胞SF21,分别获得P1/P2/P3病毒;用P3病毒感染High Five细胞,以期获得大量胞内表达的目的蛋白。同时,由于Dok5没有信号肽结构,我们在pFastBac1载体上引入了 Hemolin信号肽,构建了pFastBac1-Hemolin-Dok5 FL、pFastBac1-Hemolin-Dok5 C质粒,以尝试使蛋白能够分泌表达,提高蛋白表达纯化的效率,从而为制备Dok5特异性抗体提供活性蛋白抗原。
王霞[4]（2020）在《人多能干细胞体内高效诱导运动神经元的定向分化及研究》文中指出肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS）是致命的运动神经元疾病,表现为运动神经元广泛死亡,至今缺乏有效治疗方法。人诱导多能干细胞（human induced Pluripotent Stem Cells,hi PSCs）来源广、增殖快,且可以分化为特定运动神经元,为ALS的治疗带来了曙光。然而干细胞治疗仍面临3大难题:数量有限、分化方向不可控制,以及移植到体内的细胞大量死亡。本研究中,我们对hi PSCs进行了多基因修饰:（1）转入Tet-on系统,实现Ngn2、Isl1、Lhx3（NIL）条件性表达,既保留了hi PSCs本身来源广、增殖快的特点,又可以利用药物定向诱导运动神经元分化;（2）过表达抗凋亡因子Bcl-x L,保证移植细胞在体内长期存活。经抗生素筛选获得一株来源广泛、增殖良好的、可定向诱导和抗凋亡的阳性细胞克隆hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG,该克隆呈GFP阳性,同时高表达荧光素酶标记基因;并且加入四环素诱导后,转基因蛋白Isl1表达水平显着提高。完成阳性细胞克隆鉴定后,我们在培养基中加入四环素体外诱导运动神经元的定向分化,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG从干细胞克隆状态高效、迅速分化为神经样细胞,表现为细胞核聚缩和神经突触不断延长。通过免疫荧光和膜片钳技术对神经元进行表征,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG所诱导运动神经元广泛表达神经元早期marker MAP2、运动神经元特异性marker HB9和成熟神经元marker Ch AT,并且产生较强的离子电流,说明在四环素诱导下hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG可以定向分化为功能成熟的运动神经元。此外,在传代应激和谷氨酸毒性实验中,与对照组hi PSCs-NIL-BSD相比,hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG诱导的神经元存活数目明显增多,展示出Bcl-x L的抗凋亡活性。随后,我们将hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG直接注射到免疫缺陷小鼠皮下组织,腹腔注射四环素进行体内定向诱导,与PBS对照组相比,四环素诱导后的hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG在皮下组织没有形成畸胎瘤,且分化为神经样的细胞,大量表达神经元通用markerβ-tubulin。确保其安全后,我们将hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG注射到免疫缺陷新生鼠的脑室和脊髓中,活体成像技术检测移植细胞能够在体内长期存活（>4周）;并且经四环素诱导定向分化为运动神经元,同时表达神经元相关markersβ-tubulin、MAP2、HB9和Ch AT,与体外定向分化的结果相一致,表明hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG在体内也能够定向分化为运动神经元。综上所述,本研究首次利用多基因修饰技术获得的hi PSCs-NIL-BSD+Bcl-LG,既保留了hi PSCs本身来源广、增殖快的优点,为干细胞移植提供足量细胞来源;又保证了干细胞分化方向的可控性及移植细胞体内存活率。此外,首次把基因修饰的hi PSCs细胞直接注入体内,并在药物诱导下实现hi PSCs体内高效定向分化为运动神经元,有望为ALS等神经退行性疾病的干细胞治疗提供一种新的治疗策略。
张翠红[5]（2020）在《DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究》文中研究表明目的:糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy,DPN）是糖尿病较为常见且严重的慢性并发症,典型的病理变化包括轴突变性、轴突缺失、髓鞘异常和节段性脱髓鞘。雪旺氏细胞作为外周神经主要的胶质细胞,为维持正常轴突冲动传导和促使受损轴突的再生提供营养支持。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）和神经营养因子3（Neurotrophin 3）属于雪旺氏细胞分泌的蛋白多肽类神经生长因子,它们是神经细胞及神经胶质细胞生存、增殖、迁移和分化过程中所必需的营养物质。雪旺氏细胞中BDNF和Neurotrophin 3缺乏在糖尿病周围神经病变的发病机制中起重要作用,然而对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF和Neurotrophin 3表达下调的机制尚未完全阐明。DNA甲基化是一种常见的表观遗传学修饰方式,在调节基因转录、染色质重塑、基因组修饰和基因组完整性方面起着关键作用。DNA甲基化通常发生在基因启动子DNA的Cp G二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子上,这一过程主要受DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）和去甲基化酶（ten-eleven translocation,TET）的调节。DNA甲基化是否参与糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF表达缺陷,目前尚不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一种参与调节细胞多种功能的信号转导途径,可以调节细胞的增殖、代谢、自噬和凋亡,是由丝氨酸和苏氨酸组成的多蛋白激酶复合物。多种刺激,包括生长因子、葡萄糖和氨基酸等营养物质,都会影响mTOR信号通路。在mTOR信号通路上游,有不同途径对其调控,包括蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB或Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）,以使细胞对不同的刺激产生反应。但是,糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞中BDNF、Neurotrophin 3的表达与DNA甲基化和mTOR信号通路及其上游调控分子之间是否存在网络交互关系,目前尚未见相关报道。因此,本研究通过建立糖尿病小鼠模型和利用体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96,首先,从组织水平观察糖尿病小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3的表达情况及髓鞘结构变化;然后,从细胞水平观察体外高糖培养的大鼠雪旺氏细胞RSC96中BDNF及Neurotrophin 3在m RNA及蛋白水平的表达变化,进一步检测BDNF启动子DNA的甲基化状态及DNA甲基转移酶DNMT的表达变化情况;同时应用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷（5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza）和特异性DNMT1 sh RNA质粒进行干预,观察DNMT1和BDNF的表达变化情况;最后,检测mTOR信号通路及其上游Akt、AMPK通路对高糖诱导的RSC96细胞中DNMT1和BDNF表达的影响。从而系统探究了DNA甲基化以及Akt/mTOR信号通路对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响,为糖尿病周围神经病变的预防和治疗提供新的研究思路,探索新的治疗干预靶点。方法:1. BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化将CD1雄性小鼠随机分为两组:正常组（normal mice）和糖尿病组（diabetic mice）。糖尿病小鼠模型构建采用腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ,溶于0.1 mol/L无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,p H 4.4,150 mg/kg）,正常组小鼠只注射相等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,72 h后尾尖取血测定血糖,空腹血糖≥16.7 mmol/L者定义为糖尿病模型造模成功。糖尿病小鼠成模后,每周检测血糖,不符合标准者弃去,喂养16周,处死小鼠,分离坐骨神经,固定于4%多聚甲醛或4%戊二醛,用于免疫组织化学、神经髓鞘固蓝染色及电镜技术检测;部分坐骨神经组织用于提取蛋白。免疫组织化学和Western blot检测坐骨神经BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达。神经髓鞘固蓝染色及电镜技术观察小鼠坐骨神经髓鞘结构变化。2.体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测大鼠雪旺氏细胞系RSC96在37℃,5%CO2培养箱内,用添加有10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基中培养。（1）检测高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophin 3蛋白表达变化:将RSC96细胞随机分为正常糖组（5.5 mmol/L glucose,normal glucose,N）、高糖组（25mmol/L glucose,high glucose,H）和甘露醇高渗对照组（5.5 mmol/L glucose+19.5 mmol/L mannitol,M）。实验前细胞在无血清培养基中培养,以使其同步化。给予相应刺激1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF、Neurotrophin 3蛋白表达,Real-time PCR检测BDNF m RNA表达。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:无血清培养基同步化细胞后,用DNA甲基转移酶抑制剂（10μmol/L 5-Aza）或组蛋白去乙酰酶抑制剂（400 nmol/L TSA）处理RSC96细胞,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）、高糖+400 nmol/L TSA组（H+TSA）。培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测BDNF蛋白表达。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:无血清培养基同步化细胞后,将RSC96细胞分为正常糖组（N）、高糖组（H）和高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）组,细胞培养3 d后,基因组DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit）进行RSC96细胞基因组DNA提取,提取的DNA经亚硫酸盐修饰、纯化、回收备用。通过网站设计BDNF启动子区甲基化和非甲基化序列的引物对,甲基化及非甲基化引物进行PCR扩增、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,计算甲基化的脱氧核糖核酸/甲基化+未甲基化脱氧核糖核酸,用于表示甲基化程度。3.DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:将RSC96细胞分为正常糖组（N）和高糖组（H）,3 d后提取细胞总RNA,经过纯化、水解得到m RNA片段,经逆转录酶催化和随机引物合成第一条c DNA链,然后在DNA聚合酶I作用下合成第二条c DNA链,这些c DNA片段经过末端修复和连接,形成最终的c DNA文库,利用Illumina Hi Seq2500进行测序。（2）检测高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,实验前经无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。高糖刺激细胞1 d、2 d和3 d后收集细胞,细胞免疫荧光及Western blot检测DNMT1蛋白表达。（3）抑制DNMT1对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:实验前用无血清培养基培养细胞,使细胞同步化。将RSC96细胞分为正常糖组（N）、正常糖+10μmol/L 5-Aza组（N+5-Aza）、高糖组（H）、高糖+10μmol/L 5-Aza组（H+5-Aza）。3 d后收集细胞,Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:构建DNMT1基因特异性sh RNA质粒并命名为p Genesil-1-DNMT1,高糖刺激的RSC96细胞随机分为未转染组（untransfection）、阴性对照组（p Genesil-1）和p Genesil-1-DNMT1转染组（p Genesil-1-DNMT1）。转染48 h后Western blot检测DNMT1及BDNF蛋白表达。4.Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响（1）检测高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）蛋白表达。（2）检测mTOR通路抑制剂Torin1及激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞D NMT1及BDNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+500 nmol/L Torin1组（N+Torin1）;正常糖组（N）、高糖组（H）、高糖+10μm ol/L MHY1485组（H+MHY1485）,培养3 d后收集细胞,细胞免疫荧光检测DNMT1蛋白表达,Western blot检测S6K、phospho-S6K（Thr 389）、D NMT1及BDNF蛋白表达。（3）检测高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:将RSC96细胞随机分为正常糖组（N）、高糖组（H）和甘露醇高渗对照组（M）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测Akt、phosph o-Akt（Ser 473）、phospho-Akt（Thr 308）、AMPK、phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达。（4）检测Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorp hin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和B DNF蛋白表达的影响:细胞随机分为正常糖组（N）、正常糖+DMSO组（N+DMSO）、正常糖+LY294002/Dorsomorphin组（N+LY294002/Dorsomorphi n）,高糖组（H）、高糖+DMSO组（H+DMSO）、高糖+LY294002/Dorsomorp hin组（H+LY294002/Dorsomorphin）,培养3 d后收集细胞,Western blot检测mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1和BDNF蛋白表达。结果:1.BDNF和Neurotrophin 3蛋白在糖尿病小鼠坐骨神经中的表达及髓鞘结构变化。（1）Western blot检测结果显示:与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经组织中Pro-BDNF和mature-BDNF及Neurotrophin 3蛋白表达分别下降74.4%、40.1%和59.0%（P<0.05）。（2）免疫组化结果显示:小鼠坐骨神经组织中BDNF和Neurotrophin 3蛋白主要定位于细胞胞浆和胞核,呈棕黄色颗粒状分布,与正常组相比,糖尿病组二者表达减弱,分别降低72.8%、36.6%（P<0.05）。（3）神经髓鞘固蓝染色结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘变薄。（4）电子显微镜结果显示:与正常组相比,糖尿病组小鼠坐骨神经髓鞘结构不规则,出现内折现象。2. 体外高糖培养的RSC96细胞中BDNF、Neurotrophin 3蛋白和m RNA表达及BDNF启动子DNA甲基化状态检测。（1）高糖环境下RSC96细胞中BDNF和Neurotrophins 3蛋白表达变化:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,BDNF表达在高糖刺激2 d开始下降,且高糖刺激RSC96细胞2 d和3 d,Pro-BDNF蛋白表达分别下降了46.5%和48.3%（P<0.05）,同样,mature-BDNF蛋白表达分别下降了32.1%和23.7%（P<0.05）;但高糖刺激RSC96细胞1 d,与正常糖组和甘露醇高渗对照组相比,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达无明显差异（P>0.05）。而各组Neurotrophin 3蛋白在不同时间点的表达均没有明显差异。细胞免疫荧光结果显示:BDNF和Neurotrophin 3蛋白均定位于RSC96细胞胞核及胞浆,与正常糖组及甘露醇高渗对照组相比,高糖刺激导致RSC96细胞BDNF蛋白绿色荧光表达降低,但Neurotrophin 3蛋白表达无明显变化。Real-time PCR结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞中BDNF m RNA下降了61.4%（P<0.05）。（2）表观遗传学修饰对高糖诱导RSC96细胞中BDNF蛋白表达的作用:Western blot结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组RSC96细胞中BDNF蛋白表达升高,Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是高糖组表达量的1.23倍和1.26倍（P<0.05）。然而,H+TSA组与高糖组比较,BDNF蛋白表达未见升高。细胞免疫荧光结果显示:与高糖组相比,H+5-Aza组细胞BDNF呈强阳性表达,而H+TSA组细胞BDNF表达未见明显改变。（3）甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）检测BDNF启动子DNA甲基化状态:与正常糖组细胞相比,高糖组RSC96细胞BDNF外显子I和外显子II启动子的甲基化程度显着增加（P<0.05）,H+5-Aza组外显子I和II的启动子甲基化程度降低（P<0.05）。相比之下,正常糖组和高糖组外显子IV（完全非甲基化）和外显子IX（几乎完全甲基化）启动子的甲基化程度没有差异（P>0.05）。3. DNMT对高糖诱导的RSC96细胞BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞DNMT和TET m RNA表达的影响:RNA测序结果提示高糖组RSC96细胞DNMT1和DNMT3a m RNA表达水平升高,尤其是DNMT1m RNA表达水平显着升高。而正常糖组（N）和高糖组（H）细胞DNMT3b、TET1、TET2和TET3 m RNA的表达没有明显差别。（2）高糖对RSC96细胞DNMT1表达的影响:Western blot检测结果显示:高糖刺激RSC96细胞1 d、2 d、3 d,高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量分别是正常糖组的2.13倍、2.22倍和2.44倍（P<0.05）。正常糖组和甘露醇高渗对照组DNMT1蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。细胞免疫荧光检测发现DNMT1主要定位于RSC96细胞的细胞核,高糖刺激3 d后并没有改变DNMT1的亚细胞定位;但与正常糖组相比,高糖组DNMT1蛋白绿色荧光的表达水平显着增加。（3）5-Aza抑制对RSC96细胞BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:5-Aza使正常糖组细胞DNMT1蛋白表达量下降了55.9%（P<0.05）,使高糖组细胞中DNMT1蛋白表达量下降了59.3%（P<0.05）。H+5-Aza组RSC96细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量分别是单纯高糖组的1.67倍（P<0.05）和1.35倍（P>0.05）。而5-Aza对正常糖组细胞中的Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量无明显影响。（4）敲低DNMT1基因对BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:与阴性对照组（p Genesil-1）相比,p Genesil-1-DNMT1组RSC96细胞中DNMT1蛋白表达量下降了70.5%（P<0.05）;Pro-BDNF和mature-BDNF蛋白表达量比阴性对照组（p Genesil-1）分别明显增加了29.3%和82.9%（P<0.05）。4. Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的RSC96细胞DNMT1和BDNF表达的影响。（1）高糖对RSC96细胞mTOR信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组RSC96细胞phospho-mTOR（Ser2448）降低了45.3%（P<0.05）。正常糖组及甘露醇髙渗对照组细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达无差异（P>0.05）。（2）mTOR通路抑制剂Torin1和激活剂MHY1485对高糖RSC96细胞DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:Torin 1显着抑制正常糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达量明显降低（P<0.05）,同时使DNMT1表达量增加了1.04倍（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量分别降低了37.8%（P<0.05）和29.3%（P>0.05）。细胞免疫荧光结果显示:与正常糖组相比,Torin 1组增加了RSC96细胞核内DNMT1的表达,表现为强烈的绿色荧光;MHY1485能促进高糖RSC96细胞mTOR通路活化,phospho-S6K（Thr 389）表达水平明显增加（P<0.05）,同时使DNMT1蛋白表达量降低49.9%（P<0.05）,Pro-BDNF和mature-BDNF的表达量明显增加（P<0.05）。（3）高糖对RSC96细胞Akt及AMPK信号通路的影响:Western blot检测结果显示:与正常糖组及甘露醇髙渗对照组相比,高糖组phospho-Akt（Ser 473）和phospho-Akt（Thr 308）蛋白表达量分别降低了74.1%和80.6%（P<0.05）,phospho-AMPK（Thr 172）蛋白表达量升高了46.5%（P<0.05）,三组之间总Akt和AMPK蛋白表达量无明显差异。（4）Akt及AMPK通路抑制剂（LY294002和Dorsomorphin）对高糖RSC96细胞mTOR、phospho-mTOR（Ser 2448）、DNMT1及BDNF蛋白表达的影响:Western blot检测结果显示:LY294002使正常糖及高糖培养的RSC96细胞phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显降低（P<0.05）,总mTOR表达量无明显差异。进一步发现,LY294002使高糖组DNMT1表达增加,BDNF表达减少（P<0.05）,然而在正常糖组,LY294002不影响DNMT1及BDNF的表达。这些数据表明Akt通路影响高糖RSC96细胞的mTOR通路及DNMT1和BDNF的表达;Dorsomorphin显着增加正常糖和高糖mTOR磷酸化,Western blot检测结果显示:phospho-mTOR（Ser 2448）表达量明显升高（P<0.05）,总mTOR表达量无明显变化。进一步发现,Dorsomorphin使高糖组DNMT1表达下降（P<0.05）,而正常糖组DNMT1表达量无明显变化。与对照组相比,高糖组或正常糖组RSC96细胞中Pro-BDNF和mature-BDNF表达量无明显变化。结论:1.高糖通过增加BDNF外显子I和II的启动子甲基化导致雪旺氏细胞中BDNF的表达降低。2.DNMT1介导了高糖诱导的雪旺氏细胞中BDNF表达降低。3.Akt/mTOR途径参与高糖诱导的雪旺氏细胞中DNMT1表达的升高和BDNF表达的降低。
李洪蛟[6]（2016）在《丙酸睾酮对小鼠睾丸BNNF、NGF、NT-3和NT-4神经营养素表达的影响》文中提出哺乳动物的繁殖活动除了下丘脑-垂体-性腺轴的激素调控外,也受多种细胞因子的调节,其中包括神经营养素。神经营养素（Neurotrophins）是在神经系统中发现的一类蛋白家族,是神经细胞存活和发育的主要调节因子。神经营养素家族包括神经生长因子（NGF）,脑源性神经营养因子（BDNF）,神经营养素3（NT-3）和神经营养素4（NT-4）。它们主要是在脑和神经组织表达,对神经细胞的分化和神经元存活具有重要作用。雄激素主要是由睾丸合成和分泌,与动物生殖有着极其密切的关系,能够影响精子发生。研究发现,神经营养因子和雄激素在动物生殖调控中发挥着重要作用。然而在雄性生殖调控中,雄激素和神经营养素之间的关系并不明确。本文以小鼠为研究对象,探究丙酸睾酮对小鼠睾丸神经营养素表达的影响,以揭示雄激素与神经营养素在雄性生殖中的调节关系,研究内容如下:1、丙酸睾酮对小鼠睾丸神经营养素表达的影响用丙酸睾酮处理小鼠0、6、12和24h后,收集睾丸,观察睾丸形态变化,检测睾丸中神经营养素m RNA和蛋白质的表达变化。小鼠睾丸切片HE染色结果显示,高剂量丙酸睾酮严重破坏了睾丸结构,精子发生出现异常。神经营养素定量结果表明,丙酸睾酮处理小鼠,12小时后发生明显作用,能促进睾丸中BDNF、NT-3和NT-4的表达,而抑制NGF的表达。2、丙酸睾酮对TM4和GC-1spg细胞神经营养素表达的影响。用丙酸睾酮处理TM4和GC-1spg细胞,通过CCK8法检测细胞活力变化,运用荧光定量来检测神经营养素m RNA的变化,利用细胞免疫荧光检测神经营养素蛋白质的表达变化。细胞活力实验结果显示,丙酸睾酮对TM4和GC-1spg细胞活性无明显影响。荧光定量与细胞免疫荧光结果表明,丙酸睾酮处理TM4细胞,使BDNF和NT4的表达在12h降低,到24h又恢复到正常水平,而NGF和NT-3的表达在12h后受到抑制。对于GC-1spg细胞,丙酸睾酮处理使BDNF和NGF的表达在6h到12h降低,24h后表达升高,最终BDNF表达水平高于正常,而NGF表达回到正常水平;NT-3的表达量在6h下降,12h升高,而在24h又下降,出现回复现象,NT-4的表达则在6h后受到了抑制。综上所述,我们的研究结果表明,高剂量的丙酸睾酮会严重破坏睾丸的正常结构,使精子发生异常,出现雄性不育。丙酸睾酮能够调节睾丸中神经营养素的表达,参与调控雄性生殖。
陈璐[7]（2012）在《脑源性神经营养因子及神经营养因子4对大鼠促性腺激素分泌及其受体表达的影响》文中提出哺乳动物的繁殖活动是由下丘脑-垂体-性腺轴所调控的，多种细胞因子参与其中共同作用达到对繁殖活动的调节。脑源性神经生长因子（BDNF）及神经营养因子4（NT-4）作为神经营养因子家族成员，其对生殖活动的影响近年来吸引了诸多研究者的目光。已有研究证实，BDNF与NT-4在卵泡的发育，排卵及卵巢激素合成中均有重要作用，但它们对促性腺激素分泌及其受体表达的影响有待阐明。本文通过体内实验和体外实验研究了（1）外源性BDNF与NT-4对大鼠血浆促性腺激素浓度的影响；（2）BDNF与NT-4对大鼠生殖器官促性腺激素受体表达的影响；（3）BDNF及NT-4对大鼠卵泡颗粒细胞促性腺激素受体表达及雌激素分泌的影响。体内实验结果表明，成年雌性大鼠尾静脉注射BDNF重组蛋白后，血浆FSH浓度与对照组相比呈下降趋势，两者差异极显着（p＜0.01）。在BDNF与NT-4重组蛋白注射后，大鼠子宫、卵巢、输卵管上促性腺激素受体呈现出规律性变化。其中，BDNF与NT-4能够使大鼠卵巢及子宫中LHR与FSHR表达下调，但对于输卵管组织，BDNF与NT-4的注射使促性腺激素受体表达上调。通过体外培养实验发现，在添加了BDNF与NT-4重组蛋白的大鼠卵巢颗粒细胞培养体系中，BDNF与NT-4均能够提高大鼠卵巢颗粒细胞LHR和FSHR的表达，其变化呈剂量依赖关系，推测这两种因子在卵巢局部（特别是在卵巢颗粒细胞部分）可能通过自分泌或旁分泌作用增强LHR与FSHR的表达，进而促进卵泡的发育，对卵巢功能的发挥产生影响。此外，BDNF与NT-4还能够极显着提高颗粒细胞对雌激素的分泌；同时，过高的卵巢雌激素水平对GnRH的分泌产生负反馈抑制作用，导致大鼠血清FSH浓度的降低，与本研究第一部分所得结论吻合。本研究第二部分结果显示，BDNF与NT-4能够下调卵巢组织LHR与FSHR的表达，然而体外培养实验结果表明，BDNF与NT-4能够使卵巢颗粒细胞LHR与FSHR表达增强。我们推测，这种差异可能是由于BDNF和NT-4对卵巢组织与卵泡颗粒细胞调控机制的不同造成的。在组织水平，BDNF与NT-4对卵巢功能的调节可能并非直接通过作用于卵巢组织本身实现，而是通过调节促性腺激素释放，进而调节卵巢中促性腺激素受体的表达完成的，本研究第一与第二部分能够从侧面证实这一推测，即BDNF可能通过减少FSH释放降低血浆FSH浓度下调卵巢FSHR的表达；而对于卵巢颗粒细胞，BDNF与NT-4可能直接通过局部的神经营养因子的旁分泌或者自分泌作用实现对颗粒细胞机能的调节。另推测，BDNF与NT-4在血液中的浓度可能存在稳恒状态，一旦外源性蛋白注射破坏了这种稳恒状态，就可能会对促性腺激素释放及其受体表达产生抑制效应。但其究竟通过何种神经传递途径或信号转导方式实现，还需要进一步的探索。综上所述，本研究表明，BDNF和NT-4可能通过影响促性腺激素的分泌和调节促性腺激素受体的表达这两种方式实现对生殖组织的调控；除上述神经支配作用外，BDNF与NT-4还可能以自分泌或旁分泌方式影响动物的生殖机能。
孙永峰[8]（2011）在《神经营养因子4及其受体在母牛生殖系统中的表达与部分功能研究》文中提出本研究系统探索了神经营养因子4（NT4）及其受体酪氨酸蛋白激酶B（TrkB）在卵泡期和黄体期母牛卵巢、输卵管和子宫组织中的分布及表达规律,并且研究了促性腺激素FSH和LH对卵泡颗粒细胞中NT4和TrkB表达的影响及NT4/TrkB通路对颗粒细胞中促性腺激素受体表达的影响。结果表明,在卵泡期,NT4和TrkB于腔前卵泡的卵泡细胞,有腔卵泡的颗粒细胞和内膜细胞,子宫腺和子宫腔上皮细胞,输卵管黏膜上皮细胞表达；在黄体期,NT4和TrkB于卵泡细胞、黄体细胞,子宫腺及子宫腔上皮细胞和输卵管黏膜上皮细胞表达。通过比较发现：卵巢组织中NT4 mRNA和输卵管组织中TrkBmRNA的表达量黄体期极显着高于卵泡期；黄体期的卵巢组织中NT4 mRNA表达量极显着高于子宫和输卵管中的表达量,输卵管组织中TrkB mRNA表达量极显着高于卵巢和子宫中表达量；NT4和TrkB mRNA在卵泡期各组织间表达量差异不显着。卵泡颗粒细胞体外培养实验发现：促性腺激素可促进卵泡颗粒细胞中NT4 mRNA表达,以处理8h,分别添加10μg/mL LH和120μg/mL FSH组为最佳；促进NT4蛋白表达量,以处理8h,分别添加LH或FSH 20ug/mL组为最佳。同时,外源添加NT4可促进卵泡颗粒细胞中LHR和FSHRmRNA的表达,前者表达量以处理8h,浓度30μg/L组为最佳,后者以处理16h,浓度100μg/L组为最佳；而K252a能够阻断NT4/TrkB通路,进而抑制卵泡颗粒细胞中FSHR和LHR mRNA的表达,以处理8h,K252a浓度10/μg/L组为最佳。以上研究结果表明NT4和TrkB在不同发情周期母牛的生殖组织中表达参与生殖调控；NT4在颗粒细胞中表达具有一定促性腺激素时间和剂量依赖性,并且说明NT4/TrkB通路对颗粒细胞中促性腺激素受体表达具有调控作用。
李劲涛,朱兴宝,徐丹,王廷华,张华堂,刘佳[9]（2008）在《人胎脑NT-4基因的体外构建》文中研究表明目的体外构建人神经生长因子-4（neurotrophin-4,NT-4）与质粒载体pEGFP-N1（卡那霉素抗性）的重组体,为后续的转基因移植治疗脊髓损伤创造条件.方法用Trizol法提取人胎脑组织总RNA,经RT-PCR扩增,EorRⅠ和BamHⅠ核酸内切酶酶切电泳纯化获得人神经营养因子-4（NT-4）DNA.用含质粒载体pEGFP-N1DNA的大肠杆菌接种经划板,挑选菌落、振荡培养,并用碱裂解法提取质粒载体pEGFP-N1DNA,经酶切、电泳纯化后,通过连接、转化感受态细胞,DNA小量提取法获得NT-4目的基因与质粒载体pEGFP-N1DNA的重组体,经DNA测序证实.结果用上述方法成功获得NT-4-pEGFP-N1重组体.结论此方法是一种体外构建人胎脑NT-4基因的成熟、稳定而有效的方法,可为后续的神经干细胞转染NT-4基因移植治疗神经系统损伤创造条件.
冯波[10]（2008）在《腺病毒介导人神经生长因子β基因在山羊乳腺中高效表达的研究》文中研究说明神经生长因子（NGF ）作为神经营养因子家族的一员,对神经元存活、生长、发育与分化、损伤修复与再生等方面具有重要作用,它还参与免疫反应,具有促进创伤愈合和血细胞生长,促进肿瘤分化、抑制肿瘤生长等作用。由于天然的NGF来源少,不能满足临床和科学研究的需要,因此,用基因重组技术来获得大量高活性的人NGF蛋白已成为当前国际上亟待解决的问题。本研究对人NGF-β基因序列进行PCR扩增,插人pShuttle-CMV中进行亚克隆,并对所构成的pShuttle-NGF-β重组子进行分析鉴定。再将RIES-GFP基因插入pShuttle-NGF-β,获得重组质粒pSh-hNGF-β-RIES-GFP。重组质粒经线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转入大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,重组子经HEK293细胞包装、扩增、滴度测定后,直接导入山羊乳腺,感染乳腺上皮细胞,以通过乳腺生物反应器试图获得大量具有高生物活性的人神经生长因子蛋白。试验获得如下结果:1.用一对特异引物,采用RT-PCR法,从人胎肝总RNA中扩增出的产物,经1.0%的琼脂糖凝胶电泳,结果显示,在760bp处有一条阳性目的条带。将其插入pcDNA3.1载体进行测序,结果显示与文献报道的NGF-β基因序列相同,未发生碱基的突变。2.穿梭载体pShuttle-hNGF-β-IRES-EGFP质粒经EcorⅠ（356bp、3817bp、5235bp）、NcoⅠ（760bp、892bp、1055bp、1380bp、1785bp、3536bp）、SphⅠ（1476bp、1671bp、2433bp、3822bp）酶切鉴定正确后,用PmeⅠ酶线性化,与pAdEasy-l共转入BJ5183大肠杆菌同源重组,获得pAd-hNGF-β重组腺病毒阳性克隆质粒,经PacⅠ酶切,通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,得4.5kbp或2.9kbp特异性小片段,获得正确的重组腺病毒载体Ad-hNGF-β。3.将重组Ad-hNGF-β转染293细胞,观察到细胞被绿色荧光完全感染,收集病毒上清,经Western blot检测,在上清液中有hNGF-β表达,说明重组hNGF-β腺病毒在体外可以有效的表达。4.将包装好的重组腺病毒感染山羊乳腺上皮细胞,3d后收集上清,经Western blot检测,在上清中有hNGF-β表达,其表达量达4.1mg/L。说明重组hNGF-β腺病毒在山羊上皮细胞中能高效表达hNGF-β蛋白。5.通过腺病毒直接感染山羊乳腺试验,在山羊乳腺中获得hNGF-β的高效表达,其最高表达量约为196.8mg/L,从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。6.用同量或加倍量重组腺病毒对山羊乳腺进行重复感染试验,在乳汁中没有检测到hNGF-β蛋白表达。说明山羊细胞和体液免疫反应是可能防止腺病毒再次感染乳腺上皮细胞表达的主要原因。
二、MOLECULAR CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-4 GENE（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MOLECULAR CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-4 GENE（论文提纲范文）
（1）外周血差异表达的miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍发病机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料方法 |
| 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 附录 B 研究生期间论文发表情况 |
| 综述 生物信息学在microRNA研究中的概述 |
| 参考文献 |
（2）以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、程序性细胞死亡因子4 |
| 二、抑郁症 |
| 三、抗抑郁药物 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4小干扰RNA (siPdcd4)上调神经细胞BDNF的表达 |
| (二) PDCD4小干扰RNA抑制小胶质细胞IL-6和IL-1 β的表达 |
| (三) RVG-9dR多肽携带siRNA特异性进入神经细胞 |
| (四) RVG/siPdcd4特异性沉默神经细胞PDCD4上调BDNF的表达 |
| (五) RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用. |
| (六) RVG/siPdcd4抑制小胶质细胞IL-6和1L-1 β的表达 |
| (七) RVG-9dR携带siPdcd4跨过血脑屏障靶向入脑 |
| (八) RVG/siPdcd4靶向沉默海马和前额叶皮质PDCD4的表达 |
| (九) RVG/siPdcd4逆转CRS对海马和前额叶皮质BDNF的抑制作用. |
| (十) RVG/siPdcd4抑制CRS诱导的IL-6和IL-1β的表达 |
| (十一) RVG/siPdcd4通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4结合eIF4A关键序列的筛选与设计 |
| (二) eIF4A-VI通过干扰PDCD4与eIF4A结合上调BDNF的表达 |
| (三) 9R-eIF4A-VI干扰多肽靶向结合PDCD4 |
| (四) 干扰多肽特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合 |
| (五) 干扰多肽逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (六) 干扰多肽显着上调神经细胞BDNF的表达 |
| (七) 干扰多肽逆转神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (八) 海马区注射干扰多肽显着逆转CRS对BDNF的抑制作用 |
| (九) 干扰多肽通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4配体小分子的筛选 |
| (二) PDCD4配体小分子上调神经细胞BDNF的表达 |
| (三) PDCD4配体小分子逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (四) PDCD4配体小分子逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (五) 腹腔注射小分子ZHJ-204显着上调抑郁小鼠BDNF的表达 |
| (六) 腹腔注射小分子ZHJ-204缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件一 英文文章1 |
| 附件二 英文文章2 |
| 附件三 综述 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 免疫印迹原始结果 |
（3）胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 细胞信号转导与酪氨酸激酶 |
| 2. Dok家族蛋白 |
| 3. Dok5与c-Ret受体 |
| 4. Dok5与TrkB/C受体 |
| 5. Dok5与NSR受体 |
| 第二章 实验材料 |
| 1. 菌株 |
| 2. 细胞株 |
| 3. 质粒载体 |
| 4. 细胞培养基及试剂 |
| 5. DNA引物 |
| 6. 常用试剂及耗材 |
| 7. 主要仪器和设备 |
| 8. 软件及网络资源 |
| 第三章 实验方法 |
| 1. 基因的基本信息分析 |
| 2. 基因的克隆与质粒构建 |
| 2.1 PCR扩增 |
| 2.2 PCR产物回收 |
| 2.3 双酶切载体和目的片段 |
| 2.4 目的片段与载体连接反应 |
| 2.5 目的片段与载体同源重组 |
| 2.6 转化 |
| 2.7 菌液PCR鉴定 |
| 2.8 质粒提取 |
| 2.9 酶切与测序鉴定 |
| 3. 昆虫细胞培养与传代 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 细胞传代 |
| 3.3 细胞冻存 |
| 3.3.1 High5细胞冻存 |
| 3.3.2 SF21细胞冻存 |
| 4. 原核表达系统 |
| 4.1 原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 4.2 最适诱导菌株的筛选 |
| 4.3 最适诱导温度的确定 |
| 4.4 最适IPTG诱导浓度的确定 |
| 4.5 重组蛋白的分离纯化 |
| 4.6 重组蛋白的鉴定 |
| 5. 昆虫细胞蛋白表达系统 |
| 5.1 重组pFastBac1质粒的构建 |
| 5.2 重组pFastBac1质粒转化DH10 Bac感受态细胞 |
| 5.3 重组Bacmid的提取 |
| 5.4 重组Bacmid的鉴定 |
| 5.5 转染SF21细胞 |
| 5.6 P1-P3病毒制备 |
| 5.7 目的蛋白表达检测 |
| 第四章 实验结果 |
| 1. Dok5基因和蛋白结构分析 |
| 1.1 Dok5基因结构分析 |
| 1.2 Dok5蛋白结构分析 |
| 2. Dok5蛋白的原核表达 |
| 2.1 Dok5原核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的表达 |
| 2.3 Dok5重组蛋白在原核表达系统中的大量表达及纯化鉴定 |
| 3. Dok5蛋白的昆虫细胞表达 |
| 3.1 Dok5重组pFastBac1质粒的构建与鉴定 |
| 3.2 重组Bacmid的鉴定 |
| 3.3 Dok5重组蛋白在昆虫细胞表达系统中的检测 |
| 第五章 结果讨论 |
| 第六章 展望 |
| 第七章 小结 |
| 附件 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）人多能干细胞体内高效诱导运动神经元的定向分化及研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 物理量名称及符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 ALS的介绍 |
| 1.2 ALS的治疗方法 |
| 1.2.1 药物治疗 |
| 1.2.2 中医疗法 |
| 1.2.3 .基因疗法 |
| 1.2.4 免疫疗法 |
| 1.3 ALS的干细胞治疗 |
| 1.3.1 人胚胎干细胞 |
| 1.3.2 神经干细胞 |
| 1.3.3 人多能干细胞 |
| 1.3.4 间充质干细胞 |
| 1.4 干细胞治疗存在问题 |
| 1.5 研究意义 |
| 第二章 多基因修饰的hiPSCs阳性细胞克隆的筛选和鉴定及体外运动神经元的定向分化 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 实验耗材 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 分子实验溶液配制 |
| 2.3 细胞培养液配制 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 质粒构建 |
| 2.4.2 细胞培养 |
| 2.4.3 hiPSC-NIL-BSD+Bcl-luciferase-GFP细胞系构建和筛选、鉴定 |
| 2.4.4 hiPSC-NIL-BSD+Bcl-luciferase-GFP细胞诱导运动神经元形成 |
| 2.4.5 hiPSC-NIL-BSD+Bcl-luciferase-GFP细胞诱导的运动神经元的鉴定 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 PB载体的构建和鉴定 |
| 2.5.2 多基因修饰的hiPSCs阳性细胞克隆的筛选和鉴定 |
| 2.5.3 体外运动神经元的定向分化与表征 |
| 2.5.4 运动神经元的功能验证 |
| 2.5.5 Bcl-xL过表达抵抗传代应激诱导的神经元凋亡 |
| 2.5.6 Bcl-xL过表达降低过量谷氨酸盐造成的神经元毒性 |
| 2.6 小结与讨论 |
| 第三章 多基因修饰的hiPSCs阳性细胞克隆在免疫缺陷小鼠体内存活迁移和定向分化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 多基因修饰hiPSCs注射皮下组织不形成畸胎瘤 |
| 3.2.2 多基因修饰hiPSCs注射皮下组织分化为神经细胞 |
| 3.2.3 多基因修饰hiPSCs注射到小鼠神经系统能长期存活 |
| 3.2.4 多基因修饰hiPSCs注射小鼠脑室定向分化为运动神经元 |
| 3.2.5 多基因修饰hiPSCs注射到小鼠脊髓中定向分化为运动神经元 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表和待发表的学术论文 |
| 致谢 |
（5）DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 BDNF和Neurotrophin3在糖尿病雪旺氏细胞中的表达及启动子甲基化状态改变 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DNMT对高糖诱导的RSC96 细胞BDNF表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 Akt/m TOR信号通路对高糖诱导的RSC96 细胞DNMT1 和BDNF表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 DNA甲基化在糖尿病周围神经病变发病机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）丙酸睾酮对小鼠睾丸BNNF、NGF、NT-3和NT-4神经营养素表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 雄激素与雄性动物生殖 |
| 1.1 雄激素 |
| 1.2 雄激素受体 |
| 1.3 雄激素与雄性动物生殖 |
| 1.3.1 雄激素的生物作用 |
| 1.3.2 睾丸的结构与功能 |
| 1.3.3 雄激素与雄性生殖 |
| 1.4 雄激素与神经营养素 |
| 1.5 雄激素的应用 |
| 第2章 神经营养素研究进展 |
| 2.1 脑源性神经营养因子（BDNF） |
| 2.2 神经生长因子(NGF) |
| 2.3 神经营养 3（NT-3）和神经营养素 4（NT-4） |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章丙酸睾酮对小鼠睾丸神经营养素表达的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要实验仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物分组及处理 |
| 1.2.2 小鼠睾丸组织石蜡切片制备 |
| 1.2.3 小鼠睾丸组织HE染色 |
| 1.2.4 小鼠睾丸总RNA提取及反转录 |
| 1.2.5 物设计与合成 |
| 1.2.6 目的基因克隆 |
| 1.2.7 荧光定量 |
| 1.2.8 小鼠睾丸总蛋白提取及浓度测定 |
| 1.2.9 蛋白免疫印迹 |
| 1.2.10数据统计 |
| 1.3 结果分析 |
| 1.3.1 小鼠睾丸形态变化 |
| 1.3.2 小鼠睾丸总RNA提取 |
| 1.3.3 目的基因扩增及测序 |
| 1.3.4 小鼠睾丸神经营养素mRNA表达 |
| 1.3.5 小鼠睾丸神经营养素蛋白表达 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 丙酸睾酮对TM3、TM4及GC-1spg细胞神经营养素表达的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养及处理 |
| 2.2.2 CCK8测细胞活力 |
| 2.2.3 细胞免疫荧光 |
| 2.2.4 RNA提取与反转录、目的基因扩增及测序和荧光定量 |
| 2.2.5 数据统计 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 丙酸睾酮对TM4和GC-1spg细胞活力的影响 |
| 2.3.2 TM4和GC-1spg细胞神经营养素蛋白表达 |
| 2.3.3 丙酸睾酮对TM4和GC-1spg细胞神经营养素mRNA表达的影响 |
| 2.3.4 丙酸睾酮对TM4和GC-1spg细胞神经营养素蛋白表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表论文及科研成果 |
| 致谢 |
（7）脑源性神经营养因子及神经营养因子4对大鼠促性腺激素分泌及其受体表达的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 脑源性神经营养因子的研究进展 |
| 1.1 BDNF 的基因结构 |
| 1.2 BDNF 的信号转导机制 |
| 1.3 BDNF 在神经系统中的作用 |
| 1.4 BDNF 与学习、记忆能力的关系 |
| 1.5 BDNF 与视网膜缺血治疗 |
| 1.6 BNDF 与能量代谢 |
| 1.7 BDNF 与雌激素 |
| 1.8 BDNF 与繁殖 |
| 第2章 神经营养因子 4 的研究进展 |
| 2.1 大鼠 NT-4 mRNA 的结构 |
| 2.2 NT-4 的主要生物学作用 |
| 2.3 NT-4 的受体 |
| 2.4 NT4 与繁殖 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 BDNF 与 NT-4 对大鼠血浆促性腺激素浓度的影响 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 BDNF 与 NT-4 对大鼠生殖器官促性腺激素受体表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 BDNF 与 NT-4 对大鼠颗粒细胞促性腺激素受体表达及雌激素分泌的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（8）神经营养因子4及其受体在母牛生殖系统中的表达与部分功能研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 神经营养因子家族及其受体的研究进展 |
| 1.1 神经营养因子 |
| 1.2 神经营养因子受体 |
| 1.3 神经营养因子4的结构特征 |
| 1.4 NT4的主要生物学作用 |
| 1.5 神经营养因子的信号转导 |
| 第2章 促卵泡素、促黄体素及其受体在动物中的作用 |
| 2.1 促卵泡素及受体的结构和功能 |
| 2.2 促黄体素及受体的结构和功能 |
| 2.3 促性腺激素及其受体的信号转导途径 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 NT4和TrkB在成年母牛生殖组织的表达与定位研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 促性腺激素对卵泡颗粒细胞中NT4和TrkB表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 NT4对卵泡颗粒细胞中促性腺激素受体表达的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（10）腺病毒介导人神经生长因子β基因在山羊乳腺中高效表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 神经生长因子的研究进展 |
| 1.1 NGF 基因及其蛋白 |
| 1.2 神经生长因子的生物活性 |
| 1.3 NGF 受体 |
| 1.4 NGF 的作用机制 |
| 1.5 NGF 与细胞凋亡的关系 |
| 1.6 NGF 的治疗作用 |
| 1.6.1 NGF 对Alzheimer's 病(AD)作用 |
| 1.6.2 NGF 对帕金森氏病(Pakinson' Disease , PD)的作用 |
| 1.6.3 NGF 对中枢神经损害性疾病作用 |
| 1.6.4 NGF 对外周神经的作用 |
| 1.6.5 NGF 对肿瘤的作用 |
| 1.6.6 NGF 在免疫中的作用 |
| 1.7 NGF 生产 |
| 1.7.1 天然NGF |
| 1.7.2 基因工程 |
| 第二章 腺病毒及其载体研究进展 |
| 2.1 腺病毒的一般生物学特性 |
| 2.1.1 腺病毒的感染周期 |
| 2.1.2 腺病毒基因的转录与复制 |
| 2.2 腺病毒载体的构建 |
| 2.2.1 第一代腺病毒载体的构建 |
| 2.2.2 第二代腺病毒载体构建 |
| 2.2.3 第三代腺病毒载体构建 |
| 2.3 腺病毒载体的优越性 |
| 2.3.1 宿主范围广，对人致病性低 |
| 2.3.2 在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因 |
| 2.3.3 能有效进行增殖，滴度高 |
| 2.3.4 与人类基因同源 |
| 2.3.5 不整合到染色体中，无插入致突变性 |
| 2.3.6 能在悬浮培养液中扩增 |
| 2.3.7 能同时表达多个基因 |
| 2.4 腺病毒载体的应用 |
| 2.4.1 癌症的基因治疗 |
| 2.4.2 遗传疾病的基因治疗 |
| 2.4.3 补充治疗 |
| 2.4.4 生产药用蛋白和细胞因子 |
| 第三章 人神经生长因子-βcDNA 的克隆 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 胎肝RNA 的提取 |
| 3.2.2 hNGF-β全长cDNA 的扩增与序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组人神经生长因子-β腺病毒载体制备 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 穿梭载体pSh－hNGF-β－RIES－GFP 的鉴定 |
| 4.2.2 同源重组获得腺病毒载体的鉴定 |
| 4.2.3 重组腺病毒的生产 |
| 4.2.4 腺病毒纯化及滴度的测定的结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 重组腺病毒在山羊乳腺中高效表达的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组腺病毒在山羊乳腺上皮细胞中的表达 |
| 5.2.2 山羊乳腺表达hNGF-β的结果分析 |
| 5.2.3 重复感染试验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论与创新点 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 缩略词和中英文对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、MOLECULAR CLONING OF HUMAN NEUROTROPHIN-4 GENE（论文参考文献）
- [1]外周血差异表达的miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍发病机制中的作用研究[D]. 孙加雯. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [2]以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究[D]. 贾玉峰. 山东大学, 2021(11)
- [3]胞浆接头蛋白Dok5的表达纯化[D]. 庞云丽. 北京协和医学院, 2020(05)
- [4]人多能干细胞体内高效诱导运动神经元的定向分化及研究[D]. 王霞. 广东工业大学, 2020(02)
- [5]DNMT1对糖尿病周围神经病变雪旺氏细胞BDNF表达的影响及机制研究[D]. 张翠红. 河北医科大学, 2020(01)
- [6]丙酸睾酮对小鼠睾丸BNNF、NGF、NT-3和NT-4神经营养素表达的影响[D]. 李洪蛟. 吉林大学, 2016(09)
- [7]脑源性神经营养因子及神经营养因子4对大鼠促性腺激素分泌及其受体表达的影响[D]. 陈璐. 吉林大学, 2012(08)
- [8]神经营养因子4及其受体在母牛生殖系统中的表达与部分功能研究[D]. 孙永峰. 吉林大学, 2011(09)
- [9]人胎脑NT-4基因的体外构建[J]. 李劲涛,朱兴宝,徐丹,王廷华,张华堂,刘佳. 昆明医学院学报, 2008(04)
- [10]腺病毒介导人神经生长因子β基因在山羊乳腺中高效表达的研究[D]. 冯波. 西北农林科技大学, 2008(12)