一、输精管结扎诱发生精细胞凋亡的研究进展（论文文献综述）
闵潇[1]（2020）在《益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究》文中提出研究目的:1.研究症状性迟发性性腺功能减退症（symptomatic late onset hypogonadism,sLOH）患者的中医体质证候。2.研究人体慢性间歇性缺氧与sLOH之间的相关性。3.构建及评判慢性间歇性缺氧诱发迟发性性腺功能减退症（late onsethypogonadism,LOH）动物模型。4.传承名老中医经验,研究以补肾活血为主要治则的“益精方”对慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠治疗效果;从睾丸间质细胞（Leydig）凋亡、睾丸病理组织学改变及Leydig细胞超微结构改变探讨其作用机制。研究方法:第一部分:采用横断面研究的方法,以自填问卷的形式,收集在中国中医科学院广安门医院男科就诊的伴有鼾眠表现的sLOH患者的病例资料。采用Epworth嗜睡量表、STOP-bang问卷测评嗜睡状态,采用精简版AMS（cAMS）筛查量表测评LOH症状,中医体质分类与判定表测评中医体质,测定静脉血男性激素和乳酸。运用Pearson相关性分析,对血乳酸、性激素与sLOH症状、嗜睡状态进行相关性分析。第二部分:运用Attendor动物气体控制系统（Pro版）,模拟慢性间歇性低氧模式,对50只40周龄的退役SD种鼠进行每日4小时,连续30天的低氧干预,设为模型组;设10只40周龄的退役SD种鼠为对照组;设10只8周龄的SD大鼠为正常组。在造模第15天、30天时,随机选取模型组中的10只大鼠,与对照组、正常组大鼠,采血,进行血清总睾酮（TT）、游离睾酮（FT）和乳酸检测。在造模第30天时,随机选取模型组中10只大鼠与对照组、正常组大鼠,进行大鼠悬尾实验和大鼠强迫游泳实验;结合血清TT、FT和乳酸水平评估造模效果。第三部分:选取造模成功的32只LOH模型大鼠,随机分成4组:模型组,益精方高、中、低剂量组,每组8只大鼠。继续运用Attendor动物气体控制系统（Pro版）对大鼠进行慢性间歇性低氧的干预,为期4周,同时灌胃4周。模型组大鼠按体重灌胃蒸馏水。低剂量组予以0.324g/mL的益精方水煎剂;中剂量组予以0.75g/mL的益精方水煎剂;高剂量组予以1.5g/mL的益精方水煎剂。4周结束后,采血,ELISA法测血清TT、FT;比色分析法测血乳酸值;将大鼠断颈处死,计算大鼠睾丸指数;细胞流式术检测睾丸Leydig细胞凋亡率;Western印迹检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测睾丸组织Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达水平;分别以光学显微镜和透射电子显微镜观察睾丸病理组织学改变与超微结构的变化。研究结果:第一部分:sLOH患者排名前三的中医体质证候为气虚、痰湿、血瘀。41例sLOH患者完成了男性激素和乳酸检测,其中20例乳酸水平正常,21例乳酸水平高于正常,异常乳酸值范围为2.15-3.18（2.60±0.29）mmol/L,sLOH患者血乳酸异常比例约为51%。其中乳酸水平正常者气虚为主,乳酸水平增高者痰湿为主,但无论乳酸水平正常与否,血瘀均是sLOH患者比较突出的体质证候。Pearson相关性分析显示:Epworth评分与STOP-bang评分之间呈正向的强相关,r=0.681;cAMS评分与Epworth评分之间呈正向的弱相关,r=0.394;cAMS评分与STOP-bang评分之间呈正向的弱相关,r=0.311。Epworth评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.317;Epworth评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向中等强度相关,r=0.531;Epworth评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.460;STOP-bang评分与cAMS性功能症状分呈正向弱相关,r=0.357;STOP-bang评分与cAMS自主神经紊乱症状分呈正向弱相关,r=0.266;STOP-bang评分与cAMS心理和躯体症状分呈正向中等强度相关,r=0.434。乳酸正常sLOH组与乳酸升高sLOH组两组间,在年龄、Epworth嗜睡量表评分、STOP-bang问卷评分、cAMS评分、男性激素各项指标及TSI指数上的差异无统计学意义（P>0.05）;缺氧高中低风险3组,年龄在缺氧中风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异（P<0.05）,血雄烯二酮在缺氧高风险组和缺氧低风险组之间存在统计学差异（P<0.05）,其余指标在各组之间的差异无统计学意义（P>0.05）。第二部分:与正常组和对照组相比,模型组大鼠造模第15天、第30天时2次检测的血清TT、FT水平均显着下降（P<0.05）,差异具有统计学意义。与正常组和对照组相比,模型组大鼠2次检测的血乳酸水平均显着增高（P<0.05）,差异具有统计学意义。造模第30天时悬尾实验:与正常组大鼠相比,对照组和模型组6min内不动时间均明显延长（P<0.05）,具有统计学意义;模型组与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。游泳实验:与正常组和对照组相比,模型组大鼠游泳至力竭的时间均明显缩短（P<0.05）,差异具有统计学意义。依据LOH动物模型判定办法,以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率为68%,造模途中死亡率为32%。第三部分:血TT、FT水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血TT、FT水平均显着增高（P<0.05）,呈剂量依赖性。血乳酸水平:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组大鼠血乳酸水平均显着下降（P<0.05）,呈剂量依赖性。睾丸Leydig细胞凋亡率:与模型组相比,益精方中、高剂量组大鼠Leydig细胞凋亡率均显着下降（P<0.01）,具有显着统计学意义;益精方低剂量组与模型组相比,P>0.05,无明显统计学意义。Caspase-3蛋白表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组均显着下调（P<0.01）,低剂量组VS中剂量组,中剂量组VS高剂量组,P均>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.01。Bcl-2蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2蛋白表达水平显着上调（P<0.05）,差异具有统计学意义;低、中剂量组VS模型组,P均>0.05,低剂量组VS高剂量组,P<0.05。Bax蛋白表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax蛋白表达水平均显着下调（P<0.01）,差异具有显着统计学意义。低剂量组VS模型组,P>0.05;低剂量组VS高剂量组,P<0.05;中剂量组VS高剂量组,P>0.05。Caspase-3的mRNA表达水平方面:与模型组相比,低、中、高剂量组Caspase-3的mRNA表达水平均显着下调（P<0.05）,差异具有统计学意义;低剂量组VS高剂量组（P<0.01）,其余剂量组之间P均>0.05。Bcl-2的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方高剂量组Bcl-2的mRNA表达水平显着上调（P<0.05）,差异具有统计学意义;中、低剂量组VS模型组（P>0.05）;低剂量组VS高剂量组（P<0.05）。Bax的mRNA表达水平方面:与模型组相比,益精方中、高剂量组Bax的mRNA表达水平均显着下调（P<0.01）,差异具有显着统计学意义;低剂量组VS高剂量组（P<0.05）,其余剂量组之间P均>0.05。光学显微镜下睾丸Leydig细胞数量:与模型组相比,益精方低、中、高剂量组均有升高,但低、中、高剂量组组间差异不大。发生凋亡改变的Leydig细胞数量,益精方低、中、高剂量组均少于模型组。益精方低、中、高剂量组Leydig细胞形态优于模型组,其中高、中剂量组Leydig细胞形态趋近正常。透射电子显微镜下,4组大鼠的睾丸Leydig细胞超微结构在脂滴形成上有所差异。研究结论:1.在伴有鼾眠表现的sLOH患者中存在血乳酸异常升高;sLOH患者缺氧的风险越高,其LOH症状越重;缺氧对sLOH患者自主神经紊乱症状、心理和躯体症状的影响较明显,对男性激素的影响相对不明显。提示慢性间歇性缺氧可能是LOH的重要潜在危险因素。sLOH患者的中医体质证候以气虚、痰湿、血瘀为主,其中乳酸水平正常者倾向于气虚,乳酸水平增高者倾向于痰湿。提示肾气虚夹痰湿、血瘀可能是sLOH较为关键的中医病因病机。2.增龄与慢性间歇性缺氧,都是大鼠血TT、FT水平下降的危险因素;增龄加上缺氧,较单一的增龄因素,对大鼠血TT、FT水平的影响更为显着。以慢性间歇性缺氧为干预手段进行LOH动物模型构建,造模成功率较高,造模方法切实可行。3.益精方能明显提高慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠血TT、FT水平,降低血乳酸水平,降低睾丸Leydig细胞的凋亡率。其可能的作用机制在于:1)下调LOH模型大鼠睾丸组织中的Caspase-3、Bax的基因和蛋白表达,上调Bcl-2的基因和蛋白表达,调控了睾丸Leydig细胞的凋亡;2)改善LOH模型大鼠氧代谢,减轻乳酸蓄积,恢复雄激素合成睾丸内调节的正常环境,促进睾丸Leydig细胞分泌功能。
杨旭[2]（2020）在《T-2毒素对小鼠睾丸的炎性损伤作用及ROS/NLRP3炎性小体活化的调控机制》文中指出T-2毒素可损伤雄性生殖功能,降低雄性小鼠生育力,但机制尚不明确。睾丸炎性损伤是导致雄性生殖功能障碍的核心机制,ROS介导的NLRP3炎性小体活化在炎性反应中发挥关键调节作用,但T-2毒素是否通过ROS介导的NLRP3炎性小体活化,诱导睾丸炎性损伤,导致雄性生殖功能障碍尚不清楚。本研究以睾丸炎性损伤、ROS和NLRP3炎性小体活化三者之间的关系为理论基础,以“T-2毒素导致睾丸炎性损伤并受ROS/NLRP3炎性小体活化的调控”为理论假说和研究切入点,拟展开以下三个方面研究。（1）首先选取80只雄性昆明小鼠,随机等分成四组,分别灌胃给与0（对照组,CG）、0.5（低剂量组,LG）、1（中剂量组,MG）和2 mg/kg B.W.（高剂量组,HG）的T-2毒素,试验周期为28 d,建立亚急性T-2毒素中毒小鼠模型。通过检测雄性小鼠生育力、睾丸结构（显微结构、超微结构、细胞凋亡和血睾屏障）和睾丸功能（精子发生和睾酮合成）、睾丸炎性反应、睾丸中ROS含量和NLRP3炎性小体关键因子的表达,探究T-2毒素对睾丸损伤、睾丸炎性反应和ROS/NLRP3炎性小体活化的影响;（2）而后以TM4细胞（小鼠支持细胞系）为受试对象,测定T-2毒素对TM4细胞的半数抑制浓度(IC50),依此确定后续细胞毒性实验中T-2毒素的适宜剂量;分别以终浓度为0、2(1/4 IC50)、4(1/2 IC50)或6 nM(3/4 IC50)的T-2毒素处理TM4细胞,建立T-2毒素中毒细胞模型,检测TM4细胞的活性和凋亡率、细胞功能标志性因子（Ocln、ZO-1、Cx-43和N-cad）的表达、炎性反应、ROS含量和NLRP3炎性小体关键因子的表达,分析确定T-2毒素与TM4细胞炎性损伤和ROS/NLRP3炎性小体活化的剂量-效应关系,并筛选出后续干预实验的T-2毒素剂量;（3）最后依据TM4细胞活性试验,分别筛选出ROS清除剂（NAC）和NLRP3炎性小体活化抑制剂（MCC950）的适宜干预剂量;使用5 mM的NAC和20 nM的MCC950分别联合T-2毒素（4 nM）干预TM4细胞,验证ROS/NLRP3炎性小体活化在T-2毒素致TM4细胞炎性损伤中的作用。综合分析体内、外试验结果,筛选出T-2毒素致雄性生殖障碍的靶点。实验结果如下:（1）T-2毒素处理雄性小鼠试验结果:1)雄性小鼠生育力:各毒素处理组小鼠体重显着低于CG（P<0.05;P<0.01）;与CG相比,HG小鼠的交配指数和繁育指数显着降低（P<0.05）;与MG和HG小鼠交配的雌鼠胚胎着床数、活胎数极显着低于CG（P<0.01）,而发生胎儿溶解的雌鼠数量显着增加（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素中毒抑制小鼠生长,破坏雄性小鼠生育力。2)睾丸结构:HG小鼠睾丸重量和体积极显着低于CG（P<0.01）;T-2毒素处理小鼠睾丸的显微结构和超微结构均受损;TUNEL染色显示,T-2毒素暴露导致睾丸组织中生精细胞、间质细胞和支持细胞均发生细胞凋亡;MG和HG睾丸组织中血睾屏障相关蛋白（Ocln、Cx-43、N-Cad和ZO-1）的基因和蛋白表达显着低于CG（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素破坏血睾屏障损伤,引起睾丸结构损伤。3)睾丸功能:MG和HG睾丸每日精子生成量和附睾尾精子密度显着低于CG（P<0.05,P<0.01）,精子畸形率显着高于CG（P<0.05,P<0.01）,精子超微结构破坏,表明T-2毒素导致精子发生障碍;各毒素处理组血清中睾酮含量显着低于CG（P<0.05;P<0.01）,MG和HG睾丸中睾酮合成酶（St AR、P450scc、P450c17、3β-HSD和17β-HSD）的表达显着低于CG（P<0.05,P<0.01）,表明T-2毒素导致小鼠睾酮合成障碍。4)睾丸炎性反应:各毒素处理组血清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α含量显着高于CG,IL-10含量显着低于CG（P<0.05;P<0.01）;各毒素处理组睾丸中IL-6和TNF-α的含量和m RNA表达显着高于CG,IL-10的含量和m RNA表达显着低于CG（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素导致睾丸炎性反应。5)NLRP3炎性小体活化:MG和HG睾丸中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β、IL-18基因和蛋白表达及IL-1β、IL-18含量显着高于CG（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素活化睾丸中NLRP3炎性小体。6)ROS蓄积:MG和HG小鼠睾丸组织中ROS和MDA含量极显着高于CG（P<0.01）,而CAT和SOD活性极显着低于CG（P<0.01）,表明T-2毒素导致睾丸中ROS蓄积和氧化应激。（2）T-2毒素处理TM4细胞试验结果如下:1)T-2毒素对TM4细胞的IC50为8.10 nM。2)4 nM和6 nM组TM4细胞活性、细胞标志性因子（Ocln、ZO-1、Cx-43和N-cad）表达显着低于0 nM组（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素破坏TM4细胞功能。3)T-2毒素处理组TM4细胞的凋亡率极显着高于0 nM组（P<0.01）,表明T-2毒素诱导TM4细胞凋亡。4)4 nM和6 nM组TM4细胞培养上清中IL-6和TNF-α含量显着高于0 nM组,IL-10含量极显着低于0 nM组（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素诱导TM4细胞发生炎性反应。5)4 nM和6 nM组TM4细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达,培养上清中IL-1β和IL-18含量均显着高于0 nM组（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素活化TM4细胞中NLRP3炎性小体。6)各毒素处理组TM4细胞中ROS和MDA含量显着高于0 nM组,SOD和CAT活性显着低于0 nM组（P<0.05;P<0.01）,表明T-2毒素导致TM4细胞ROS蓄积和氧化应激。（3）NAC和MCC950分别联合T-2毒素处理TM4细胞试验结果:1)5 mM NAC或20 nM MCC950可显着缓解T-2毒素导致的TM4细胞活性降低、细胞标志性因子（Ocln、ZO-1、Cx-43和N-cad）m RNA表达的抑制和细胞凋亡（P<0.05;P<0.01）。2)5 mM NAC或20 nM MCC950可显着缓解T-2毒素导致的培养上清中IL-6和TNF-α含量升高、IL-10含量降低（P<0.05;P<0.01）,表明干预ROS或NLRP3炎性小体活化可缓解T-2毒素导致TM4细胞炎性反应。3)5 mM NAC或20 nM MCC950可显着缓解T-2毒素导致的TM4细胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达升高、培养上清中IL-1β和IL-18含量升高（P<0.05;P<0.01）,表明干预ROS或NLRP3炎性小体活化均可缓解T-2毒素导致的NLRP3炎性小体活化。4)5 mM NAC可显着缓解T-2毒素导致的ROS蓄积,但20 nM MCC950不能缓解ROS蓄积,表明ROS介导了NLRP3炎性小体活化。综上所述,T-2毒素可导致睾丸和TM4炎性损伤,并受ROS介导的NLRP3炎性小体活化的调节;睾丸炎性损伤表现为睾丸结构（显微结构、超微结构、血睾屏障损伤及细胞凋亡）损伤及功能（精子发生和睾酮合成）障碍;TM4炎性损伤表现为细胞活性下降、细胞凋亡和功能标志性因子表达降低。
刘倩[3]（2019）在《输精管梗阻致小鼠精子miRNAs和tsRNAs表达的变化及其机制初探》文中研究指明第一部分输精管梗阻性无精子症小鼠模型的构建和精子RNA提取方法的优化【目的】构建理想的输精管梗阻性无精子症小鼠模型,优化精子RNA的提取方法,解决本研究的模型和关键技术问题,为后续实验奠定基础。【方法】（1）6周龄的正常雄性C57BL/6小鼠随机分为实验组（双侧输精管梗阻）和对照组（假手术）。实验组小鼠麻醉后,于双侧输精管近端行缝线结扎,于结扎点远端离断输精管,且近端的断端行烧烙闭合。对照组小鼠处理同上,但不行输精管结扎、离断及烧烙。（2）分别于术后4周、8周、12周,分离小鼠的睾丸和附睾,观察并称量睾丸和附睾的重量,行HE染色以观察组织形态。（3）分离各组小鼠附睾尾部精子,分析精子总量、前向运动率,行伊红染色检测精子存活率、Diff-Quik染色法检测精子畸形率。（4）两组雄鼠与雌鼠合笼,次日对阴栓阳性的雌鼠采用生理盐水冲洗法行阴道涂片,镜检判断是否有精子。阴栓阳性雌鼠于交配后21天解剖,判断妊娠情况。（5）分别用Triziol和DTT裂解液裂解精子,涂片后镜检,评估裂解效果。（6）单用体细胞裂解液（Somatic Cell Lysis Buffer,SCLB）和细胞筛联合SCLB预处理精子,提取总RNA用于逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,扩增c-Kit、CD4和Cadherin,分别判断生精细胞、白细胞和上皮细胞的污染。（7）分别采用Trizol和Trizol LS抽提DTT裂解液中的精子RNA,测量并比较两种方式提取的RNA纯度和总量。（8）构建包含以下关键技术的精子RNA提取体系:细胞筛联合SCLB预处理精子、DTT裂解液裂解精子、Trizol LS抽提DTT裂解液中的RNA。用Agilent 2100分析采用上述方法提取的精子RNA的长度分布和完整性,包括绘制模拟琼脂糖凝胶电泳图和长度分布峰图,并计算RIN值。【结果】（1）对6周龄雄性C57BL/6小鼠行双侧输精管近端结扎8周,可构建符合临床特征的梗阻性无精子症小鼠模型。表现为:射出的精液中未检出精子;不育,交配后雌鼠妊娠率为0（p<0.001）;附睾明显肥大肿胀,重量增加（附睾重量/体重为0.39%vs 0.31%,p<0.001）;附睾内精子淤滞,附睾尾部精子的浓度（11.50 vs 8.17×107,p<0.001）和畸形率显着增加（17.50%vs 65.00%,p<0.001）,存活率（16.67%vs 60.83%,p<0.001）和活力（18.83%vs 65.00%,p<0.001）显着降低;睾丸大小、硬度、光滑度及重量（0.67 vs 0.66 g,p>0.05）均无明显差异;生精小管结构无明显异常。（2）Trizol裂解精子后,镜检见大量完整的精子;而DTT裂解液能完全裂解精子,镜检未见残留精子或精子碎片。（3）对于单用SCLB预处理的精子,琼脂糖凝胶电泳示c-Kit、CD4阴性,而Cadherin阳性,提示存在附睾上皮细胞的污染。细胞筛联合SCLB预处理精子后,c-Kit、CD4和Cadherin均阴性。（4）DTT裂解精子后,用Trizol LS抽提的精子RNA总量平均1.41±0.06mg/107精子,显着高于Trizol（0.59±0.04mg/107精子,p<0.001）,约为后者RNA提取量的2.5倍。（5）采用本研究的方法提取的精子RNA,表现为以分子量低于100 nt的小RNA为主要种类;无明显28S、18S r RNA条带;不完整性（RIN<7）:符合精子RNA特征。【结论】（1）对6周龄雄性C57BL/6小鼠行双侧输精管近端结扎8周,可构建符合临床特征的梗阻性无精子症小鼠模型。（2）本研究建立了高效可靠的精子总RNA提取体系,关键技术包括DTT裂解液裂解精子、细胞筛联合SCLB去除体细胞污染、Trizol LS抽提DTT裂解液中的RNA。采用该方法提取的精子RNA纯度高,总量大且符合精子RNA特征。第二部分输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子mi RNA和ts RNA表达谱的变化【目的】研究输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子mi RNAs和ts RNAs表达谱的变化。【方法】（1）利用二代测序技术检测并比较了假手术组（Shame Operation,SO）和输精管梗阻性无精子症组（Obstructive Azoospermia,OA）的小鼠附睾尾部精子mi RNAs和ts RNAs的表达水平。（2）选取部分差异表达的小RNAs,同时在同批样品及同类型样品中采用q PCR验证测序结果。【结果】（1）c DNA文库对应的原始序列长度为14-40 nt,为小RNAs的长度范围,92%以上的碱基的正确准确率高达99.9%。（2）生理情况下,精子中超过50%的小RNAs为ts RNAs,但在OA小鼠中,这一比例有下降趋势。无论在SO还是OA小鼠,t RF-5s均为附睾尾部精子中最主要的ts RNA类型,占比超过了50%。（3）与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾部精子共288个mi RNAs呈现差异表达,其中上调的mi RNAs为108个,下调的mi RNAs为180个。下调的mi RNAs集中于3个mi RNA簇——mi R-1792、Sfmbt2 mi RNA、spermi R。（4）与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾部精子共91个ts RNAs呈现差异表达,其中包括了多种可能影响早期胚胎发育和子代健康的ts RNAs。GO富集分析也表明这些差异表达的ts RNAs分子参与了多种生物学过程的调控。（5）q PCR验证结果中绝大部分选取的小RNAs的差异表达与测序的差异表达趋势一致,仅极少数mi RNAs与测序的差异表达趋势相反。【结论】输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子中多种mi RNAs和ts RNAs表达水平发生了变化第三部分输精管梗阻性无精子症小鼠附睾尾部精子小RNAs异常表达的机制初探【目的】分析附睾尾部组织、附睾小体及精子中ts RNAs和mi RNAs的差异表达的相关性。分析与附睾小体共孵育后,精子ts RNAs和mi RNAs的水平变化。分析OA小鼠的附睾组织中t RNA修饰相关酶、ts RNA合成酶及mi RNA合成酶表达水平的变化,从而初步探索OA小鼠附睾尾部精子中ts RNAs和mi RNAs异常表达的机制。【方法】（1）BSA连续密度梯度单位重力沉降法分离睾丸中不同阶段生精细胞后,采用q RT-PCR检测并比较不同阶段生精细胞中指标ts RNAs和mi RNAs分子的表达水平,以分析指标分子在不同阶段生精细胞中表达的动态趋势。比较SO组和OA组小鼠同阶段生精细胞中指标ts RNAs和mi RNAs的表达水平,以明确差异表达产生的阶段。（2）差速离心法分离附睾尾部的附睾小体后,q RT-PCR检测并比较SO组和OA组小鼠的附睾尾部组织、附睾小体中指标ts RNAs和mi RNAs分子的表达水平,与精子中的差异表达作比较,并分析相关性。（3）差速离心法分离附睾头部和尾部的附睾小体,q RT-PCR分别检测附睾小体和对应部位精子中指标ts RNAs和mi RNAs的表达水平,并分析相关性。（4）将附睾头部精子与附睾尾部附睾小体进行体外共孵育,并分析孵育后精子ts RNAs和mi RNAs的水平变化。（5）采用q RT-PCR和Western Blot同时从转录和蛋白水平分析了小鼠附睾组织中多种t RNA修饰酶的表达,包括t RNA甲基化转移酶DNMT2、NSUN2、FTSJ1,t RNA甲硫基转移酶CADKAL1,t RNA次黄嘌呤修饰酶ADAT2,t RNA去甲基化酶ALK和t RNA假尿苷修饰酶PUS1,以及ts RNA合成酶Angiogenin以及mi RNA合成酶Drosha、Dicer的转录水平。【结果】（1）与SO小鼠相比,OA小鼠睾生精细胞中t RF-Val-CAC-012、t RF-Gly-GCC-016、t RF-Ser-AGA-006、mi R-149-3p、mi R-370-3p、mi R-34b-3p的表达水平均无显着差异（全部p>0.05）。而mi R-16-5p在睾丸中表现为显着上调（p<0.05）,与附睾尾部精子的差异表达趋势相反（p<0.05）。而t RF-Gly-GCC-016、t RF-Ser-AGA-006和mi R-149-3p在OA小鼠的附睾头部和尾部精子均显着上调(全部p<0.05,mi R-34b-3p均显着下调（两者p<0.01）。t RF-t RF-Val-CAC-012在附睾头部精子中无显着差异（p>0.05）,在附睾尾部精子中显着下调（p<0.05）。mi R-370-3p在附睾头部精子中无显着差异（p>0.05）,在附睾尾部精子中显着上调（p<0.01）。（2）与SO小鼠相比,OA小鼠附睾尾组织和附睾小体中mi R-34b-3p和t RF-Val-CAC-012显着下调（所有p<0.01）,而mi R-149-3p（p<0.01）和t RF-Gly-GCC-016（p<0.05）显着上调,与附睾尾部精子的差异表达趋势一致。（3）相关分析表明,附睾尾部组织与附睾小体中小RNAs的差异表达高度正相关（r=0.84,p<0.001）。同时附睾尾部小体与精子中小RNAs差异表达高度正相关（r=0.83,p<0.001）。（4）无论在SO还是OA小鼠中,附睾小体的t RF-Gly-GCC-016、t RF-Val-CAC-012、mi R-34b-3p、mi R-149-3p表达水平与精子中的表达水平高度正相关（SO组依次r=0.60,p<0.05;r=0.84,p<0.05;r=0.81,p<0.01;r=0.73,p<0.01;OA组依次r=0.60,p<0.05;r=0.67,p<0.05;r=0.61,p<0.05;r=0.83,p<0.01）。（5）分别与SO组和OA组的附睾小体共孵育后,精子中mi R-149-3p和t RF-Gly-GCC-016的表达水平呈现与附睾小体一致的差异表达（p<0.01）。（6）与SO小鼠相比,OA小鼠的附睾组织中Dnmt2、Cdkal1、Ftsj1转录水平降低,Nsun2转录水平增加,ts RNA合成酶Angiogenin和mi RNA合成酶Dicer的转录水平均无显着差异,但Drosha转录水平上调。Western Blot结果表明,CADKAL1和NSUN2蛋白的表达变化与m RNA一致。【结论】OA可导致小鼠附睾组织中多种mi RNAs和ts RNAs表达水平的变化,并通过附睾小体传递到精子,最终导致精子中多种mi RNAs和ts RNAs异常表达。而OA小鼠附睾组织中多种小RNAs的异常表达,可能与其附睾组织中t RNA修饰酶NSUN2和CADKAL以及mi RNA合成酶Drosha的异常表达相关。
李俊君[4]（2019）在《强精片对SD大鼠血睾屏障损伤的修复机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究以氧化应激损伤所致的血睾屏障（blood-testis barrier,BTB）入手,以环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）制作损伤BTB的模型SD大鼠,通过前期已证实具有抗氧化作用的补肾活血中药“强精片”对模型动物进行干预,以BTB相关蛋白闭锁小带-1（zonula occludens-1,ZO-1）、闭合蛋白（occludin）、纤维状肌动蛋白（fibros actin,F-actin）,氧化应激指标超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）以及p38 MAPK中关键蛋白p38蛋白为切入点,探讨补肾活血中药对受损BTB的作用靶点和修复机制,阐明不育症的中医发病机理,为中医药防治不育症奠定基础。方法:选取健康雄性SD大鼠50只,随机分为生理盐水腹腔注射空白对照组20只与CTX腹腔注射模型组30只。造模完成后,上述两组随机抽取10只大鼠取材检测,进行模型验证。将模型组余下的20只大鼠随机分成2组:强精片治疗组及模型对照组,每组10只。强精片治疗组给予中药等效剂量0.45g/kg·d（相当于临床人5.25g生药/60kg·d的6倍）灌胃,模型对照组以及模型验证后剩余的10只空白对照组给予等剂量生理盐水灌胃,两组灌胃每天1次,连续4周。实验结束后,采用计算机辅助精液分析检测大鼠精液指标变化。光镜下观察比较睾丸组织形态学。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测睾丸组织SOD、MDA水平。免疫组织化学S-P法染色检测紧密连接蛋白Occludin及Zo-1的表达。睾丸组织免疫荧光染色检测细胞骨架蛋白F-actin的表达。通过免疫印迹法（Western blot）检测睾丸组织Occludin、F-actin及p38蛋白的表达。结果:1.光镜下病理组织结构:造模后,大鼠睾丸曲细精管管壁可见生精细胞不同程度减少,管壁凹陷甚至塌陷,管壁变薄,管周基底膜增厚,管腔内精子不同程度减少;强精片治疗后大鼠睾丸曲细精管管壁生精细胞不同程度增多,管壁凹陷程度不同程度减轻,管壁厚薄较均匀,管腔内精子不同程度增多。2.模型对照组SOD明显低于正常对照组（P<0.05）,MDA含量显着高于正常对照组（P<0.05）;强精片组SOD明显高于模型对照组（P<0.05）,MDA含量显着低于模型对照组（P<0.05）。3.造模后,Occludin、Zo-1免疫组化阳性染色明显减少,经4周自然恢复后,阳性染色略有增加的趋势;强精片组阳性染色较模型对照组明显增加。4.造模后,F-actin阳性荧光强度明显降低,经4周自然恢复后,阳性荧光强度有较明显的增加;强精片组阳性荧光强度较模型对照组强。5.造模后,Occludin、F-actin蛋白表达量明显下降（均P<0.05）,p38蛋白表达量明显增加（P<0.05）;经4周自然恢复后,Occludin、F-actin蛋白表达量均有所增加,p38蛋白表达量有所下降,但差异无统计学意义,强精片组Occludin、F-actin蛋白表达量较模型对照组明显增加（均P<0.05）,p38蛋白表达量较模型对照组明显下降（P<0.05）。结论:1.环磷酰胺可增加睾丸组织MDA水平,降低SOD水平,上调p38蛋白表达水平,下调Occludin、Zo-1、F-actin蛋白表达水平,减少精子数量,表明环磷酰胺可能通过增加睾丸氧化应激水平,激活p38MAPK通路,减少BTB相关蛋白表达,损伤BTB。2.强精片可降低睾丸组织MDA水平,升高SOD水平,下调p38蛋白表达水平,上调Occludin、Zo-1、F-actin蛋白表达水平,增加精子数量,表明强精片可能通过降低睾丸氧化应激水平,抑制p38MAPK通路,恢复BTB相关蛋白表达功能,修复受损的BTB,改善精液质量。
唐亮[5]（2018）在《CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究》文中认为目的目前,不孕不育症是影响人类健康的一种常见的疾病,约15%的育龄人员有不孕不育疾病的问题,在这里约百分之五十是因为男性原因,在医学中被称之为男性不育。然而,在临床就诊的男性不育症患者中,无精子症患者的治疗最为棘手。根据患者有无输精管梗阻的表现,临床上将无精症分为梗阻性无精症（obstructive azoospermia,OA）和非梗阻性无精症（non-obstructive azoospermia,NOA）两种,其中NOA患者睾丸生精功能严重障碍,多次精液常规检查报告提示镜下见极少量精子或没有精子。NOA患者的睾丸组织病理表型有睾丸生精小管结构紊乱、生精细胞成熟阻滞、生精细胞减数分裂停滞、睾丸生精功能低下等。尽管辅助生殖技术已经帮助很多不育夫妇成功受孕,然而很多NOA患者仍然无法生育自己遗传学上的后代。近年来,关于引起NOA相关的基因突变或多态性现象逐渐成为男性不育症研究的的热点。因此,针对NOA患者精子发生过程中的相关分子生物学机制的深入研究,不仅有助于逐步了解NOA的发病原因,对于男性不育症靶控治疗的发展和辅助生殖技术均有着非常重要的理论指导及应用价值。CD82是近些年在肿瘤领域研究较多的转移抑制基因之一,它属于四穿膜超家族（Transmernbrance 4 superfamily,TM4SF）的成员,其结构为细胞膜糖蛋白,主要生物学功能是对细胞间及细胞与细胞外基质的信号传导产生影响,同时参与调节细胞的增殖与分化。其参与的生物学途径有细胞周期调控、细胞骨架结构改变、蛋白激酶磷酸化调节、细胞凋亡调控、细胞粘附/迁移等。研究发现,在NOA患者睾丸的组织中CD82呈高表达。目前,关于CD82的过表达是否会引起精原细胞分化、增殖过程发生异常进而引起精子生成障碍,国内外前尚无相关的研究及文章报道。本实验首先检测部分梗阻性以及非梗阻性无精子症患者睾丸组织中CD82蛋白的表达情况,比较分析了二组标本之间存在的差异表达,通过向小鼠睾丸组织显微注射CD82转染的腺相关病毒,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,分析验证了CD82高表达对小鼠生精细胞分化增殖产生的影响,并采用高通量转录组测序的方法对CD82可能引起生精障碍的分子生物学途径进行探讨,为进一步寻找CD82在生精细胞分化过程中相关的分子机制提供理论基础。方法1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织中生精细胞不同的形态学表现,免疫组化观察CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中的表达情况。2.采用Western blot进行定量检测CD82在梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织中差异表达。3.包装表达CD82的腺相关病毒（AVV）,显微注射法感染小鼠睾丸组织,构建CD82高表达小鼠睾丸组织模型,免疫荧光观察AVV感染效率。4.HE染色观察CD82高表达对小鼠睾丸组织精子发生的影响。5.转录组测序检测CD82高表达小鼠睾丸实验组和对照组之间的差异表达基因。6.随机挑选6个差异表达基因,Q-RTPCR验证高通量转录组测序结果的可靠性。结果1.HE染色观察无精子症患者睾丸组织存在不同形态学改变,其中5例患者生精功能正常,表现为曲细精管密度正常,管腔基底部各级生精细胞存在,管腔内可见成熟精子形成,符合梗阻性无精子症患者病理改变;8例患者生精功能障碍,表现为曲细精管稀疏,管腔基地部各级生精细胞数量减少,厚度变薄,管腔内极少有成熟精子形成,符合非梗阻性无精子症睾丸病理改变。2.免疫组化结果显示,梗阻性和非梗阻性无精子症患者睾丸组织内间质细胞和支持细胞均可见CD82阳性表达,非梗阻性无精子症患CD82表达更为显着,采用Western blot法进行定量检测,结果显示在二组睾丸标本中CD82蛋白的表达差异具有统计学意义（P值<0.05）。3.CD82成功插入腺相关病毒AVV载体,显微注射法成功感染小鼠睾丸组织,1周后免疫荧光显示小鼠睾丸组织外源性CD82表达明显,CD82高表达小鼠睾丸组织模型构建满意。4.C57小鼠（8周龄）睾丸组织的HE染色结果显示,对照组小鼠睾丸组织的生精功能正常,各级生精细胞生长活跃,曲细精管内可见到部分成熟精子,实验组小鼠睾丸组织呈现生精功能异常,各级生精细胞数量减少,管壁变薄,无成熟精子或仅极少量长形精子形成。5.转录组测序结果显示,与对照组相比,CD82高表达组差异表达基因数590个,其中上调基因289个,下调基因301个,主要参与的生物过程包括有细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,其中细胞周期调控、转录调节相关基因所占比例较大。6.随机挑选的6个差异基因,各选三份组织样本进行Q-RTPCR验证,分析结果提示基因表达变化水平与高通量转录组测序结果趋势一致,转录组测序结果可靠。结论:1.在OA和NOA患者睾丸组织中,CD82检测结果均呈阳性表达,NOA患者睾丸组中CD82表达更为显着,定量检测法（Western blot）检测两组标本组织的CD82蛋白差异表达有统计学意义2.在高表达CD82小鼠睾丸组织中,曲细精管基底室生殖细胞结构尚清晰,近腔室内生殖细胞减少,极少量精子形成,生殖细胞分化停滞在精原细胞及初级精母细胞早期,预示CD82过表达可能会引起精原细胞分化、有丝分裂-增殖过程发生异常。3.高通量转录组测序显示高表达CD82时差异基因所参与的生物学过程和信号通路涉及细胞周期调控、转录因子调节、细胞凋亡调节、信号传导通路、免疫应答反应、细胞粘附转运、蛋白磷酸化等方面,细胞周期调控和转录调节可能是CD82在精子发生障碍过程中的重要调控环节。
朱楚超[6]（2016）在《DDR2在睾丸中表达的功能及调控机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:盘状结构域受体2（Disoind domain receptor 2,DDR2）持续表达于正常人类及小鼠睾丸间质细胞中,且DDR2slie/slie小鼠呈现生精障碍表型,但其发病机制及DDR2在睾丸精子发生中的作用及调节机制并不清楚。研究目的:揭示DDR2sile/slie小鼠生精障碍的机制,明确DDR2表达在精子发生中的功能及调节机制。实验方法:通过构建多种生精障碍的小鼠动物模型,结合临床不育病人睾丸标本病理切片,检测DDR2在不同生精障碍中的表达,探索其在精子发生中的功能。研究结果:在本研究中我们发现:睾丸间质细胞DDR2表达可以消耗I型胶原并调节睾丸间质胞外基质中I型胶原含量从而调节间质细胞睾酮合成;DDR2缺失会导致I型胶原异常累积抑制睾酮合成并导致精子发生障碍。唯支持细胞综合征患者生精小管内支持细胞雄激素受体表达水平下降会引起睾丸支持细胞异常表达DDR2,异常表达的DDR2会促进支持细胞胞吞作用并代偿性修复受损的血睾屏障。另外,非梗阻性无精症及隐睾患者睾丸凋亡的生精细胞胞核表达DDR2;异常表达的DDR2是由生精障碍睾丸中异常升高的肿瘤坏死因子α（TNF-α）活化核因子κB（NF-κB）进而转录调控DDR2诱导引起的;这种异常升高的DDR2可以通过抑制FasL的表达进而抑制生精细胞凋亡。结论:我们的研究证实DDR2通过与多种因子相互作用及调节多个信号通路,在维持雄性睾丸的正常精子发生及修复不育睾丸的生精障碍中发挥着重要作用。
王随心,张玉华,李向阳,葛少钦[7]（2011）在《生精细胞凋亡相关基因》文中进行了进一步梳理细胞凋亡（apoptosis）是一种基因控制的细胞生理性自杀行为,用以维持细胞数量的相对恒定,可由某种刺激或抑制剂的移除而激活。在哺乳动物精子发生过程中,各级生精细胞都会发生相应的凋亡,通过严格调控以确保成熟精子生成的数量和质量。生精细胞的凋亡是一个许多基因参与的复杂的不可逆过程,其中Bcl-2/Bax基因族、p53基因、Fas-Fasl基因、C-myc基因、CREM基因、HSP基因族、c-Kit/SCF基因、Insl3基因、iNOS基因、BMP8B基因、TR基因和存活蛋白（survivin）基因等发挥了重要作用。研究哺乳动物睾丸生精细胞凋亡相关基因,有利于了解生精细胞凋亡机制,为进一步阐明精子发生的调控机制,预防和治疗精子发生相关疾病提供重要的理论依据。
陈宗林[8]（2009）在《络合铜纳米高分子复合材料输精管内节育装置节育效果的实验研究》文中研究指明第一部分IVD节育术的雄犬实验研究目的以成年雄性Beagle犬为实验动物,检测各组犬术前术后精子密度、活率、а-糖苷酶、铜离子和锌离子含量;观察犬睾丸、附睾和输精管组织细胞的形态学变化（光镜和电镜）,判断此IVD的节育有效性、安全性和可复性,为下一步动物和临床实验提供依据。材料和方法按照随机、对照的实验原则,选取20只雄性Beagle犬,随机编入假手术组、输精管结扎组、IVD组和复通组,每组5只。采用手刺激法取犬精液4～8ml,将精液行计算机辅助分析（CASA）计算精子密度和各级精子活率。各组分别行假手术、IVD植入术和输精管结扎术,并于术后第1、3、6、12个月取精液检测。-20℃冷藏精浆用于а-糖苷酶、铜离子和锌离子含量的检测。术后第12月时取假手术组、输精管结扎组和IVD组犬睾丸、附睾和输精管组织,HE染色光镜下观察,制作超薄切片电镜下观察;TUNEL法（Termainal deoxy-nucleotidyl Transfetase Mediated Nick End Labeling,TdT介导的dUTP缺口末端标记术）检测睾丸、附睾和输精管细胞凋亡情况。术后12月手术取出复通组各犬输精管内IVD,并于术后第1月,手法刺激取其精液,检测精液中的上述各项指标。结果术前各组犬精液CASA检查各项指标正常。手术过程顺利。术后无感染等并发症发生。术后第1月取精CASA检查发现IVD组和输精管结扎组犬精液中精子密度均为零,即二组Beagle犬都处于无精子状态,节育有效性在IVD组和输精管结扎组相同,均达到100%。假手术组各犬精液CASA检查各项指标值与术前无明显差异。复通组IVD取出手术过程顺利,术后第1月精液CASA检查发现精子密度与各级精子活率与术前复通组统计学上无显着性差异。精浆中а-糖苷酶含量测定在IVD组、复通组和假手术组术前术后无显着性差异;而输精管结扎组术前术后有显着性差异;各组犬精浆铜离子和锌离子浓度术前术后统计学分析无显着性差异。睾丸、附睾和输精管组织标本行光镜和电镜下观察表明假手术组、IVD组各犬三者损伤程度均较输精管结扎组轻微。前二组睾丸组织生精上皮各级细胞正常,附睾管及管腔无明显的扩张,输精管扩张程度较轻或无扩张。而结扎组则睾丸组织曲细精管上皮细胞排列紊乱,细胞量减少,间质较疏松;附睾管及输精管腔扩张明显。同时睾丸、附睾和输精管细胞凋亡实验也表明假手术组、IVD组的睾丸、附睾和输精管细胞凋亡数量显着性少于输精管结扎组。结论实验表明络合铜纳米高分子复合材料IVD与输精管结扎术在术后一年之内达到了同样的节育效果,两者都为100%。此IVD具有良好的组织相容性、安全性,不会对放置局部和全身组织器官造成不良影响。复通手术再通结果表明取出IVD后较容易达到输精管再通,IVD取出术简单易行,容易操作,术后无并发症。第二部分IVD节育术的雄兔实验研究目的以新西兰大耳白兔（ New Zealand Big Eared White Rabbit）为实验模型动物,通过各组对大耳白兔术前取精、雌雄配种后雌兔怀孕率实验结果及术后各组兔睾丸、附睾和输精管组织细胞标本切片的光镜检查和凋亡实验来判断此IVD的节育有效性、安全性和可复性,为下一步动物和临床实验提供理论依据。材料和方法雄性新西兰大耳白兔40只,随机编入假手术组、输精管结扎组、IVD组和复通组,每组10只。术前通过假阴道法取精,精液镜下观察。同时选取雌性新西兰大耳白兔40只,随机分为四组,即假手术组、输精管结扎组、IVD组和复通组,以备与相应四组雄兔行配种实验。各组雄兔分别行假手术、IVD植入术和输精管结扎术。术后分别与四组雌性新西兰大耳白兔交配,观察各组雌性新西兰大耳白兔怀孕及分娩情况。术后十二月时复通组行IVD取出手术,与10只雌性新西兰大耳白兔再次进行交配实验,观察雌兔怀孕分娩情况以判断其复通成功率。术后第12月时,手术取假手术组、输精管结扎组和IVD组兔睾丸、附睾和输精管组织,切片HE染色光镜下观察组织细胞形态学变化;TUNEL法检测各组兔睾丸、附睾和输精管细胞凋亡情况。结果术前通过假阴道法取精,精液镜下观察发现各兔精液都有精子,密度及活率正常。各组兔行假手术、IVD植入术及输精管结扎术的手术过程顺利。术后行配种实验后,IVD组、复通组和输精管结扎组怀孕率均为0。假手术组雌兔怀孕率达80%。复通组行IVD取出手术过程顺利,术后无血肿及感染等并发症。复通术后雌雄兔交配,雌兔怀孕率达60%。各兔睾丸、附睾和输精管组织切片光镜下观察发现假手术组、IVD组组织细胞损伤轻微或正常,附睾管及输精管管腔扩张不明显;而输精管结扎组则损伤较为严重,附睾管及输精管管腔扩张明显,纤毛脱落或消失。凋亡实验表明假手术组、IVD组睾丸、附睾和输精管上皮细胞无明显凋亡;而输精管结扎组可见大量细胞凋亡。结论络合铜纳米高分子复合材料IVD的新西兰大耳白兔实验表明络合铜纳米高分子材料IVD具有良好的节育效果,术后一年之内的节育效果与输精管结扎术相同,都达到100%。IVD植入术手术过程简单易掌握。术中出血较少,附睾郁积肿胀程度较输精管结扎术明显减轻。从术后各兔睾丸、附睾和输精管组织切片的光镜观察及凋亡实验结果表明此IVD具有良好的安全性,不会对放置部位局部和邻近生殖器官造成不良影响。复通时IVD取出过程顺利,术后复通成功率高,有着良好的可复性。
梁鑫[9]（2007）在《睾丸生精细胞凋亡的影响因素》文中认为关于生精细胞的凋亡受很多因素的影响,与激素、药物、环境以及动物本身的发育阶段等因素有关。本文对影响睾丸生精细胞凋亡的因素作一综述。
李红蕾[10]（2007）在《氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用》文中认为本研究通过对雄性小鼠腹腔注射氟化钠及醋酸锌建立氟中毒动物模型和治疗模型，采用石蜡切片、H-E染色、TUNEL末端原位标记及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠睾丸生精细胞的凋亡情况。旨在研究氟对成年小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用，从而对基础理论研究及开发低毒鼠药以控制鼠害提供实验依据，并对经常接触氟的人群的生殖保健起到一定的参考指导作用。实验结果如下：小鼠腹腔注射氟化钠(20mgkg1-)后，睾丸生精细胞的显微结构出现了典型的细胞凋亡的形态特点。TUNEL法显示，小鼠睾丸中凋亡细胞呈阳性反应，非凋亡细胞呈阴性反应。无论是对照组还是氟感染组和锌保护组，睾丸中凋亡的生精细胞多发生在精母细胞和精原细胞，而且是精母细胞凋亡最多；很少发生在精子细胞和精子。从细胞凋亡率可见，染氟组睾丸生精细胞细胞凋亡率显着高于对照组；染氟组的生精细胞凋亡率在腹腔注射第28天达到最大（11.972％），以后逐渐回落。低剂量锌组(15mgkg-1)和高剂量锌组(30mgkg1-)的生精细胞凋亡率显着低于染氟组，并且高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显着（P＞0.05）。琼脂糖凝胶电泳检测显示，对照组及锌保护组细胞DNA条带呈单一条带。染氟组凋亡细胞的DNA呈现特征性的“阶梯状”条带。可见，氟化钠可以在体内诱导小鼠睾丸生精细胞凋亡；锌可以对这种凋亡起到保护作用。
二、输精管结扎诱发生精细胞凋亡的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、输精管结扎诱发生精细胞凋亡的研究进展（论文提纲范文）
（1）益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一 迟发性性腺功能减退症诊断、危险因素和动物模型研究述评 |
| 1.LOH诊断上的困惑 |
| 1.1 LOH精准诊断相对困难 |
| 1.2 LOH症状与睾酮水平低下不能完全对等 |
| 1.3 LOH诊断方法难以统一 |
| 1.4 LOH样症状如何定义有待商榷 |
| 1.5 LOH相关新概念的提出 |
| 1.6 小结 |
| 2.LOH动物模型构建概况 |
| 2.1 将老龄雄性大鼠(14-24月龄)视为LOH动物模型 |
| 2.2 环磷酰胺诱导生殖系统受损构建LOH动物模型 |
| 2.3 对退役种鼠进行“孤养+复合情志刺激”构建LOH动物模型 |
| 2.4 将去势小鼠视作LOH动物模型 |
| 2.5 小结 |
| 3.LOH危险因素研究概况 |
| 3.1 LOH常见的危险因素 |
| 3.2 肥胖与LOH |
| 3.3 LOH散在报道的危险因素 |
| 3.4 缺氧可能是LOH 一个尚未得到重视的潜在危险因素 |
| 3.5 小结 |
| 4.缺氧代谢产物乳酸与睾丸生殖机能 |
| 5.结语 |
| 6.参考文献 |
| 综述二 中医药对男性生殖内分泌的认识与诊疗进展 |
| 1.男性生殖内分泌的基础生理病理概况 |
| 1.1 下丘脑-垂体-睾丸轴是男性生殖内分泌的核心 |
| 1.2 HPT轴功能可受到多种危险因素的影响 |
| 2.以“天癸”为核心的中医男性生殖内分泌理论的构建 |
| 2.1 天癸是一种与人体生殖机能密切相关且客观存在的物质 |
| 2.2 天癸的本质和中西医结合研究 |
| 2.3 以天癸为核心或信使的中医“肾-天癸-精室”男性性腺轴的构建 |
| 2.4 小结 |
| 3.中医药在男性生殖内分泌疾病上的运用 |
| 3.1 常见的男性生殖内分泌疾病 |
| 3.2 中医药在动物实验研究方面对HPT轴的调控作用 |
| 3.3 中医药在临床研究方面对HPT轴的调控作用 |
| 3.4 小结 |
| 4.结语 |
| 5.参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 临床研究 症状性迟发性性腺功能减退症(sLOH)中医体质证候调查以及与慢性间歇性缺氧相关性研究 |
| 1.资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 基本资料 |
| 2.2 sLOH患者“中医体质证候”基本调研概况 |
| 2.3 男性激素及静脉血乳酸值异常情况 |
| 2.4 cAMS评分与Epworth评分、STOP-bang评分的相关性分析 |
| 2.5 Epworth评分、STOP-bang评分与cAMS性功能症状、自主神经紊乱症状、心理和躯体症状评分之间的相关性分析 |
| 2.6 乳酸正常sLOH组与乳酸升高sLOH组各指标的比较 |
| 2.7 缺氧高中低风险3组间各指标的比较 |
| 2.8 cAMS评分轻度和中度2组间各指标的比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 sLOH患者中医体质证候 |
| 3.2 sLOH与缺氧 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 研究一 慢性间歇性缺氧诱导的LOH动物模型构建探究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 主要设备与试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 造模第15天时,3组大鼠血TT、FT、乳酸检测对比 |
| 2.2 造模第30天时,3组大鼠血TT、FT、乳酸检测对比 |
| 2.3 造模第30天时,3组大鼠悬尾实验、游泳实验检测对比 |
| 2.4 模型判定与造模成功情况 |
| 3.讨论 |
| 3.1 增龄、缺氧与血TT、FT水平 |
| 3.2 缺氧对模型大鼠体能和情志的影响 |
| 3.3 乳酸的结果讨论 |
| 3.4 LOH动物模型讨论 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 研究二 补肾活血益精方对慢性间歇性缺氧诱导的LOH模型大鼠睾丸Leydig细胞凋亡的影响 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 各组大鼠睾丸指数的对比 |
| 2.2 各组大鼠血TT、FT水平的比较 |
| 2.3 各组大鼠血乳酸水平的比较 |
| 2.4 各组大鼠睾丸Leydig细胞凋亡率的情况对比 |
| 2.5 各组大鼠睾丸组织内Caspase-3、Bcl-2及Bax的蛋白表达情况 |
| 2.6 各组大鼠睾丸组织内Caspase-3、Bcl-2及Bax的基因表达情况 |
| 2.7 各组大鼠睾丸病理组织学情况比较 |
| 2.8 各组大鼠睾丸Leydig细胞超微结构的情况比较 |
| 3.讨论 |
| 3.1 Leydig细胞数量、功能与雄激素的关系 |
| 3.2 睾丸Leydig细胞的凋亡调控 |
| 3.3 益精方的组方分析及前期研究基础 |
| 3.4 益精方对LOH模型大鼠的可能作用机制一:调控睾丸Leydig细胞的凋亡 |
| 3.5 益精方对LOH模型大鼠的可能作用机制二:恢复雄激素合成睾丸内调节的正常环境,促进睾丸Leydig细胞分泌功能 |
| 4.小结 |
| 5.参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）T-2毒素对小鼠睾丸的炎性损伤作用及ROS/NLRP3炎性小体活化的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 T-2毒素概述 |
| 1.2 T-2毒素的限量标准 |
| 1.3 T-2毒素的污染现状 |
| 1.4 T-2毒素的危害 |
| 1.5 T-2毒素的雄性生殖毒性 |
| 1.6 T-2毒素的睾丸毒性作用 |
| 1.6.1 T-2毒素对睾丸结构的影响 |
| 1.6.2 T-2毒素对血睾屏障的影响 |
| 1.6.3 T-2毒素对睾丸功能的影响 |
| 1.7 睾丸炎性损伤 |
| 1.7.1 睾丸炎性损伤与睾丸结构 |
| 1.7.2 睾丸炎性损伤与精子生成 |
| 1.7.3 睾丸炎性损伤与睾酮合成 |
| 1.8 NLRP3炎性小体活化与睾丸炎性损伤 |
| 1.9 ROS与NLRP3炎性小体活化 |
| 1.10 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验动物与TM4细胞系 |
| 2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 主要材料与试剂 |
| 2.4 主要试剂的配置 |
| 2.5 动物试验总体设计 |
| 2.5.1 动物试验技术路线图 |
| 2.5.2 试验动物分组与处理 |
| 2.5.3 小鼠临床症状观察 |
| 2.5.4 雄性小鼠生育力检测 |
| 2.5.5 睾丸组织的形态学观测 |
| 2.5.6 睾丸组织细胞凋亡观测 |
| 2.5.7 血睾屏障相关蛋白检测 |
| 2.5.8 精子发生检测 |
| 2.5.9 睾酮合成检测 |
| 2.5.10 睾丸炎性反应检测 |
| 2.5.11 睾丸组织氧化与抗氧化状态检测 |
| 2.5.12 睾丸组织NLRP3炎性小体检测 |
| 2.6 细胞试验总体设计 |
| 2.6.1 TM4细胞试验技术路线图 |
| 2.6.2 TM4细胞的培养 |
| 2.6.3 T-2毒素对TM4细胞半数抑制浓度的测定 |
| 2.6.4 NAC干预剂量的筛选 |
| 2.6.5 MCC950干预剂量的筛选 |
| 2.6.6 TM4细胞的分组和处理 |
| 2.6.7 TM4细胞活性的检测 |
| 2.6.8 TM4细胞中ZO-1、Ocln、N-cad和Cx-43表达的检测 |
| 2.6.9 TM4细胞凋亡率的检测 |
| 2.6.10 TM4细胞炎性反应检测 |
| 2.6.11 TM4细胞中氧化与抗氧化状态的检测 |
| 2.6.12 TM4 细胞NLRP3炎性小体的检测 |
| 2.7 数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鼠试验结果 |
| 3.1.1 T-2毒素对小鼠精神状态的影响 |
| 3.1.2 T-2毒素对小鼠体重和饮食量的影响 |
| 3.1.3 T-2毒素对雄性小鼠生育力的影响 |
| 3.1.4 T-2毒素对睾丸重量和体积的影响 |
| 3.1.5 T-2毒素对睾丸显微结构的影响 |
| 3.1.6 T-2毒素对睾丸超微结构的影响 |
| 3.1.7 T-2毒素对睾丸组织细胞凋亡的影响 |
| 3.1.8 T-2毒素对血睾屏障的影响 |
| 3.1.9 T-2毒素对精子发生的影响 |
| 3.1.10 T-2毒素对睾酮合成的影响 |
| 3.1.11 T-2毒素对睾丸炎性反应的影响 |
| 3.1.12 T-2毒素对睾丸中ROS和氧化应激的影响 |
| 3.1.13 T-2毒素对睾丸中NLRP3炎性小体的影响 |
| 3.2 TM4细胞T-2毒素中毒的试验结果 |
| 3.2.1 T-2毒素对TM4细胞的IC50 |
| 3.2.2 T-2毒素对TM4细胞活性的影响 |
| 3.2.3 T-2毒素对TM4细胞功能的影响 |
| 3.2.4 T-2毒素对TM4细胞凋亡的影响 |
| 3.2.5 T-2毒素对TM4细胞炎性反应的影响 |
| 3.2.6 T-2毒素对TM4细胞中ROS和氧化应激的影响 |
| 3.2.7 T-2毒素对TM4细胞NLRP3炎性小体活化的影响 |
| 3.3 MCC950对T-2毒素暴露TM4 细胞毒性的影响 |
| 3.3.1 MCC950干预剂量的确定 |
| 3.3.2 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞活性的影响 |
| 3.3.3 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞功能的影响 |
| 3.3.4 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞凋亡的影响 |
| 3.3.5 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞炎性反应的影响 |
| 3.3.6 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞中ROS含量的影响 |
| 3.3.7 MCC950对T-2毒素暴露TM4细胞NLRP3 炎性小体的影响 |
| 3.4 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞毒性的影响 |
| 3.4.1 NAC干预剂量的确定 |
| 3.4.2 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞活性的影响 |
| 3.4.3 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞功能的影响 |
| 3.4.4 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞凋亡的影响 |
| 3.4.5 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞炎性反应的影响 |
| 3.4.6 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞中ROS含量的影响 |
| 3.4.7 NAC对T-2毒素暴露TM4细胞NLRP3炎性小体的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 试验处理条件的确定 |
| 4.1.1 雄性小鼠T-2毒素处理条件的确定 |
| 4.1.2 TM4细胞T-2毒素处理条件的确定 |
| 4.1.3 MCC950和NAC干预试验条件的确定 |
| 4.2 T-2毒素对雄性小鼠的毒性作用 |
| 4.3 T-2毒素中毒对雄性小鼠生育力的影响 |
| 4.4 T-2毒素对睾丸损伤的影响 |
| 4.4.1 T-2毒素对睾丸结构的影响 |
| 4.4.2 T-2毒素对BTB的影响 |
| 4.4.3 T-2毒素对小鼠精子发生的影响 |
| 4.4.4 T-2毒素对小鼠睾酮合成的影响 |
| 4.5T-2毒素对睾丸炎性反应的影响 |
| 4.5.1 NLRP3炎性小体对T-2毒素诱导的睾丸炎性反应的调节作用 |
| 4.5.2 ROS对T-2毒素导致NLRP3 炎性小体活化的介导作用 |
| 4.5.3 T-2毒素导致睾丸组织和TM4细胞中氧化损伤 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）输精管梗阻致小鼠精子miRNAs和tsRNAs表达的变化及其机制初探（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 输精管梗阻性无精子症小鼠模型的构建和精子RNA提取方法的优化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验小结 |
| 第二部分 输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子miRNA和 ts RNA表达谱的变化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验小结 |
| 第三部分 输精管梗阻性无精子症小鼠的附睾尾部精子小RNAs异常表达的机制初探 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 实验小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附件1 攻读学位期间发表论文目录 |
| 附件2 英文缩略词一览表 |
（4）强精片对SD大鼠血睾屏障损伤的修复机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 材料和方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 药品 |
| 1.2 阴性对照品 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 实验动物 |
| 1.6 动物饲养环境 |
| 2.方法 |
| 2.1 环磷酰胺模型组建立 |
| 2.2 空白对照组建立 |
| 2.3 动物分组 |
| 2.4 给药剂量与疗程 |
| 2.5 检测指标 |
| 2.5.1 大鼠一般状态观察 |
| 2.5.2 计算机辅助精液分析（CASA） |
| 2.5.3 ELISA 检测睾丸组织 SOD、MDA 含量 |
| 2.5.4 睾丸病理组织学观察 |
| 2.5.5 免疫组织化学 S-P 法染色检测紧密连接蛋白 Occludin 及 Zo-1 的表达 |
| 2.5.6 免疫荧光染色检测睾丸组织细胞骨架蛋白 F-actin 的表达 |
| 2.5.7 Western blot 法检测 Occludin、F-actin 及 p38 的表达变化 |
| 2.6 统计分析 |
| 第二部分 结果 |
| 1.大鼠一般状态观察 |
| 2.实验动物体重分析 |
| 3.睾丸湿重 |
| 4.计算机辅助精液分析(CASA) |
| 5.大鼠睾丸组织SOD、MDA含量变化情况 |
| 6.病理组织学检查 |
| 7.免疫组化测定Occludin及 Zo-1 的表达情况 |
| 8.免疫荧光染色测定F-actin的表达情况 |
| 9.Western blot法测定Occludin、F-actin及 p38 的表达情况 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.男性不育概况及病因 |
| 2.中医药治疗少弱畸形精子症研究进展 |
| 3.BTB结构及功能 |
| 4.氧化应激、p38MAPK与 BTB损伤 |
| 5.BTB损伤的中医认识 |
| 6.强精片治疗的男性不育的研究进展 |
| 第四部分 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（5）CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表(Abbreviation) |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料与试剂 |
| 3.研究方法 |
| 4.结果 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 7.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）DDR2在睾丸中表达的功能及调控机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 DDR2在睾丸间质细胞中的功能及作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 唯支持细胞综合征睾丸支持细胞DDR2表达的作用及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 隐睾睾丸生精细胞中DDR2表达的功能及机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）生精细胞凋亡相关基因（论文提纲范文）
| 1. Bcl-2/Bax基因族 |
| 2. p53基因 |
| 3. Fas-Fasl基因 |
| 4. C-myc基因 |
| 5. CREM基因 |
| 6. HSP基因族 |
| 7. c-Kit/SCF基因 |
| 8. Insl3基因 |
| 9. i NOS基因 |
| 1 0. BMP8B基因 |
| 1 1. TR基因 |
| 1 2. 存活蛋白基因 |
| 1 3. 结语 |
（8）络合铜纳米高分子复合材料输精管内节育装置节育效果的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分：IVD 节育术的雄犬实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分：IVD 节育术的雄兔实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 细胞凋亡 |
| 1.1 细胞凋亡的来源与意义 |
| 1.2 细胞凋亡的主要特征 |
| 1.3 细胞凋亡的主要机制 |
| 1.4 细胞凋亡的检测方法 |
| 1.5 细胞凋亡的生理与病理学意义 |
| 1.6 细胞凋亡的研究发展趋势 |
| 第二章 氟中毒与生精细胞凋亡 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 氟中毒细胞凋亡的可能机制 |
| 2.3 睾丸生精细胞凋亡的影响因素 |
| 第三章 锌对细胞凋亡的保护作用 |
| 3.1 锌对细胞凋亡调控的可能机制及途径 |
| 3.2 锌对睾丸生精细胞凋亡的保护作用 |
| 第二部分 氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用 |
| 前言 |
| 实验流程 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 第二章 结果与分析 |
| 2.1 H-E染色结果 |
| 2.2 原位末端标记(TUNEL)检测结果 |
| 2.3 凋亡细胞计数及统计分析 |
| 琼脂糖凝胶电泳检测结果 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
四、输精管结扎诱发生精细胞凋亡的研究进展（论文参考文献）
- [1]益精方调控慢性缺氧诱导的睾丸Leydig细胞凋亡治疗LOH的机制研究[D]. 闵潇. 中国中医科学院, 2020(01)
- [2]T-2毒素对小鼠睾丸的炎性损伤作用及ROS/NLRP3炎性小体活化的调控机制[D]. 杨旭. 东北农业大学, 2020
- [3]输精管梗阻致小鼠精子miRNAs和tsRNAs表达的变化及其机制初探[D]. 刘倩. 华中科技大学, 2019
- [4]强精片对SD大鼠血睾屏障损伤的修复机制研究[D]. 李俊君. 成都中医药大学, 2019
- [5]CD82在非梗阻性无精症精子发生障碍中的机制研究[D]. 唐亮. 安徽医科大学, 2018(04)
- [6]DDR2在睾丸中表达的功能及调控机制研究[D]. 朱楚超. 第四军医大学, 2016(02)
- [7]生精细胞凋亡相关基因[J]. 王随心,张玉华,李向阳,葛少钦. 生命的化学, 2011(03)
- [8]络合铜纳米高分子复合材料输精管内节育装置节育效果的实验研究[D]. 陈宗林. 华中科技大学, 2009(02)
- [9]睾丸生精细胞凋亡的影响因素[J]. 梁鑫. 畜禽业, 2007(11)
- [10]氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用[D]. 李红蕾. 广西大学, 2007(05)