一、人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析（论文文献综述）
黄韵怡[1]（2020）在《浙江朱鹮种群β防御素基因表达谱及DNA甲基化研究》文中研究说明朱鹮（Nipponia nippon）为中国Ⅰ级保护鸟类,是世界范围内的濒危物种,当前主要以人工圈养种群的形式存在于中国、日本及韩国的部分地区。尽管朱鹮总数目不断增加,但仍存在种群分布零散、人工育种受精率低和雏鸟存活率低等因素,限制了朱鹮的重引入工作。因此,亟需从分子层面对朱鹮的免疫及繁殖做进一步的研究,以更好地指导朱鹮的人工圈养工作。β防御素是重要的免疫效应分子,在生物体抗菌及适应环境的过程中发挥着重要作用,但目前缺少对朱鹮种群β防御素基因表达的研究。因此,对朱鹮β防御素基因表达及其调控机制的研究十分必要,有利于阐明β防御素在朱鹮种群中发挥的免疫作用。本研究从浙江德清下渚湖朱鹮繁育基地选取了涵盖不同年龄的74只朱鹮作为研究对象,以其外周血为研究样品,首先通过实时荧光定量PCR检测了朱鹮种群11个β防御素基因的血液表达水平,分析了不同β防御素基因表达的相关性,研究了不同性别及年龄朱鹮的β防御素基因表达水平差异。其次,基于已有亲子鉴定数据和基因表达量数据,分析了亲代与子代朱鹮β防御素基因表达水平之间的相关性。最后,对朱鹮AvBD2基因启动子CpG岛进行预测,通过亚硫酸氢盐测序检测了10只朱鹮AvBD2基因启动子与基因体区域共37个CpG位点的甲基化水平,并初步分析了不同基因表达水平朱鹮的DNA甲基化水平差异。以下是本文的主要研究结果:（1）获得5对β防御素基因的特异引物,建立了实时荧光定量PCR优化体系以检测朱鹮β防御素基因的相对表达水平,成功构建了基于实时荧光定量PCR的浙江朱鹮种群血液β防御素基因表达谱。（2）阐明了β防御素基因在浙江朱鹮种群血液中的表达特征:AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7在朱鹮种群中广泛表达,表达该基因的个体数所占比例分别为89.2%、100.0%、100.0%、100.0%和83.8%;AvBD5（V5）、AvBD9及AvBD14在大部分朱鹮个体血液中不表达,不表达该基因的个体数所占比例分别为95.9%、73%和62.2%;AvBD8、AvBD10及AvBD13的表达具有组织特异性,在所有朱鹮血液中均不表达,而在其他朱鹮组织中广泛表达。（3）对于在朱鹮种群中广泛表达的5个基因,其相对表达水平从高至低排列依次为AvBD3>AvBD2>AvBD4>AvBD1α>AvBD7,其中AvBD3、AvBD2和AvBD4基因在朱鹮种群中的表达水平显着高于AvBD1α和AvBD7基因,表明AvBD3、AvBD2和AvBD4基因在圈养朱鹮种群中可能发挥了重要免疫作用。（4）朱鹮β防御素AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7基因的相对表达水平在两两之间呈现极显着的正相关,揭示了这5个在基因簇上邻近的基因可能发生了共进化事件。（5）朱鹮种群中不同个体的β防御素基因表达水平差异较大,体现了不同个体的免疫能力存在差异。其中,AvBD8、AvBD10及AvBD13在朱鹮中的表达具有组织特异性,在血液中不表达,在其他组织中广泛表达。（6）朱鹮幼鸟血液的AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7的相对表达水平高于亚成体及成鸟,其中AvBD2的表达水平在不同年龄的朱鹮中存在显着差异,表明β防御素在朱鹮幼鸟生长发育及适应环境的过程中发挥重要作用。（7）朱鹮亚成体血液的AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7基因的表达在种群中处于最低水平,说明朱鹮亚成体具有较低的免疫力,需要更多的营养和关注。此外,雌性与雄性朱鹮的β防御素基因表达水平无显着差异。（8）亲代朱鹮与子代朱鹮的AvBD1α、AvBD2、AvBD3、AvBD4及AvBD7基因表达水平表现出中度至高度的正相关关系,部分亲代朱鹮与子代朱鹮的β防御素基因表达水平的相关性达到了显着水平。（9）朱鹮AvBD2基因2000 bp的启动子区域不含CpG岛。AvBD2基因启动子区9个CpG位点与基因体区的28个CpG位点在不同朱鹮个体中发生了不同程度的甲基化现象,其中,启动子的CpG位点平均甲基化水平为59.2%,基因体的CpG位点平均甲基化水平为75.4%。（10）朱鹮AvBD2基因启动子区域CpG8位点高水平的甲基化可能下调了血液基因表达,而基因体区域不同CpG位点的甲基化可能对基因表达有着不同的调控作用,这暗示了DNA甲基化对AvBD2基因表达调控的复杂性。本研究为后人进一步研究朱鹮β防御素的表达及功能提供了理论依据及参考,在朱鹮人工圈养的实际保护工作中具有重要的指导意义。
张志鹏[2]（2019）在《奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价》文中提出随着乳制品消费水平的不断提高,人们越来越关注牛奶的质量。奶牛乳腺炎已经成为严重影响牛乳品质的重要因素,抗生素是比较有效的治疗手段,但抗生素带来的负效应日益凸显,病原菌耐药性增强、牛乳中抗生素残留等众多问题,导致奶牛产奶量降低和生乳品质下降。因此,研发新型可替代抗生素的产品,对于提升牧场经济效益、提高牛乳品质具有重大意义。本研究通过RT-PCR、同源重组等技术构建奶牛溶菌酶基因（Lyz）/气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。将上述质粒转染到奶牛的原代乳腺上皮细胞和泌乳高峰期的小鼠中,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白,荧光定量PCR和Western Blot检测技术验证上述质粒在乳腺上皮细胞水平和乳腺组织水平的特异性表达。通过细胞功毒实验分析表达产物抗菌效果,通过小鼠负重实验、耐缺氧实验、体重变化称量、血液生化指标和脏器指数评估重组质粒的安全性。旨在通过重组质粒实现奶牛溶菌酶、气管抗菌肽内源抗菌物质在乳腺组织的特异性表达,提高奶牛自身的免疫力,以达到防治乳腺炎和提高原料奶质量的目的。主要研究结果如下:1治疗奶牛乳腺炎表达质粒的构建通过RT-PCR从牛乳腺上皮细胞扩增Lyz、TAP基因编码序列,将其克隆到携带增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中,利用同源重组技术,以奶牛乳腺特异性表达β-乳球蛋白基因（BLG）启动子替换pEGFP-N1载体原有CMV启动子,构建了奶牛溶菌酶基因（Lyz）/气管抗菌肽基因（TAP）乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP。琼脂糖凝胶电泳结果显示,奶牛溶菌酶基因（LLz）、气管抗菌肽基因（TAP）和β-乳球蛋白基因（BLG）启动子序列,PCR扩增出与预期片段长度匹配的条带,且菌液PCR检测显示,每个目的片段均连接到增强型绿色荧光蛋白通用型表达载体pEGFP-N1中的所需位置。BLG基因启动子克隆测序后,通过BLAST比对发现,克隆的启动子序列与数据库中该基因5’上游相似性达99%。分析该片段,分别在第887bp-892bp、1188bp-1191bp、2080-2085bp位置存在GC-box、CAAT-box和TATA-box的启动子元件,表明所选片段为BLG基因的启动子片段。重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP测序结果显示与目的片段长度相符,目的基因阅读框正确,未出现错误位置。2重组质粒细胞表达活性及抗菌效果采用脂质体转染法将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP分别转染至奶牛原代乳腺上皮细胞（bPMEC）和人肾脏上皮细胞（HEK293T）,荧光显微镜观察到只有奶牛原代乳腺上皮细胞在转染两种重组质粒后均表现出绿色荧光,人肾脏上皮细胞无显色。荧光定量PCR检测也表明两种重组质粒只有在转染至奶牛原代乳腺上皮细胞后,基因Lyz、TAP相对表达量极显着高于未转染空白对照组,在人肾脏上皮细胞中无表达。用重组质粒转染的原代乳腺上皮细胞感染金黄色葡萄球菌后,细胞存活率显着高于未转染重组质粒的对照组,与未感染金黄色葡萄球菌、未转染重组质粒的空白组对比没有显着差异。细胞死亡率极显着低于对照组（P<0.01）。3重组质粒小鼠乳腺的表达和安全性评价通过尾静脉注射法使用基因体外转染试剂,将重组质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz和pBLG-EGFP-N1-TAP转染至处于泌乳高峰期的小鼠体内,荧光定量PCR结果显示,小鼠乳腺组织中基因TAP和Lyz的表达水平显着增加。在小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏中未检测到靶基因的表达。Western Blot检测显示,在转染重组质粒的小鼠乳腺组织中检测到重组质粒绿色荧光蛋白基因EGFP所表达的蛋白质产物,在未用重组质粒转染的小鼠乳腺组织中未检测到该表达产物。对小鼠的各种生理生化指标进行检测表明,发现重组质粒对小鼠行为活动指标、质量变化、血液生化指标、脏器指数无显着影响。本研究制备了两种新型乳腺特异性表达质粒,并验证了细胞水平、活体水平的表达情况和抗菌效果,为未来该质粒应用于奶牛乳腺炎的防治奠定了一定的基础,为奶牛乳腺炎的防治提供了新思路、新方法,为奶牛溶菌酶、奶牛气管抗菌肽在奶牛乳腺中特异性表达、研发新型可替代抗生素产品提供重要理论依据和技术支持。
许群[3]（2018）在《草鱼β-防御素克隆表达及转录调控的研究》文中认为防御素是抗菌肽中一种小的阳离子肽,在多种生物中分泌包括哺乳动物、鱼类、鸟类、昆虫、植物等。防御素具有广谱抗菌、抗病毒,不但在先天性免疫中防御素占据重要一环,而且在调节机体免疫系统中也发挥着作用。鱼类获得性免疫相对缺乏,因此,对鱼类防御素的研究十分有意义。根据物种来源及结构防御素可划分为:植物防御素、昆虫防御素和动物防御素。其中,动物β-防御素是目前研究最深、影响最广泛的一类防御素。在鱼类中,防御素的研究主要集中在克隆及理化性质等方面。其中在石斑鱼、青鳉、牙鲆、泥鳅、虹鳟、罗非鱼等鱼类中已克隆出β-防御素基因,研究了其在组织中表达情况。利用原核、真核表达及人工合成等方法获得了相应的β-防御素成熟肽蛋白,这些蛋白对多种细菌具有抑制作用。在本论文中,我们克隆了草鱼β-防御素1（DB1）、草鱼β-防御素2（DB2）、草鱼β-防御素3（DB3）的cDNA全长序列,序列号分别为KX906958.1、KX906958.1、KX906958.1。分析序列可知DB1全长序列705bp,开放阅读框（ORF）204bp,编码67的氨基酸残基,其中前24个氨基酸残基为信号肽,成熟肽等电点为7.82,分子量为4.5 KDa;DB2全长序列951bp,开放阅读框（ORF）207bp,编码68的氨基酸残基,其中前22个氨基酸残基为信号肽,成熟肽等电点为8.65,分子量为5.3 KDa;DB3全长序列1110bp,开放阅读框（ORF）213bp,编码70的氨基酸残基,其中前27个氨基酸残基为信号肽,成熟肽等电点为8.89,分子量为5.3 KDa。利用简并PCR扩增,我们还克隆了草鱼DB1、DB2、DB3全长基因,发现它们均有三个外显子和两个内含子,信号肽和成熟肽在外显子中的相对位置,及6个半胱氨酸的在外显子中的排布与其它鱼类结构相同。为研究草鱼β-防御素在鱼体内分布。我们使用RT-PCR对β-防御素基因表达水平进行了研究。在健康的草鱼中,我们发现草鱼DB1在眼部、皮肤有高表达;DB3在眼部有着极高的表达;DB2在眼部表达量较高但明显低于DB1、DB3。其余各组织表达量都维持在较低的水平,体现出明显的差异性表达。为研究草鱼β-防御素的转录调控作用。我们分别克隆了草鱼DB1、DB2、DB3部分启动子序列。软件分析发现DB1启动子上有多个NF-κB调控位点,DB2启动子上没有NF-κB调控位点,DB3启动子上发现1个NF-κB调控位点。为此我们构建了相关表达质粒p65-ORF-pET32a和p65-ΔC-pET32a,原核表达了草鱼p65（NF-κB家族主要调控亚基）重组蛋白及p65截断蛋白。体外凝胶阻滞实验显示纯化的体外重组蛋白p65对DB1和DB3启动子片段有明显的阻滞效果。之后我们构建了真核表达载体pCDNA3.1-p65-ORF,pCDNA3.1-p65-N和pCDNA3.1-p65-C与pGL-DB1-PF和pGL-DB3-PF瞬时共转染至CO（草鱼卵巢）细胞,发现p65能显着上调pGL-DB1-PF的荧光素酶活性。但相同实验中p65下调了pGL-DB3-PF的荧光素酶活性。在草鱼β-防御素抗菌活性的研究中,我们将DB1、DB2、DB3成熟肽序列分别构建在原核表达载体pET32a,经IPTG诱导,纯化获得了DB1、DB2、DB3重组蛋白,在肠激酶酶切下获得DB1、DB2、DB3成熟肽蛋白。在抗菌实验中发现DB1、DB3重组蛋白无杀菌活性,而DB2重组保持蛋白部分活性,对枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用。
杜玥[4]（2016）在《基于防御素的巨胞饮介导重组融合蛋白以及双靶向单链抗体重组融合蛋白的制备和抗肿瘤活性研究》文中进行了进一步梳理第一部分基于防御素HBD2的巨胞饮介导融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性和作用机制研究研究目的：据报道,K-Ras基因突变的胰腺癌细胞表现出明显增强的巨胞饮过程（elevated level of macropinocytosis）,来满足自身独特的营养需求,这一发现为针对巨胞饮过程的靶向抗肿瘤药物设计方案提供了理论依据。本研究利用白蛋白作为巨胞饮介导的靶向治疗药物输送载体,构建了一种白蛋白整合的β防御素（DF-HSA）,由“效应”分子人β防御素2（HBD2, DF）和巨胞饮导向性的人血清白蛋白（HSA）两部分组成,研究其对K-Ras突变胰腺癌的抗肿瘤活性。实验设计：选择胰腺癌MIA PaCa-2和BxPC-3细胞研究DF-HSA的巨胞饮摄取量和细胞毒性；并以HSA和HBD2分子作为实验对照,研究DF-HSA的体外抗肿瘤活性。建立人胰腺癌MIA PaCa-2裸鼠移植瘤模型进行DF-HSA体内靶向分布的考察和初步的药效评价。应用人类基因表达谱芯片检测HBD2和DF-HSA作用于MIA PaCa-2细胞后的基因表达差异。研究结果：K-Ras突变的胰腺癌MIA PaCa-2细胞中,DF-HSA通过巨胞饮介导的内化过程进入细胞；MIA PaCa-2细胞中巨胞饮的强度与K-Ras野生型的BxPC-3细胞相比明显增高；在细胞毒性方面,融合蛋白DF-HSA明显强于HSA和游离的防御素HBD2; DF-HSA诱导MIA PaCa-2细胞线粒体损伤,并激活肿瘤细胞线粒体凋亡途径。值得注意的是,DF-HSA对K-Ras突变的MIA PaCa-2胰腺癌裸鼠移植瘤有显着治疗效果,30mg/kg的DF-HSA抑瘤率达到81%且耐受良好。活体呈像结果显示,DF-HSA在体内能特异性富集并长时间滞留在肿瘤部位。经DF-HSA处理的MIA PaCa-2细胞基因表达谱变化明显,这些基因功能涉及基因表达和转录的调控、细胞代谢和细胞凋亡等多个方面。结论：β防御素与白蛋白整合的融合蛋白DF-HSA,可以通过巨胞饮介导的过程大量进入K-Ras突变的胰腺癌细胞,对胰腺癌裸鼠异种移植瘤显示特异性分布,并有良好的治疗效果。结果表明,DF-HSA在巨胞饮介导的肿瘤靶向治疗方面是-个是有应用前景的分子。第二部分基于防御素HBD1的双单链抗体融合蛋白的制备HBD1作为人体先天性免疫的重要组成成分,不仅具有广谱的抗微生物活性外,还具有杀伤肿瘤细胞和免疫调理的作用,而且不易产生耐药性。大量的研究显示,hbdl在体内作为一种抑癌基因存在,而HBD1不仅可以选择性地裂解杀伤肿瘤细胞,还能发挥抗肿瘤免疫的作用。所以HBD1具有良好的抗肿瘤潜能和应用前景。由于涉及肿瘤的生长、转移和血管生成等过程,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）被认为是一类理想的靶标。明胶酶属于基质金属蛋白酶的一种,包括MMP-2和MMP-9两种组分,其能够破坏基底膜及细胞外基质的完整性,参与肿瘤生长、侵袭和转移,并且在肿瘤血管发生和新生血管的形成过程中都起到重要作用。据报道,明胶酶在侵袭和转移性肿瘤如在胰腺癌中大量表达。本研究的目的是选择人β防御素1 （HBD1）作为抗肿瘤活性分子,通过基因工程手段构建了以LDP为支架具有靶向明胶酶（MMP2/9）的防御素HBD1融合蛋白β1-dFv-LDP,利用抗体靶向结合肿瘤细胞表面及微环境MMP2/9的特性,将HBD1定向运输至肿瘤部位,使其发挥特异性肿瘤细胞毒作用和抗肿瘤免疫作用,同时抑制MMP2/9的表达或者活性,为胰腺癌靶向治疗药物的研究提供借鉴与参考。本研究中我们通过分子生物学方法构建了重组表达载体PET-30a/β1-dFv-LDP,通过大肠杆菌表达体系诱导表达,产物主要以包涵体的形式存在,经纯化复性后每升发酵液可以获得20mgβ1-dFv-LDP融合蛋白,该融合蛋白对明胶酶抗原具有与dFv-LDP相似的的亲和活性。第三部分靶向EGFR/明胶酶的双特异性单链抗体融合蛋白Fv（E）-LDP-Fv（M）的制备多靶向治疗策略一直是抗肿瘤研究中最热门的话题之一。其中双特异性抗体能同时高效结合两种抗原表位,是多重调控功能的联合靶向抗肿瘤的有效策略之一。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）属于跨膜受体酪氨酸激酶（ErbB）家族成员；EGFR在多种肿瘤细胞表面都异常表达,与人类癌症关系密切,被认为是研究肿瘤治疗的一个重要分子靶点。此外,肿瘤基质金属蛋白酶（MMPs）也在肿瘤进展和侵袭转移过程中起到重要作用,其中明胶酶（MMP-2和MMP-9）在多种肿瘤组织中异常表达,使其成为另一个理想的靶向治疗靶点。力达霉素（Lidamycin, LDM）是一种具有高效抗肿瘤活性的大分子肽类抗肿瘤抗生素,由辅基蛋白（LDP）和烯二炔结构的发色团（AE）两部分组成,发色团是力达霉素分子的活性部分。基于EGFR和MMP2/9在肿瘤发生发展过程中的重要作用,本研究的目的是制备一种同时靶向EGFR和明胶酶的并具有药物导向的双特异性单链抗体融合蛋白Fv（E）-LDP-Fv（M）,该融合蛋白由三部分组成：两个分别靶向EGFR和MMP2/9的scFv作为导向分子,力达霉素作为“弹头”药物,并对其体内外抗肿瘤活性进行检测。表达该重组蛋白的质粒pET30a（+）/Fv（E）-LDP-Fv（M）经过序列测定后,转化于大肠杆菌Transetta（DE3）中,进行诱导表达,产物主要以包涵体的形式存在,目的蛋白经纯化、复性后,每升发酵液可以获得0.5 mg有活性的Fv（E）-LDP-Fv（M）融合蛋白,该融合蛋白对EGFR和明胶酶抗原均有较好的亲和活性。
符梅[5]（2013）在《牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建》文中指出本研究以牦牛β-防御素5基因为研究对象，分别对牦牛β-防御素5基因进行原核和真核表达研究。原核表达以pET-32a（+）为表达载体，将构建好的重组原核表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）进行表达，检测其重组蛋白的体外抑菌活性。真核表达以奶牛β-酪蛋白基因（β-casein，CSN2）5’端和3’端为调控成分，牦牛β-防御素5基因CDS区为表达序列，构建牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体，将表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞，分析牦牛β-防御素5基因的表达效率。具体如下：1.采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增牦牛BNBD5基因成熟肽编码区及BNBD5基因开放阅读框。PCR产物经胶回收纯化后，克隆于pMD19-T载体的T位点。测序结果表明，获得了138bp的BNBD5成熟肽编码片段及219bp的开放阅读框，成熟肽编码45个氨基酸残基，内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现，该基因的序列与牛的mRNA同源性最高，可达到86.2%。2.将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，于37°C06h间进行诱导表达，SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况，并对该重组蛋白进行纯化测定其体外抗菌活性。结果表明，经IPTG诱导，获得了分子量约为25kDa的牦牛β-防御素5基因成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散法表明，0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抗菌作用。3.利用普通PCR法扩增了奶牛CSN25’端1947bp（包括1.7kb的上游调控序列以及5’不翻译区的第一个外显子）、3’端620bp（包括最后一个内含子、最后一个不翻译的外显子和150bp的侧翼）调控区及牦牛β-防御素5基因的开放阅读框，并利用双酶切定向克隆的方法，将他们克隆于pEGFP-C1真核表达载体上，构建了牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体。4.采用脂质体转染的方法将构建的牦牛β-防御素5基因乳腺特异性表达载体导入体外培养的牦牛乳腺上皮细胞中，经新霉素抗性基因（G418）初步筛选后，借助荧光显微镜观察到了绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达。通过设计一对特异性引物，对初步筛选的阳性克隆进行检测，结果表明，表达载体已整合到乳腺上皮细胞的染色体中，证明了构建的乳腺特异性表达载体的可行性。
刘军[6]（2011）在《转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产》文中指出利用核移植技术生产转基因动物对农业生产和生物医学领域具有重要的应用价值。然而,核移植的总体效率较低,而且核移植动物存在多种异常表现,严重限制了该技术的广泛应用。而且转基因核移植技术操作步骤繁琐,全世界仅个别实验室可以利用该技术批量生产转基因动物。为了生产抗乳腺炎转基因奶山羊,本研究对山羊体细胞核移植体系和转基因供体细胞的制备进行了一系列优化。1.研究了激活时间、细胞松弛素B（CB）处理、胚胎培养条件、移植时间和移植胚胎数等因素对山羊核移植胚胎体内和体外发育的影响。结果显示,融合后2和3 h 90%以上的供体核显示浓缩型和中期样的染色体形态,而且激活后的囊胚率显着高于1、4和5 h的胚胎（P < 0.05）;CB处理组的囊胚发育率（24.8% vs. 17.7%; P < 0.05）和克隆胚胎早期妊娠率显着高于对照组（31.3% vs. 10.3%; P < 0.05）,有4只克隆羊出生;每只受体移植20和30枚胚胎组的胎儿存活率高于10和40枚组。结果表明,融合后胚胎在CB中处理2～3 h再激活,可提高山羊克隆胚胎的体内和体外发育能力,每只受体移植20～30枚早期克隆胚胎,早期妊娠率稳定在45%以上和胎儿出生率为38.2%。2.研究了不同胎儿成纤维细胞系的增殖能力、染色体稳定性、细胞周期和凋亡、转染效率和转人溶菌酶基因克隆山羊的生产效率。结果显示,5个细胞系（GFF1、GFF2、GFF3、GFF4和GFF5）中增殖能力和染色体稳定性:GFF1、GFF2>GFF4、GFF3;处理后G1/G0期细胞比例GFF4>GFF3、GFF5>GFF2>GFF1;细胞凋亡:GFF4<GFF1、GFF5<GFF3<GFF2;转基因效率:GFF2、GFF1>GFF5、GFF4、GFF3;不同转基因细胞系克隆胚胎体外发育能力:F2C11≥F3C1、FC3、F1C7、F3C2、F2C2>F5C3、F5C3;转基因克隆胚胎体内发育能力:FC3、F1C7>F3C1、F3C2。结果说明,来源不同胎儿的成纤维细胞系的增殖能力和染色体稳定性不同,增殖能力和染色体稳定性较高的细胞系转染后的克隆形成率和扩增率较高,此外各转基因细胞系的核移植效率差异显着,转基因核移植过程中应当选择多个转基因细胞系作为供体细胞,可以降低风险;本研究获得健康转人溶菌酶基因克隆山羊,早期妊娠率为30%,核移植效率1.2%。3.利用转基因核移植技术生产转人β-防御素3（Human beta-defensin-3,HBD3）基因克隆山羊。结果显示,共获得7个转基因阳性细胞克隆,以其中两个转基因细胞系为供体细胞构建克隆胚胎,30 d的妊娠率为40.5%（32/79）,妊娠到期的比例为21.5%（17/79）,17只羊分娩产下26只小羊,产羔率为32.9%（26/79）其中多胎率为35.3%（6/17）,核移植总体效率为1.4 %。通过PCR和Southern杂交鉴定,9只存活的小羊全部为转基因羊,拷贝数为5个左右,反向PCR鉴定整合位点5’端距离β-乳球蛋白前体基因（beta-lactoglobulin precursor）1587 bp,3’端距离糖基转移酶6蛋白1基因9598 bp（glycosyltransferase 6 domain-containing protein 1）。4.利用Tricine SDS-PAGE电泳及Western Blot检测目的基因HBD3的表达,并以纯化的转基因山羊乳腺上皮细胞进行了继代克隆,研究继代克隆对核移植效率的影响。结果表明,转基因羊乳腺上皮细胞经过诱导可分泌人防御素3蛋白;转基因羊乳腺上皮细胞（TGMEC）克隆胚胎的融合率、卵裂率和囊胚发育率与非转基因羊乳腺上皮细胞（GMEC）的克隆胚差异不显着,但两组实验的融合率较低（分别为54.5%和49.7%）,早期妊娠率为20%,但没有获得克隆后代。结果说明,继代核移植不能提高转基因克隆胚胎的发育能力。本论文开展的系列研究,对于完善山羊转基因核移植技术体系,批量生产转基因抗病动物,具有重要的应用价值。
马会明[7]（2010）在《转人β防御素3基因克隆牛的研制及检测》文中研究表明?本试验研究分别从DNA、RNA和蛋白水平检测出发,通过载体鉴定、细胞筛选、阳性细胞株鉴定,采用优化的转基因克隆的方法生产转基因牛,并对生产的转基因牛外源基因整合位点和拷贝数等鉴定方法确定转基因克隆牛外源基因整合的准确性,从而为转基因克隆牛进一步生产研究奠定基础。⑴乳腺上皮细胞分离纯化、鉴定及转染试验通过组织块贴壁培养和差速分离纯化的方法分离得到生物学特性正常的乳腺上皮细胞,转染前后的细胞周期和细胞核型没有变化,正常分泌β-酪蛋白。电穿孔转染后,经过600μg/mL的G418筛选,得到生物学特征正常的阳性细胞株,hBD3蛋白和EGFP蛋白表达正确,可以进行进一步鉴定生物学活性。⑵乳腺上皮细胞阳性细胞株抑菌活性分析试验中用southern blot方法鉴定乳腺上皮细胞阳性细胞株有外源基因整合。添加100nM的组胺时分泌上清中人防御素3蛋白含量明显增高。采用琼脂扩散法和液体细菌生长抑制试验测定分泌的上清的体外抑菌活性,结果显示对大肠杆菌、葡萄球菌,无乳链球菌、停乳链球菌和化脓链球菌都有抑菌作用。⑶核移植生产转基因克隆牛试验中活体采集卵母细胞提高卵母细胞成熟率（94.6% vs 82.2%）和囊胚发育率（37.7% vs 28.4%）;试验中添加浓度为50μM的半胱胺,明显提高成熟效率（89.9% vs 82.7%）和囊胚发育率（42.2% vs 33.5%）。试验中使用第2代至第4代的成纤维阳性细胞提高卵裂率和囊胚率;使用G1期和G0/G1期成纤维阳性细胞卵裂率（78.9% vs 82.4%）和囊胚率（26.8% vs 33.3%）没有明显差异,在胎儿出生率上有明显差异（20.6% vs 13.2%）。结果表明,利用活体采卵方法和添加半胱胺可以保证卵母细胞质量,提高卵母细胞成熟率和囊胚发育率,使用G0/G1期细胞做核移植可以提高胎儿出生率,最后获得了20头转人β防御素3基因克隆奶牛。⑷转基因克隆牛的检测试验通过southern blot杂交鉴定转基因克隆牛外源基因已经整合到基因组。绝对定量PCR法检测外源基因的拷贝数,检测结果显示外源基因拷贝数为1。反向PCR法确定了转基因克隆牛整合位点两端676bp大小的侧翼序列,位于牛4号染色体上1676325-1676638,1676722-1677079位置,与牛基因组中NW001494934.2基因序列部分序列同源,序列同源性为89%,插入位点上游基因为牛T细胞受体γC4（TRG C4）和氮（α）-乙酰转移酶38（NAA38）,下游没有功能基因。以上结果表明,实验所用的载体通过乳腺上皮阳性细胞株验证有抗菌功能,转基因克隆牛多以单拷贝在基因组整合,这些检测及鉴定为继续研究转基因克隆牛的遗传和表达稳定性建立了牢固基础。
栾红雨[8]（2010）在《奶牛β-防御素TAP基因克隆及乳腺特异性表达载体构建》文中研究指明防御素在机体先天性免疫系统防御机制中发挥重要作用。乳腺炎可诱导奶牛乳腺组织中β-防御素增量表达,使患乳腺炎局部防御作用增强,表明在乳房炎的发生和防御过程中β-防御素发挥重要的作用。用乳腺生物反应器制备目的药用蛋白是目前生物技术研究的热点,但外源蛋白在乳腺组织中特异、高效表达受诸多因素影响,仍需进一步研究。本研究克隆了奶牛乳腺组织中β-防御素气管抗菌肽（TAP）基因,构建TAP基因真核表达质粒；进一步用奶牛β-乳球蛋白（BLG）基因启动子和5′端调控序列构建TAP基因乳腺特异性表达载体,并初步进行了表达。1.利用PCR方法从奶牛基因组DNA中扩增BLG基因5′端调控序列（3 114 bp）,其中包含第一、二个外显子和内含子,将其插入pMD19-T simple载体。序列分析表明,克隆的序列和原序列相似性为97%,包含多个乳腺特异性表达调控元件,可用于构建乳腺特异性表达载体,调控外源目的蛋白表达。2.采用RT-PCR方法从奶牛乳腺组织中扩增气管抗菌肽（TAP）基因,重组到pMD19-T simple载体中进行序列分析。结果显示,克隆的TAP基因包含完整的开放阅读框（ORF）195 bp,与牛TAP基因相似性达93.8%；该ORF编码的64个氨基酸,含有β-防御素特征性结构即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基。TAP基因cDNA完整开放阅读框的克隆,为进一步开发应用重组牛β-防御素奠定了基础。3.将克隆的奶牛BLG 5′端调控序列与酶切回收的真核表达质粒pEGFP-C1连接,取代原表达质粒中CMV启动子,构建pBLG-EGFP-C1通用乳腺特异性表达载体。酶切回收TAP基因序列,分别插入真核表达质粒pEGFP-C1和构建的乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-C1的多克隆位点,构建TAP基因的两种表达质粒：pEGFP-C1-TAP和pBLG-EGFP-G1-TAP。4.运用奶牛乳汁分离培养乳腺上皮细胞和组织块法培养原代奶牛乳腺上皮细胞,将构建的乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-C1-TAP脂质体法转染原代乳腺上皮细胞,倒置荧光显微镜下观察与TAP基因融合表达的绿色荧光蛋白。72 h时观察到融合表达的绿色荧光蛋白。5.将pEGFP-C1-TAP质粒脂质体包埋,转染到COS 7细胞中,倒置荧光显微镜下观察与TAP基因融合表达的绿色荧光蛋白,并用RT-PCR法检测COS 7细胞中奶牛TAP mRNA的表达情况。72h时观察到融合表达的绿色荧光蛋白,并在COS7细胞中检测到奶牛TAP mRNA的转录。6.脂质体包埋pBLG-EGFP-C1-TAP和pEGFP-C1-TAP质粒,分别注射于泌乳期母兔乳腺组织中,运用RT-PCR法检测相应母兔乳腺组织中奶牛TAP mRNA的表达情况。发现TAP mRNA在兔乳腺组织中得到表达,与pEGFP-C1-TAP质粒处理母兔的乳区相比,pBLG-EGFP-C1-TAP质粒处理母兔乳区TAP表达量提高。证明构建的TAP基因乳腺特异表达质粒可在乳腺组织中表达,为进一步研制防御素的乳腺生物反应器奠定一定基础。
马晶晶[9]（2009）在《hBD3基因乳腺特异性表达载体的构建及转hBD3基因牛克隆胚的制备》文中研究表明人β-防御素3（humanβdefensin 3,hBD3）分布于人体皮肤、黏膜的上皮细胞中,是一种由45个氨基酸组成的抗菌肽,具有广谱、强效的抗多种微生物感染的作用,特别是对金黄色葡萄球菌等阳性菌有强烈杀伤作用,hBD3作为一种肽类抗生素具有巨大的开发价值。奶牛乳腺生物反应器可利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控成分驱动外源基因在动物乳腺中高效表达,以期从乳汁中源源不断地获得大量有价值的外源蛋白,因此,通过奶牛乳腺生物反应器来高效表达hBD3基因,可以解决hBD3来源有限和化学合成成本高的问题。构建能够高效表达目的蛋白的乳腺表达载体是制备乳腺生物反应器的关键,基于此,本研究通过克隆包括完整的外显子区和内含子区的hBD3基因,构建hBD3乳腺特异性表达载体pEBB,用脂质体法转染奶牛乳腺上皮细胞并对其表达进行检测。然后,将该载体转入胎牛成纤维细胞,得到的阳性细胞通过体细胞核移植（SCNT）来产生转hBD3基因的克隆囊胚。结果如下:1.通过PCR技术成功的从人胎盘组织中扩增出长度为1156 bp的hBD3基因,包括完整的外显子区和内含子区。序列分析表明,所克隆的基因与GeneBank上公布的hBD3基因序列同源性达99 %,密码子阅读框正确,有4个位点发生突变,这4个位点均在内含子区,不会对基因表达造成影响。2.利用平末端克隆的方法,将hBD3基因表达序列与初级乳腺特异性表达载体pBCP融合在一起,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建了含有抗性基因neo和绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的hBD3非融合型乳腺特异性表达载体pEBB。3.通过脂质体法将表达载体pEBB转入体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,经G418抗性筛选,得到的阳性细胞可稳定地表达绿色荧光蛋白,并且主要在细胞质中表达,将这些阳性细胞经扩大培养得到了转hBD3基因的奶牛乳腺上皮细胞。RT-PCR法检测结果表明含有内含子的hBD3基因可在牛乳腺上皮细胞中初步表达,该载体pEBB可用来制备高效表达hBD3的奶牛乳腺生物反应器。4.筛选出的转hBD3基因的胎牛成纤维细胞经体细胞核移植成功发育到囊胚,经PCR鉴定,hBD3基因已整合到胚胎基因组中,这些胚胎可通过胚胎移植生产转人β防御素3基因的奶牛。
彭巍[10]（2009）在《HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达》文中研究指明转基因动物乳腺反应器是一种利用转基因技术在动物乳腺中特异性表达多肽药物、疫苗、抗体等蛋白的技术。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有效率高、成本低廉等优点,并且表达的重组蛋白具有天然生物活性。由于HBD-3在人体正常组织中的含量很少,分离纯化难度较大,通过提取所能获得的HBD-3的量是极其有限的。而化学合成成本太高,耗资巨大,因此通过基因工程技术来获得大量的抗菌肽HBD-3成为首选之路。虽然通过原核表达系统获得的重组HBD-3在抗菌活性、生化特征上与提取的天然HBD-3毫无差异,但以往进行的抗菌肽重组表达研究普遍存在表达量和活性偏低的现象。这可能是因为真核基因在原核细胞中表达时,密码子使用频率不同;也可能是因为在大肠杆菌中表达的产物常以包涵体形式存在,纯化后的蛋白还需要进一步的复性才具有活性。因此,本研究采用奶牛乳腺上皮细胞真核表达系统,通过RT-PCR获得HBD-3 cDNA 45个成熟肽,分离纯化PCR产物,链接到pMD-19载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pMhD ,并对其进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,所克隆的HBD-3基因为210 bp。将HBD-3基因插入到牛β-酪蛋白启动子5’调控区和3’端调控区之间,构成重组质粒pBCD,利用SacI/SacII双酶切质粒pBCD得到3.0kb的BCD基因片段,与经同样双酶切的真核表达载体pEGFP-C1进行定向连接,获得以牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白（Enhancer Green Fluorescent Protein,EGFP）为报告基因的HBD-3基因乳腺表达载体pEBCD。最终将构建成功的表达载体通过脂质体法转染奶牛胎儿成纤维细胞和乳腺上皮细胞,转染24-48 h后,在倒置显微镜下观察转染效率;用G418进行抗性细胞克隆的药物筛选,2周后,提取G418抗性细胞克隆的基因组DNA和细胞总RNA,用PCR和RT-PCR方法检测出阳性转基因细胞克隆,鉴定转基因细胞是否整合到细胞的基因组中,以便最终为通过乳腺生物反应器生产药用蛋白的转基因动物提供核移植供体细胞,然后扩大培养,冻存阳性细胞,为下一步进行核移植提供供体细胞;同时,将构建的表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,筛选阳性克隆进行扩大培养,加入胰岛素,氢化可的松和催乳素进行诱导表达。诱导48 h后,收获上清液,超滤浓缩目的蛋白进行Western blot检测分析。进而证实目的基因HBD-3能够整合到宿主细胞的基因组上,从而使其能以β-酪蛋白为启动子得以到高效表达,利于蛋白的纯化,进而为通过利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白奠定基础。
二、人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析（论文提纲范文）
（1）浙江朱鹮种群β防御素基因表达谱及DNA甲基化研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 朱鹮的研究背景 |
| 1.1.1 朱鹮的生物学特征 |
| 1.1.2 朱鹮的历史分布与现状 |
| 1.1.3 朱鹮的保护生物学研究 |
| 1.2 防御素 |
| 1.2.1 防御素概述 |
| 1.2.2 β 防御素的研究进展 |
| 1.3 基因表达的研究背景 |
| 1.3.1 基因表达的常用检测方法 |
| 1.3.2 实时荧光定量PCR的原理及应用 |
| 1.4 DNA甲基化 |
| 1.4.1 DNA甲基化概述 |
| 1.4.2 DNA甲基化的检测方法 |
| 1.4.3 DNA甲基化调控的相关研究 |
| 1.5 立项依据、研究目的及研究内容 |
| 第二章 朱鹮种群血液β防御素基因表达谱研究 |
| 2.1 研究内容 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验样品 |
| 2.2.2 实验试剂及耗材 |
| 2.2.3 实验仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 朱鹮总RNA提取 |
| 2.3.2 反转录合成cDNA |
| 2.3.3 实时荧光定量PCR |
| 2.3.4 朱鹮的性别鉴定 |
| 2.3.5 亲子朱鹮防御素基因表达相关性分析 |
| 2.3.6 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 总RNA提取及检测结果 |
| 2.4.2 反转录的验证结果 |
| 2.4.3 实时荧光定量PCR引物筛选结果 |
| 2.4.4 朱鹮种群血液β防御素基因表达谱 |
| 2.4.5 不同β防御素基因表达水平相关性分析 |
| 2.4.6 2018 年朱鹮性别鉴定结果 |
| 2.4.7 不同性别及年龄的朱鹮β防御素基因相对表达水平差异分析 |
| 2.4.8 亲代与子代朱鹮β防御素基因表达水平相关性分析 |
| 第三章 朱鹮β防御素AvBD2 基因的DNA甲基化研究 |
| 3.1 研究内容 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验样品 |
| 3.2.2 实验试剂及耗材 |
| 3.2.3 实验仪器及设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 朱鹮血液基因组DNA的提取 |
| 3.3.2 DNA的亚硫酸氢盐转化 |
| 3.3.3 AvBD2 基因启动子区CpG岛预测 |
| 3.3.4 引物设计及PCR |
| 3.3.5 克隆测序 |
| 3.3.6 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 DNA提取及检测结果 |
| 3.4.2 AvBD2 基因启动子CpG岛预测及引物筛选结果 |
| 3.4.3 朱鹮AvBD2 基因的甲基化检测结果 |
| 3.4.4 不同基因表达水平朱鹮的DNA甲基化水平差异分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 在朱鹮人工圈养种群中发挥重要作用的β防御素 |
| 4.2 朱鹮β防御素基因存在共进化现象 |
| 4.3 影响朱鹮血液β防御素基因表达的因素分析 |
| 4.4 亲子代朱鹮β防御素基因表达的相关性对组建野化放归种群的启示 |
| 4.5 启动子与基因体区域CpG位点的甲基化对AvBD2 基因表达的调控机制分析 |
| 第五章 结论、创新点与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
（2）奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 奶牛乳腺炎的病因及危害 |
| 1.1 病原微生物因素 |
| 1.2 饲养管理因素 |
| 1.3 奶牛自身因素 |
| 1.4 奶牛乳腺炎的危害 |
| 2 奶牛乳腺炎治疗技术研究进展 |
| 3 奶牛溶菌酶的研究进展 |
| 3.1 奶牛溶菌酶的生物学功能 |
| 3.2 奶牛溶菌酶的应用 |
| 4 奶牛气管抗菌肽的研究进展 |
| 4.1 抗菌肽生物学功能 |
| 4.2 抗菌肽的应用 |
| 5 重组质粒应用于治疗奶牛乳腺炎的设想 |
| 第二章 治疗奶牛乳腺炎表达质粒的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 血样、载体与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 基因克隆模板获取 |
| 2.3 奶牛乳腺特异性表达启动子(BLG)基因序列的克隆与鉴定 |
| 2.4 Lyz基因编码序列的克隆与鉴定 |
| 2.5 TAP基因编码序列的克隆与鉴定 |
| 2.6 Lyz/TAP基因乳腺特异性表达质粒的构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 奶牛BLG启动子序列PCR扩增与序列分析 |
| 3.2 奶牛Lyz基因编码序列PCR扩增与重组质粒鉴定 |
| 3.3 奶牛TAP基因编码序列PCR扩增与重组质粒鉴定 |
| 3.4 奶牛Lyz/TAP基因乳腺特异性表达质粒pBLG-EGFP-N1-Lyz/TAP的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 乳腺特异性表达启动子的筛选 |
| 5 小结 |
| 第三章 重组质粒转染细胞表达活性及抗菌效果 |
| 1 材料 |
| 1.1 乳腺组织与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 奶牛乳腺原代上皮细胞分离培养与纯化 |
| 2.2 Lyz/TAP重组质粒在乳腺上皮细胞的特异性表达 |
| 2.3 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞的抗菌效果 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Lyz/TAP基因在奶牛乳腺上皮细胞中的特异性表达 |
| 3.2 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞表达量分析 |
| 3.3 Lyz/TAP重组质粒转染奶牛乳腺上皮细胞的抗菌效果分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒在奶牛乳腺上皮细胞的特异性表达 |
| 4.2 重组质粒转染对乳腺上皮细胞抗菌能力的影响 |
| 5 小结 |
| 第四章 Lyz/TAP重组质粒小鼠乳腺表达及安全性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠体内转染Lyz/TAP重组质粒 |
| 2.2 Lyz/TAP重组质粒在小鼠乳腺组织中的特异性表达 |
| 2.3 Lyz/TAP重组质粒对小鼠的安全性评价 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 荧光定量PCR和Western Blot实验结果 |
| 3.2 Lyz/TAP重组质粒对小鼠行为活动的影响 |
| 3.3 Lyz/TAP重组质粒对小鼠呼吸运动的影响 |
| 3.4 Lyz/TAP重组质粒对小鼠体重的影响 |
| 3.5 Lyz/TAP重组质粒对小鼠血液指标的影响 |
| 3.6 Lyz/TAP重组质粒对小鼠脏器指数的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒在小鼠乳腺组织的特异性表达 |
| 4.2 重组质粒对小鼠安全性的影响 |
| 5 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（3）草鱼β-防御素克隆表达及转录调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 防御素的分类和结构特征 |
| 1.1.1 α-防御素 |
| 1.1.2 β-防御素 |
| 1.1.3 θ-防御素 |
| 1.2 防御素生物学活性 |
| 1.2.1 抗菌活性及作用机制 |
| 1.2.2 抗病毒作用 |
| 1.2.3 抗肿瘤作用 |
| 1.2.4 其它生物学活性 |
| 1.2.5 应用前景 |
| 1.2.6 鱼类β-防御素研究进展 |
| 1.2.7 鱼类β-防御素转录调控分析 |
| 1.2.8 本论文研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 细胞实验主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 菌种与细胞、质粒载体 |
| 2.1.5 引物表 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 草鱼DB1、DB2、DB3基因克隆 |
| 2.3.1 DB1、DB2、DB3的同源克隆 |
| 2.3.2 DB13'末端的扩增 |
| 2.3.3 DB15'末端的扩增 |
| 2.3.4 草鱼DB1、DB2、DB3全长的拼接 |
| 2.3.5 草鱼DB1、DB2、DB3的系统进化分析 |
| 2.4 草鱼DB1、DB2、DB3组织表达水平分析 |
| 2.4.1 草鱼DB1、DB2、DB3组织表达检测 |
| 2.4.2 LPS刺激草鱼后DB1、DB2、DB3组织表达分析 |
| 2.5 草鱼p65和DB1、DB2、DB3启动子亲和分析 |
| 2.5.1 草鱼DB1、DB2、DB3启动子的克隆 |
| 2.5.2 草鱼DB1、DB3启动子质粒的构建 |
| 2.5.3 草鱼p65全长及截断蛋白的原核表达及纯化 |
| 2.5.4 草鱼DB1、DB2、DB3启动子和草鱼p65的亲和性分析 |
| 2.6 草鱼p65对DB1、DB3转录调控 |
| 2.6.1 CO细胞培养 |
| 2.6.2 细胞转染 |
| 2.6.3 荧光素酶活性检测 |
| 2.6.4 草鱼DB3启动子的转录调控分析 |
| 2.7 草鱼DB1、DB2、DB3重组蛋白抗菌活性分析 |
| 2.7.1 草鱼DB1、DB2、DB3原核表达质粒的构建 |
| 2.7.2 草鱼DB1、DB2、DB3原核表达与纯化 |
| 2.7.3 草鱼DB1、DB2、DB3重组蛋白肠激酶切 |
| 2.7.4 草鱼DB1、DB2、DB3抗菌实验 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 草鱼DB1、DB2、DB3的克隆及其分析 |
| 3.1.1 草鱼DB1、DB2、DB3全长cDNA的克隆 |
| 3.1.2 草鱼DB1、DB2、DB3全长cDNA序列分析 |
| 3.1.3 草鱼DB1、DB2、DB3基因结构分析 |
| 3.2 草鱼DB1、DB2、DB3系统进化分析 |
| 3.3 草鱼DB1、DB2、DB3的组织表达 |
| 3.3.1 草鱼DB1、DB2、DB3的组织固有表达 |
| 3.3.2 草鱼DB1、DB2、DB3在LPS刺激后的表达 |
| 3.4 草鱼DB1、DB2、DB3启动子克隆及分析 |
| 3.4.1 草鱼DB1启动子特征 |
| 3.4.2 草鱼DB3启动子特征 |
| 3.5 草鱼DB1、DB3转录调控分析 |
| 3.5.1 草鱼p65全长及截断蛋白的原核表达和纯化 |
| 3.5.2 草鱼DB1启动子和p65的亲和性分析 |
| 3.5.3 草鱼DB3启动子和p65的亲和性分析 |
| 3.5.4 草鱼p65对草鱼DB1基因的转录调控分析 |
| 3.5.5 草鱼p65对草鱼DB3基因的转录调控分析 |
| 3.6 草鱼DB1、DB2、DB3抑菌实验 |
| 3.6.1 草鱼DB1、DB2、DB3蛋白的原核表达和纯化 |
| 3.6.2 草鱼DB1、DB2、DB3肠激酶切 |
| 3.6.3 草鱼DB1、DB2、DB3蛋白抑菌实验 |
| 第四章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（4）基于防御素的巨胞饮介导重组融合蛋白以及双靶向单链抗体重组融合蛋白的制备和抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 基于防御素HBD2的巨胞饮介导融合蛋白的制备及其抗肿瘤活性和作用机制研究 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第二部分 基于防御素HBD1的双单链抗体融合蛋白的制备 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 参考文献 |
| 第三部分 靶向EGFR/明胶酶的双特异性单链抗体融合蛋白FV_((E))-LDP-FV_((M))的制备 |
| 前言 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果与讨论 |
| 4. 参考文献 |
| 结论和创新点 |
| 文献综述 双特异性抗体在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 1. 双特异性抗体的制备方法 |
| 2. 双特异性抗体的分类及活性 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（5）牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1.1 防御素的研究进展 |
| 1.1.1 防御素的来源和分布 |
| 1.1.2 防御素的分子结构特征 |
| 1.1.3 抗菌肽的作用机制 |
| 1.1.4 防御素的生物学活性 |
| 1.1.5 防御素的应用前景 |
| 1.2 转基因动物的研究进展 |
| 1.2.1 转基因动物的研究历史 |
| 1.2.2 转基因技术 |
| 1.2.3 转基因技术面临的问题 |
| 1.3 乳腺生物反应器的研究进展 |
| 1.3.1 转基因乳腺生物反应器的概述 |
| 1.3.2 乳腺特异性表达载体调控元件的类型 |
| 1.3.3 乳腺表达载体检验方法 |
| 1.3.4 动物乳腺生物反应器存在的问题及展望 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 牦牛β-防御素 5 基因的克隆及序列分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 牦牛肺组织总 RNA 提取及检测 |
| 1.2.2 牦牛 BNBD5 成熟肽基因 RT-PCR 扩增结果 |
| 1.2.3 重组子的筛选及双酶切鉴定 |
| 1.2.4 牦牛 BNBD5 成熟肽 cDNA 序列分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 牦牛β-防御素 5 基因的原核表达及产物体外抗菌活性的鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 2.2.2 IPTG 诱导不同时间牦牛β-防御素 5 的表达 |
| 2.2.3 纯化蛋白 |
| 2.2.4 重组蛋白浓度的测定结果 |
| 2.2.5 重组蛋白抑菌活性的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 牦牛β-防御素 5 基因真核表达载体的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CSN25' 端、CSN23' 端调控区及牦牛 BNBD5 ORF 的 PCR 扩增结果 |
| 3.2.2 质粒 pEGFP-C1 和 pMD19-BNBD5 的双酶切结果 |
| 3.2.3 质粒 pEGFP- BNBD5 和 pMD19-BC3 的双酶切结果 |
| 3.2.4 质粒 pEGFP- BNBD5-BC3 和 pMD19-BC5 的双酶切结果 |
| 3.2.5 质粒 pEGFP- BNBD5-BC3-BC5 的双酶切鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 牦牛β-防御素 5 基因转染牦牛乳腺上皮细胞及其在细胞中的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 质粒的纯化 |
| 4.2.2 牦牛乳腺上皮细胞的原代及传代培养 |
| 4.2.3 抗性筛选结果 |
| 4.2.4 细胞转染和筛选 |
| 4.2.5 PCR 检测细胞转染的结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 结论、创新点以及存在的问题 |
| 1 本论文的结论 |
| 2 本论文的创新点 |
| 3 本论文存在的不足之处 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 提高体细胞核移植效率的研究进展 |
| 1.1 体细胞核移植技术的发展 |
| 1.2 体细胞核移植方法 |
| 1.3 提高核移植效率的方法 |
| 1.3.1 受体胞质的选择 |
| 1.3.2 供体细胞的选择和处理 |
| 1.3.3 激活方法对核移植效率的影响 |
| 1.3.4 胞质提取物处理对核移植效率的影响 |
| 1.3.5 表观遗传修饰药物处理对核移植效率的影响 |
| 1.3.6 抑制Xist 基因的表达对核移植效率的影响 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 转基因家畜的研究和应用 |
| 2.1 转基因动物的生产方法 |
| 2.1.1 显微注射法 |
| 2.1.2 病毒载体法 |
| 2.1.3 精子载体法 |
| 2.1.4 胚胎干细胞介导法 |
| 2.1.5 体细胞核移植法 |
| 2.2 转基因家畜在农业生产上的应用 |
| 2.2.1 提高生产性能 |
| 2.2.2 提高产品质量 |
| 2.2.3 提高抗病力 |
| 2.3 转基因家畜在生物医学领域的应用 |
| 2.3.1 生产药用蛋白和生物制品 |
| 2.3.2 器官移植 |
| 2.3.3 人类疾病模型 |
| 2.4 展望 |
| 实验研究 |
| 第三章 山羊体细胞核移植体系的优化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂和主要仪器设备 |
| 3.1.3 供体细胞处理 |
| 3.1.4 卵母细胞体外成熟（IVM） |
| 3.1.5 核移植（nuclear transfer，NT） |
| 3.1.6 胚胎培养和胚胎移植 |
| 3.1.7 实验设计 |
| 3.1.8 数据分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 激活时间对山羊克隆胚胎核重塑和早期发育的影响 |
| 3.2.2 CB 处理对山羊克隆胚胎发育潜能的影响 |
| 3.2.3 胚胎培养液对山羊克隆胚胎早期发育的影响 |
| 3.2.4 胚胎移植时间对核移植效率的影响 |
| 3.2.5 移植胚胎数量对核移植效率的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 不同胎儿成纤维细胞系对转人溶菌酶基因克隆山羊生产效率的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂和主要仪器 |
| 4.1.3 山羊胎儿的采集 |
| 4.1.4 胎儿成纤维细胞的培养 |
| 4.1.5 不同胎儿成纤维细胞系的增殖能力检测 |
| 4.1.6 不同胎儿成纤维细胞系的染色体稳定性检测 |
| 4.1.7 不同胎儿成纤维细胞系的细胞周期和凋亡检测 |
| 4.1.8 转基因载体的准备 |
| 4.1.9 胎儿成纤维细胞的转染和筛选 |
| 4.1.10 核移植程序 |
| 4.1.11 转基因山羊的鉴定 |
| 4.1.12 实验设计 |
| 4.1.13 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 胎儿成纤维细胞的生长特性和形态 |
| 4.2.2 胎儿成纤维细胞的增殖能力和染色体稳定性 |
| 4.2.3 胎儿成纤维细胞处理后的细胞周期和细胞凋亡 |
| 4.2.4 不同胎儿成纤维细胞系的转染效率 |
| 4.2.5 不同转基因细胞系对核移植胚胎植入前发育的影响 |
| 4.2.6 不同转基因细胞株对核移植胚胎体内发育的影响 |
| 4.2.7 转基因羊PCR 和Southern 鉴定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转人β-防御素3 基因克隆山羊的生产 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器设备 |
| 5.1.3 载体 |
| 5.1.4 山羊胎儿成纤维细胞 |
| 5.1.5 转HBD3 基因山羊胎儿成纤维细胞的制备 |
| 5.1.6 转HBD3 基因单克隆细胞的PCR 鉴定 |
| 5.1.7 核移植 |
| 5.1.8 转基因羊的PCR 鉴定 |
| 5.1.9 转基因羊的southern 鉴定 |
| 5.1.10 反向PCR 鉴定整合位点侧翼序列 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 转HBD3 基因山羊胎儿成纤维细胞的筛选和鉴定 |
| 5.2.2 转HBD3 基因克隆羊的生产 |
| 5.2.3 转HBD3 基因克隆羊的鉴定 |
| 5.2.4 反向PCR 鉴定整合位点侧翼序列 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转人防御素-3 基因克隆山羊乳腺上皮细胞诱导表达和继代克隆 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 主要试剂和主要仪器 |
| 6.1.2 实验动物 |
| 6.1.3 转基因羊乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 6.1.4 乳腺上皮细胞的鉴定 |
| 6.1.5 转基因羊乳腺上皮细胞的诱导表达 |
| 6.1.6 利用Tricine SDS-PAGE 电泳和western blot 检测HBD-3 的表达 |
| 6.1.7 转基因羊乳腺上皮细胞的继代克隆 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 转基因羊乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 6.2.2 转基因羊乳腺上皮细胞的特异性染色 |
| 6.2.3 转基因羊乳腺上皮细胞的HBD3 诱导表达 |
| 6.2.4 转基因羊乳腺上皮细胞的继代克隆 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 全文结论 |
| 主要创新点和下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）转人β防御素3基因克隆牛的研制及检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 抗病转基因动物生产、鉴定及其应用 |
| 前言 |
| 1.1 转基因动物的应用 |
| 1.2 转基因克隆动物的生产方法 |
| 1.2.1 转基因动物生产与乳腺炎的发生 |
| 1.2.2 重组蛋白的选择 |
| 第二章 人β防御素3 及其抗病特性 |
| 2.1 防御素 |
| 2.2 人β-防御素的结构 |
| 2.3 β-防御素及其在疾病治疗中的作用 |
| 2.4 hBD-3 的表达和调控机制 |
| 2.4.1 抗微生物活性及其作用机理 |
| 2.4.2 人β-防御素3 的结构和功能的关系 |
| 2.5 人β-防御素3 的使用前景 |
| 第三章 抗病转基因动物生物安全评价 |
| 3.1 转基因动物安全评价 |
| 3.2 转基因生物技术和政策分析 |
| 3.3 转基因的设计策略 |
| 3.4 转基因的安全评价体系 |
| 3.5 转基因的安全评价的因素 |
| 3.5.1 转基因的受体动物 |
| 3.5.2 转基因的来源 |
| 3.5.3 转基因的载体构建和遗传修饰 |
| 3.5.4 转基因食品生产 |
| 3.5.5 转基因表达的生物评价 |
| 3.6 转基因检测 |
| 3.6.1 DNA 水平的检测 |
| 3.6.2 插入位点检测 |
| 3.6.3 拷贝数的检测 |
| 3.7 展望 |
| 试验研究 |
| 第四章 转人防御素3 基因的牛乳腺上皮细胞株的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 动物组织 |
| 4.1.2 载体与菌种 |
| 4.1.3 工具酶与其他试剂 |
| 4.1.4 主要实验仪器 |
| 4.1.5 phBD3 质粒鉴定 |
| 4.1.6 牛乳腺上皮细胞的分离培养 |
| 4.1.7 牛乳腺上皮细胞的生物学特征鉴定 |
| 4.1.8 质粒phBD3 转染牛乳腺上皮细胞 |
| 4.1.9 阳性细胞克隆的筛选与细胞株的获得 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组质粒 |
| 4.2.2 重组质粒phBD3 的PCR 扩增 |
| 4.2.3 SacI 和SalI 双酶切与ApaLI 单酶切鉴定结果 |
| 4.2.4 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞的原代培养及传代培养 |
| 4.2.5 奶牛乳腺上皮细胞特异性β-酪蛋白基因鉴定 |
| 4.2.6 奶牛乳腺上皮细胞表面标志的表达鉴定 |
| 4.2.7 牛乳腺上皮细胞核型分析 |
| 4.2.8 G418 对奶牛乳腺上皮细胞最小致死量测定 |
| 4.2.9 电穿孔介导的phBD3 乳腺上皮细胞的转染 |
| 4.2.10 稳定转染的阳性细胞克隆形成及细胞株筛选 |
| 4.2.11 阳性细胞株的鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转人防御素3 基因的牛乳腺上皮细胞阳性细胞株的诱导表达及其活性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 工具酶与其他试剂 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 奶牛乳腺上皮细胞阳性细胞株的诱导表达 |
| 5.2.2 阳性细胞株基因组DNA 限制性内切酶酶切和电泳 |
| 5.2.3 探针制备 |
| 5.2.4 DNA 转膜转移和固定 |
| 5.2.5 阳性细胞株的Southern 鉴定 |
| 5.2.6 奶牛乳腺上皮细胞培养上清液hBD3 蛋白的ELISA 定量检测 |
| 5.2.7 Tricine SDS-PAGE 电泳及western blot 检测 |
| 5.2.8 牛乳腺上皮细胞培养上清液hBD3 蛋白的抑菌活性检测 |
| 5.2.9 hBD3 蛋白对牛乳腺上皮细胞阳性细胞株生长和增殖的影响 |
| 5.2.10 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 阳性细胞株southern blot 杂交检测 |
| 5.3.2 阳性细胞株的诱导表达上清液hBD3 蛋白的抑菌活性分析 |
| 5.3.3 组胺对牛乳腺上皮阳性细胞株的hBD3 分泌的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 转hBD3 基因克隆牛的的研制 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要仪器 |
| 6.1.2 主要试剂及溶液 |
| 6.1.3 受体牛 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 卵母细胞的采集 |
| 6.2.2 卵母细胞的成熟培养 |
| 6.2.3 体外成熟卵母细胞的去核 |
| 6.2.4 转β-防御素3 基因奶牛成纤维细胞的阳性细胞准备 |
| 6.2.4.1 牛胎儿成纤维细胞的原代培养 |
| 6.2.4.2 成纤维细胞传代培养与冻存 |
| 6.2.4.3 成纤维细胞 β-防御素 3 基因电转染 |
| 6.2.4.4 转染β-防御素3 基因成纤维细胞筛选及鉴定 |
| 6.2.4.5 阳性成纤维细胞准备 |
| 6.2.5 核移植及转基因克隆胚获得 |
| 6.2.6 转基因克隆胚EGFP 荧光蛋白表达检测 |
| 6.2.7 转基因克隆胚的胚胎移植和早期妊娠B 超鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 卵母细胞收集与成熟培养 |
| 6.3.2 供体细胞与核移植 |
| 6.3.3 克隆胚的获得 |
| 6.3.4 转基因克隆胚的胚胎移植及妊娠B 超检测 |
| 6.3.5 转基因克隆牛的产生 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 转hBD3 基因克隆牛的检测 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 转基因牛血液基因组DNA 提取 |
| 7.1.4 转基因克隆牛hBD3 基因的多重PCR 鉴定 |
| 7.1.5 Southern blotting 分析外源基因整合 |
| 7.1.6 TaqMan Real-time PCR 拷贝数分析 |
| 7.1.7 荧光原位杂交（FISH）染色体定位检测 |
| 7.1.8 反向PCR 技术检测侧翼序列 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 组织基因组DNA 提取 |
| 7.2.2 转基因克隆牛多重PCR 检测 |
| 7.2.3 转基因克隆牛人防御素3 的基因组整合分析 |
| 7.2.4 Real-Time PCR 定量外源基因拷贝数 |
| 7.2.5 荧光原位杂交检测 |
| 7.2.6 反向PCR 侧翼序列检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）奶牛β-防御素TAP基因克隆及乳腺特异性表达载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 哺乳动物防御素 |
| 1.1 哺乳动物防御素分类分布与生理功能 |
| 1.1.1 哺乳动物防御素分类与分布 |
| 1.1.2 防御素的生理功能 |
| 1.2 β-防御素在乳腺组织中的表达与表达调控 |
| 1.2.1 健康乳腺组织中防御素固有表达 |
| 1.2.2 不同泌乳时期乳腺组织中防御素表达不同 |
| 1.2.3 乳腺感染状态下防御素的诱导表达 |
| 2 乳腺组织特异性表达载体研究进展 |
| 2.1 乳腺组织特异性表达载体调控元件 |
| 2.1.1 调控乳蛋白基因组织特异性表达的元件 |
| 2.1.2 调控乳蛋白基因位点独立性表达的元件 |
| 2.1.3 与乳蛋白mRNA剪切过程相关的调控元件 |
| 2.1.4 乳腺特异性表达载体的特点 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体的检验 |
| 2.2.1 乳腺上皮细胞表达分析法 |
| 2.2.2 乳腺直接注射分析法 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 奶牛BLG基因5′端调控序列克隆及其通用型乳腺特异性表达载体构建 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织 |
| 1.2 主要试剂与设备 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 奶牛血液基因组DNA提取 |
| 1.5 BLG 5′端调控序列克隆 |
| 1.5.1 BLG 5′端调控序列PCR扩增与纯化 |
| 1.5.2 BLG 5′片段插入T克隆载体 |
| 1.5.3 阳性克隆菌株筛选 |
| 1.6 BLG 5′调控序列指导的通用型乳腺特异性表达载体构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 BLG 5′端调控序列PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒鉴定 |
| 2.3 BLG 5′调控序列测序分析 |
| 2.4 通用型乳腺特异性表达载体鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 奶牛乳腺TAP基因CDNA克隆与乳腺特异性表达载体构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织 |
| 1.2 主要试剂与设备 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 1.4 乳腺组织总RNA提取 |
| 1.5 RT-PCR反应和cDNA扩增 |
| 1.6 TAP基因克隆与鉴定 |
| 1.7 TAP基因真核表达载体构建 |
| 1.8 TAP基因乳腺特异性表达载体构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 荷斯坦奶牛TAP基因RT-PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 2.3 TAP cDNA序列分析 |
| 2.4 TAP真核表达质粒pEGFP-C1-TAP鉴定 |
| 2.5 TAP乳腺特异性表达载体pBLG-EGFP-C1-TAP鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 TAP基因在乳腺组织和体外培养细胞中的瞬时表达 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验动物及组织 |
| 1.2 主要试剂与设备 |
| 1.3 TAP基因在COS7细胞中的表达 |
| 1.3.1 质粒pEGFP-C1-TAP和pEGFP-C1除去内毒素 |
| 1.3.2 脂质体法转染细胞 |
| 1.4 原代奶牛乳腺上皮细胞的培养 |
| 1.4.1 细胞培养液制备 |
| 1.4.2 乳汁分离乳腺上皮细胞培养法 |
| 1.4.3 组织块培养法培养 |
| 1.5 TAP在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中的表达 |
| 1.6 TAP基因在兔乳腺组织中表达 |
| 2 试验结果与分析 |
| 2.1 TAP基因在COS7细胞中的表达 |
| 2.2 奶牛乳腺上皮细胞体外培养 |
| 2.2.1 乳汁分离乳腺上皮培养法 |
| 2.2.2 组织块法培养乳腺细胞 |
| 2.3 TAP基因在乳腺细胞中表达 |
| 2.4 奶牛TAP基因在兔乳腺组织中表达 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（9）hBD3基因乳腺特异性表达载体的构建及转hBD3基因牛克隆胚的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.1 转基因动物研究进展 |
| 1.1.1 转基因动物概述 |
| 1.1.2 转基因技术 |
| 1.1.3 转基因动物研究实例 |
| 1.1.4 转基因动物的应用现状 |
| 1.1.5 转基因动物面临的问题 |
| 1.2 动物乳腺生物反应器研究进展 |
| 1.2.1 动物乳腺生物反应器概述 |
| 1.2.2 乳腺生物反应器研究现状 |
| 1.2.3 目的基因的表达 |
| 1.2.4 乳腺生物反应器存在问题与展望 |
| 1.3 人β防御素 3 研究进展 |
| 1.3.1 防御素的概述 |
| 1.3.2 hBD3 的分子生物学特征 |
| 1.3.3 hBD3 的生物学功能 |
| 1.3.4 重组hBD3 的研究进展 |
| 第二章 人β防御素 3 基因的克隆和序列分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 人基因组提取结果 |
| 2.2.2 hBD3 基因PCR 扩增结果 |
| 2.2.3 XbaI 酶切鉴定结果 |
| 2.2.4 序列分析结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 人β防御素 3 基因乳腺特异性表达载体 pEBB 的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 pBCP 的NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果 |
| 3.2.2 pTAhBD3 的XbaI 酶切结果 |
| 3.2.3 重组质粒pBBD XabI 和BamHI 的酶切结果 |
| 3.2.4 重组质粒pEBB SacI 和SalI 双酶切结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 人β防御素 3 基因转染奶牛乳腺上皮细胞及在其中的表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 质粒pEBB 的纯化 |
| 4.2.2 牛乳腺上皮细胞的原代和传代培养 |
| 4.2.3 抗性筛选结果 |
| 4.2.4 细胞转染和筛选 |
| 4.2.5 hBD3 mRAN 在牛乳腺上皮细胞中的检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 人β防御素 3 基因转染牛胎儿成纤维细胞及转基因克隆胚制备 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 质粒pEBB 的纯化 |
| 5.2.2 胎牛成纤维细胞的原代和传代培养 |
| 5.2.3 抗性筛选结果 |
| 5.2.4 细胞转染及筛选 |
| 5.2.5 阳性细胞PCR 鉴定 |
| 5.2.6 转基因克隆胚的获得 |
| 5.2.7 转基因克隆胚PCR 鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 HBD-3 的研究进展 |
| 1.1 HBD-3 的结构 |
| 1.2. HBD-3 基因的表达调控 |
| 1.3 HBD-3 的抗菌作用机理 |
| 1.4. HBD-3 的生物学功能 |
| 1.4.1 抗菌作用 |
| 1.4.2 抑制真菌、病毒作用 |
| 1.4.3 HBD-3 的免疫学活性 |
| 1.5 HBD-3 的基因工程研究 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 转基因动物应用的现状及前景 |
| 2.1 转基因动物的应用 |
| 2.1.1 转基因动物在医学上的应用 |
| 2.1.2 转基因动物在农业上的应用 |
| 2.1.3 转基因动物及抗病性 |
| 2.2 转基因动物制作方法 |
| 2.2.1 显微注射法 |
| 2.2.2 逆转录病毒感染法 |
| 2.2.3 精子载体法 |
| 2.2.4 胚胎干细胞介导法 |
| 2.2.5 人工酵母染色体法 |
| 2.2.6 体细胞核移植法 |
| 2.3 结语 |
| 实验部分 |
| 第三章 HBD-3 基因的克隆及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 总RNA 的完整性 |
| 3.2.2 HBD-3 的PCR 扩增及重组质粒酶切鉴定 |
| 3.2.3 HBD-3 基因序列测定结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 乳腺特异性表达载体PEBCD 的的构建 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.3 初级乳腺载体构建 |
| 4.1.3.1 引物设计 |
| 4.1.3.2 PCR 扩增 |
| 4.1.3.3 hd 的亚克隆和酶切鉴定 |
| 4.1.3.4 初级乳腺载体pBCD 构建 |
| 4.1.4 乳腺特异性表达载体pEBCD 的构建 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 β-酪蛋白5’调控序列的PCR 扩增及亚克隆酶切鉴定 |
| 4.2.2 β-酪蛋白3’调控序列的PCR 扩增及亚克隆酶切鉴定 |
| 4.2.3 改建重组质粒pBCP 的酶切鉴定 |
| 4.2.4 重组质粒pMhD 的酶切鉴定 |
| 4.2.5 初级乳腺载体pBCD 的酶切鉴定 |
| 4.2.6 乳腺特异性表达载体pEBCD 的酶切鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 乳腺特异性表达载体的真核转染及检测分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 转染胎儿成纤维上皮细胞和乳腺上皮细胞的G418 抗性筛选 |
| 5.2.2 转染效率的检测 |
| 5.2.3 阳性细胞PCR 鉴定及RT-PCR 鉴定 |
| 5.2.4 诱导产物的Western blotting 检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 试验仪器 |
| 附录2 试验试剂及配制方法 |
| 缩略语 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析（论文参考文献）
- [1]浙江朱鹮种群β防御素基因表达谱及DNA甲基化研究[D]. 黄韵怡. 浙江大学, 2020(08)
- [2]奶牛溶菌酶基因（Lyz）和气管抗菌肽基因（TAP）表达质粒的构建、抗菌效果及安全性评价[D]. 张志鹏. 扬州大学, 2019
- [3]草鱼β-防御素克隆表达及转录调控的研究[D]. 许群. 南昌大学, 2018(12)
- [4]基于防御素的巨胞饮介导重组融合蛋白以及双靶向单链抗体重组融合蛋白的制备和抗肿瘤活性研究[D]. 杜玥. 北京协和医学院, 2016(01)
- [5]牦牛β-防御素5基因的原核表达及乳腺特异性表达载体的构建[D]. 符梅. 西南民族大学, 2013(07)
- [6]转人溶菌酶和人β-防御素3基因克隆山羊的生产[D]. 刘军. 西北农林科技大学, 2011(05)
- [7]转人β防御素3基因克隆牛的研制及检测[D]. 马会明. 西北农林科技大学, 2010(07)
- [8]奶牛β-防御素TAP基因克隆及乳腺特异性表达载体构建[D]. 栾红雨. 四川农业大学, 2010(04)
- [9]hBD3基因乳腺特异性表达载体的构建及转hBD3基因牛克隆胚的制备[D]. 马晶晶. 西北农林科技大学, 2009(S2)
- [10]HBD-3基因乳腺特异性载体的构建及真核表达[D]. 彭巍. 西北农林科技大学, 2009(S2)