一、BIV在人源细胞MT-4中的活性研究（论文文献综述）
刘越[1]（2021）在《基于CRISPR全基因组筛选探究家蚕对污染因子氟/镉的响应机制》文中研究指明随着工业化和城镇化的快速发展,生态环境持续恶化,多种污染因子通过食物链不断积累,对生态系统中的生物造成危害。作为数量最多的动物群体,昆虫在生态系统中扮演了重要的角色,环境的严重恶化可能引起昆虫快速变异和物种灭绝,给生态系统和人类的生产生活造成不可逆转的危害。因此,研究环境污染物对昆虫的影响及其毒理学机制具有重要的理论价值和实际意义。家蚕作为重要的鳞翅目模式生物,其全基因组信息完善,遗传背景清晰。近年来研究人员在家蚕中已经先后创建了转基因过表达、RNA干扰（RNA interference,RNAi）、基因组编辑等多个遗传操作平台。此外,家蚕经过几千年的人工驯化,在定向选择过程中,其抗药、抗病等抗逆性能逐渐退化,对外界不利因素反应敏感。因此,家蚕非常适合用于环境污染因子的毒理机制研究。同时家蚕作为一种重要的经济昆虫,在大规模饲养过程中,也极易受到环境污染的影响,从而造成大规模死亡导致蚕业减产绝收,严重影响蚕农的经济效益,危害整个蚕桑产业的发展。近年来,在传统蚕区因为环境污染导致的家蚕幼虫中毒死亡,蚕丝减产等事故时有报道。因此,解析环境污染因子的毒理学机制,创制高耐受性的家蚕品系对于家蚕抵抗环境污染的危害乃至整个蚕桑产业的可持续发展都是至关重要的。环境污染主要包括两个方面,土壤重金属污染和大气污染,在本研究中我们选取两种典型的环境污染因子进行试验,分别是大气污染中的氟（Fluoride,卤族元素之首,对动植物生长、人类健康和生态系统功能有严重影响）与重金属污染中的镉（Cadmium,影响最广的微量重金属元素,对动植物、人体健康影响最大）。以家蚕为研究对象,综合利用异源转基因过表达、CRISPR全基因组编辑细胞文库筛选及CRISPR个体突变体库鉴定等多种技术手段,结合遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物信息学等多种实验方法,寻找氟/镉在家蚕中的靶标基因,探究家蚕对污染因子氟/镉的响应机制,并创制氟/镉高耐受性的家蚕抗性品系。本研究的主要结果和结论如下:1、通过转基因异源表达创制氟/镉高耐受性的家蚕品系关于污染因子在生物体中的毒理作用研究有着相当悠久的历史。为了提高家蚕对环境污染的抗逆性,早在上世纪80年代我国研究学者就开展了关于家蚕抵抗大气污染和重金属污染的相关研究。早期方法是将传统品种进行杂交选育,然后给予高浓度的污染因子暴露处理,收集存活个体进一步杂交选育最终得到抗性品种。近年来,酶活测定、转录组测序、蛋白质组鉴定等多种方法被用于探究污染因子在家蚕中的毒理作用。但是,关于家蚕抵抗氟/镉污染的大多数研究仍集中在观测幼虫生理生化指标的改变以及基因、蛋白表达的差异,对发现污染因子的分子靶标和创制抗性素材的帮助十分有限。因此,我们首先尝试寻找污染因子氟/镉在家蚕中的关键靶标分子,并通过基因改良的方式解析家蚕抗逆机制,培育家蚕抗逆品系。在本部分研究中,我们通过分析镉暴露处理后的家蚕幼虫中肠转录组数据,首次鉴定到一个家蚕的金属硫因蛋白基因（Metallothionein,MT）,并将其命名为BmMT。该基因编码蛋白具有典型的金属硫因蛋白家族特征,含有10个半胱氨酸,不含芳香族氨基酸。实验结果显示,在镉离子胁迫处理后,BmMT基因在家蚕幼虫和胚胎细胞（BmE）中表达量均显着下调,而在大肠杆菌中表达该蛋白可以增强大肠杆菌对镉离子和铜离子的耐受性,在家蚕BmE细胞中过表达该基因可以显着增强细胞对镉离子的耐受性,因此推测BmMT是一种理想的重金属耐受性蛋白。随后,我们尝试构建BmMT转基因过表达家蚕品系以提高家蚕幼虫对镉离子的耐受性,但是由于BmMT可能还具有某些未知的功能,导致其转基因过表达品系具有严重的生长发育缺陷。基于此,我们选择在个体水平过表达人类和果蝇中功能已被详细报道的金属硫因融合蛋白hDMT进行抗性品种的创制。hDMT转基因阳性个体攻毒实验证实,该蛋白的异源表达可以显着提高家蚕幼虫对镉离子的耐受性。同时为了提高家蚕对氟离子的耐受性,我们尝试通过序列比对和转录组数据分析在家蚕中寻找氟转运蛋白（Fluoride exporter,FEX）,但很遗憾的是在本研究中我们并未发现家蚕的FEX蛋白。因此,我们选择来自拟南芥和堡礁海绵中的FEX蛋白（FEX-At,FEX-Aq）进行研究,结果显示FEX蛋白在家蚕细胞水平上的过表达可以显着提高氟离子暴露处理下细胞的存活率。通过转录组筛选和转基因过表达的方法可以在一定程度上发现靶标基因并实现抗性品种的创制。但是转录组测序中响应基因数量众多,筛选难度大且筛选必须依赖于已有研究基础,无法全面发现家蚕中的抗逆基因和响应机制,而且由于涉及到转基因的政策问题,该方法得到的抗性品系无法得到大规模推广和应用。因此,为了更加全面地挖掘抗性基因、解析毒理机制,并实现高耐受性的家蚕品系创制,我们利用CRISPR全基因组文库筛选的方式开展了后续研究。2、利用CRISPR全基因组编辑细胞文库筛选氟/镉的靶标基因全基因组范围内的高通量功能缺失性筛选已逐渐成为研究抗性基因、药物靶标和激素调控等生物学问题的关键技术手段,尤其是近几年来诞生的以CRISPR为基础的第二代全基因组编辑细胞文库筛选技术。本课题组前期在家蚕中构建了CRISPR全基因组编辑细胞文库,并成功实现了对家蚕必需基因/非必需基因、温度响应基因以及BmNPV（Bomyx mori Nucleopolyhedrovirus）侵染过程关键基因的筛选,证实了 CRISPR全基因组编辑文库在家蚕中的简便性和高效性。在本部分研究中,我们利用家蚕BmE细胞CRISPR全基因组编辑文库分别实现了对污染因子氟/镉暴露相关基因的筛选。首先,我们验证了氟/镉的细胞毒性,二者在BmE细胞中攻毒浓度和中毒表型均有很大差异,暗示家蚕对氟/镉的响应机制的差异性。我们经过活性测定实验得到NaF的IC50为8.64 mM,CdCl2的IC50为3.08μM。然后我们将本实验室保存的全基因组敲除细胞库进行大量扩增,将扩增后的细胞分为3组,每组约为4×107个细胞。这3组分别为对照组（正常培养基培养）、NaF处理组（含4.32 mMNaF培养基培养）和CdCl2处理组（含1.59 μM CdCl2培养基培养）。经过7天持续培养,对照组细胞扩增2-3倍,两个实验组细胞量约为初始细胞的1/10。收集存活的细胞,提取基因组DNA,扩增其中的sgRNA区域,将大量PCR产物建库后进行二代测序和MAGeCK数据分析,得到筛选结果。在镉暴露处理中,我们鉴定到757个抗性基因和725个敏感基因,在氟暴露处理组中鉴定到751个抗性基因和753个敏感基因,随后我们对筛选结果进行了单基因细胞敲除实验和荧光定量实验,证实了筛选排名靠前的基因确实参与了污染因子氟/镉的侵害过程。然后我们证实MAPK信号通路与DNA损伤修复通路在氟/镉暴露处理过程中发挥着重要作用。同时我们对筛选排名Top 50的基因进行敲除载体的构建和个体显微注射,将sgRNA阳性个体与Cas9品系杂交,经过荧光筛选得到了多个敲除品系。经过攻毒实验证实,镉处理组中的靶标基因BGIBMGA003267的敲除显着提高幼虫对镉离子的耐受性,氟处理组靶标基因BGIBMGA007400的敲除可以提高幼虫对氟离子的耐受性。因此,在本部分研究中我们借助细胞文库的筛选鉴定了氟/镉暴露处理的相关基因,绘制了氟/镉在家蚕中的毒理作用网络,同时为抗性品系的创制提供了靶标。3、利用家蚕个体突变体库筛选氟/镉的抗性品系细胞水平全基因组编辑文库筛选操作简便且周期短,有利于发现新的靶标基因用于解析毒理机制。与之相比,个体突变体库筛选前期文库创制工作量大,消耗周期长但筛选效果更佳,有利于直接发现抗性品系,同时避免一些必需基因的影响。因此在进行了家蚕BmE细胞CRISPR全基因组编辑文库筛选之后,我们又进行了家蚕个体突变体库的筛选工作。在前期构建细胞文库的同时,本实验也构建了适用于个体基因敲除的sgRNA载体文库。经过大规模显微注射,荧光筛选,sgRNA阳性品系获取,与Cas9品系杂交,荧光二次筛选等步骤,我们共获得520个突变品系。将包含这些品系的突变体库统一饲喂添加了氟化钠、氯化镉的人工饲料,十天后收取存活个体。经测序检测,我们发现镉处理组20.75%的个体富集到同一个sgRNA,靶基因为BGIBMGA000475,攻毒实验结果表明敲除该基因的家蚕幼虫对镉离子的耐受性显着提升。细胞水平筛选结果与个体水平筛选结果结合分析表明,镉暴露处理后,BGIBMGA000475与BGIBMGA003267基因均被诱导上调表达,从而激活内质网压力,进一步引起Ca2+信号紊乱,最终导致细胞死亡。在氟处理组中,13.11%的存活个体富集到同一个sgRNA,靶基因为BGIBMGA013244。经过进一步细胞实验验证,我们发现氟离子进入细胞后通过BGIBMGA013244基因激活TGF-β和JNK信号通路从而诱导细胞死亡。因此,个体突变体库的筛选一方面鉴定得到了氟/镉的抗性品系,另一方面也完善了家蚕对污染因子氟/镉的响应机制。综上所述,在本研究中我们依次通过转基因异源过表达抗性基因（hDMT、FEX-At/Aq）、利用家蚕CRISPR全基因组编辑细胞文库筛选及利用家蚕CRISPR个体突变体库筛选三种方式,鉴定了氟/镉在暴露过程中的一系列靶标基因,完善了家蚕对污染因子氟/镉暴露过程中的响应机制,创制了对氟/镉高耐受性的家蚕抗性品系,为蚕桑产业的可持续发展与改革创新提供了新的思路。同时,我们的工作也证明了利用CRISPR全基因组编辑文库进行污染因子响应机制解析和昆虫抗性素材制备方面的优越性和高效性。
韩聪[2]（2020）在《宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究》文中研究表明猪圆环病毒2型（porcine circovirus type,PCV2）引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated diseases,PCVDs）,PCV2感染首先侵害机体的免疫系统,引起机体产生免疫抑制从而对多种病原易感,导致感染猪群病死率显着升高,生产性能明显下降,给养猪业造成巨大的经济损失。PCV2基因组包含11个重叠的开放阅读框（ORFs）,其中最重要的是ORF2,ORF2编码的衣壳蛋白Cap是PCV2的唯一结构蛋白,在病毒复制过程中,Cap参与了病毒基因组的入核以及成熟病毒粒子的组装。信号传导及转录激活蛋白5（signal transducer and activator of transcription5,STAT5）是一种多功能的转录因子,具有与DNA结合的特性。核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1,NPM1）是一种多功能的宿主蛋白,不仅参与多种细胞生理活动,还在多种病毒的复制过程中发挥重要作用。热休克蛋白40 B6（heat shock protein40 B6,DNAJB6）属于热休克蛋白40（Hsp40）家族成员之一,参与细胞中蛋白的折叠、转运、蛋白复合物的组装、错误折叠蛋白的降解以及病毒复制的调控。但是,有关STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制迄今未见报道。本论文首先通过免疫共沉淀筛选并鉴定了与Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6,然后分别研究STAT5、NPM1及DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制,研究结果将为进一步探索PCV2致病机制奠定基础。研究取得以下结果。1.以Cap抗体进行免疫共沉淀,筛选到Cap的关键宿主细胞互作蛋白STAT5、NPM1及DNAJB6。分别设计针对stat5、npm1及dnajb6的引物进行PCR,扩增出猪源stat5、npm1及dnajb6基因,克隆入真核表达载体p CI-neo,酶切和测序鉴定结果显示,p CI-His-STAT5、p CI-Flag-NPM1及p CI-Flag-DNAJB6载体构建成功。与人源及鼠源的序列比较结果显示,猪源STAT5氨基酸序列与鼠源STAT5的同源性最高（96.3%）。猪源NPM1氨基酸序列与人源NPM1的同源性最高（98.2%）。猪源DNAJB6氨基酸序列与人源DNAJB6的同源性最高（90.9%）。1 MOI的PCV2感染PK-15,间接免疫荧光染色后发现,Cap与STAT5和NPM1在细胞核中发生共定位,与DNAJB6在细胞核和细胞质中均发生共定位。PCV2感染后28 d扑杀猪,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结中均能检测到STAT5、NPM1和DNAJB6,与对照组相比,NPM1、STAT5的m RNA水平和蛋白水平在各种组织中均未见明显差异（p>0.05）,而DNAJB6在肺脏、肾脏及淋巴结中的m RNA水平和蛋白水平显着高于对照组（p<0.05）。2.将p EGFP-Cap和p CI-His-STAT5共转染至HEK293T后免疫共沉淀结果显示,Cap与STAT5存在互作。GST-pull down检测发现,Cap与STAT5不能直接结合。用stat5 si RNA处理PK-15后,测定PCV2感染细胞上清中的病毒DNA拷贝数。结果显示,干扰效率最高si RNA#1组的PCV2DNA拷贝数显着低于非特异性si RNA转染组的病毒拷贝数（p<0.05）。PCV2 DNA序列中包含有GAS样基序（5’TTCTCTGAA3’）,该基序是STAT5保守的结合位点,DNA pull down试验证实PCV2 DNA GAS样基序突变的感染性克隆（PCV2-MDS）不能与STAT5结合,而野生型PCV2 DNA能与STAT5结合。用等量的野生型PCV2和PCV2-MDS感染PK-15 12 h、24 h,FISH检测病毒DNA复制显示,与野生型PCV2感染的细胞相比,在PCV2-MDS感染24 h的细胞中靶向病毒基因组DNA复制链（负链）的探针（RFP）和靶向病毒基因组模板链（正链）的探针（CP）阳性细胞数量都显着降低（p<0.05）;荧光定量PCR检测显示,在感染后12 h及24 h,PCV2MDS感染细胞中病毒DNA拷贝数显着低于野生型PCV2感染细胞（p<0.05）。3.干扰npm1的PK-15再用PCV2感染24 h后发现,与对照组相比,转染靶向npm1特异性si RNA#1的细胞中,病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。利用CRISPR/Cas9技术构建npm1敲除的PK-15,与野生型细胞相比npm1敲除的PK-15细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。GST-pull down结果显示,STAT5能与NPM1直接互作,NPM1与PCV2 Cap直接互作。构建NPM1及其截短体原核表达载体和Cap截短体真核表达载体,GST-pull down确定NPM1与Cap的结合区域分别为NPM1的151-158 aa及Cap的136-153 aa。将Cap 147位精氨酸及148位组氨酸突变为丙氨酸的PCV2突变毒株（PCV2-Nm A）感染PK-15后发现,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A感染的细胞中病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.05）。荧光原位杂交结果显示,与野生型PCV2感染相比,PCV2-Nm A细胞中RFP及CP阳性细胞数量均显着降低（p<0.05）。4.以1 MOI PCV2感染PK-15,与对照组相比,DNAJB6 m RNA水平在感染36 h后显着增加（p<0.05）,48 h进一步增加（p<0.01）,DNAJB6的蛋白水平与m RNA水平变化一致。分别用不同剂量PCV2感染PK-15 36 h发现,DNAJB6表达量随PCV2感染剂量的增加而增加。免疫共沉淀显示DNAJB6与Cap互作,GST-pull down明确互作区域为DNAJB6的1-99 aa和Cap的162-234 aa。用等量PCV2分别感染野生型PK-15、dnajb6敲除的PK-15(PKDNAJB6-/-)以及dnajb6未敲除的PK-15(PKDNAJB6+/+)48h发现,与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中Cap蛋白和病毒产生水平显着降低（p<0.05）。与野生型PK-15和PKDNAJB6+/+相比,PKDNAJB6-/-中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着降低（p<0.01）。用等量PCV2感染野生型PK-15、dnajb6过表达PK-15(PKDNAJB6)及转染空载体的PK-15（PKV）发现,与野生型PK-15和PKV相比,PKDNAJB6中Cap蛋白和病毒产生水平显着增加（p<0.05）,并且PKDNAJB6中由PCV2感染和Cap蛋白表达诱导的自噬小体数量显着升高（p<0.05）。构建DNAJB6与Cap互作位点缺失质粒p CI-CapΔ162-234和p CI-DNAJB6ΔJ。分别转染p CI-Cap、p CI-CapΔ162-234和p CI-neo于稳定表达GFP-LC3的PK-15 24 h发现,与转染p CI-Cap的细胞相比,转染p CI-CapΔ162-234的细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）。在稳定表达GFP-LC3的PKp DNAJB6-/-中先分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo质粒,再感染等量的PCV2或转染等量的p CI-Cap质粒发现,与转染p CI-DNAJB6的细胞相比,p CI-DNAJB6ΔJ转染细胞中自噬小体数量显着降低（p<0.01）,且病毒DNA拷贝数显着下降（p<0.01）。用自噬抑制剂3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6-/-后分别转染p CI-DNAJB6、p CI-DNAJB6ΔJ及p CI-neo后再用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理转染p CI-DNAJB6的PKp DNAJB6-/-中病毒产生水平显着下降（p<0.01）。3-MA或DMSO处理PKp DNAJB6后用等量PCV2感染发现,与DMSO处理相比,3-MA处理的细胞中病毒产生水平显着降低（p<0.01）。用atg5 si RNA处理PKp DNAJB6后再用等量PCV2感染发现,抑制atg5的表达显着降低PCV2诱导的自噬小体的形成及病毒产生水平。本研究筛选到与PCV2 Cap互作的宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6。发现STAT5与Cap间接互作,STAT5还与PCV2 DNA的GAS样基序结合,获得了复制能力低于野生型PCV2的GAS样基序突变毒株。发现NPM1能与Cap和STAT5直接互作,鉴定出NPM1与Cap互作区域,获得了PCV2 Cap 147、148位点突变的毒株,该毒株的复制能力显着低于野生型PCV2。PCV2感染上调DNAJB6的表达,且Cap 162-234 aa与DNAJB6 1-99 aa直接结合,突变DNAJB6/Cap互作位点、自噬抑制剂处理或抑制atg5基因表达都能显着降低PCV2感染诱导的自噬小体和病毒产生水平。本论文研究结果阐明了宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中的作用及机制,为进一步揭示PCV2的致病机制提供理论依据。
项平[3]（2020）在《SMYD3基因在肾细胞癌中的作用及机制研究》文中研究表明肾细胞癌（RCC）是最常见的癌症之一,约占所有恶性肿瘤的3-5%。在美国,RCC的发病率持续增加,部分原因是肥胖,高血压,吸烟和暴露于其他危险因素的发生率高,另外由于影像学的应用不断增加,肿瘤的检测也得到了改善。据统计,2017年美国估计有63,990例新的RCC病例和14,400例与RCC相关的死亡病例发生。目前外科手术仍是RCC的主要治疗方法,但是存在大约20-40%的患者可能在肾切除术后复发或转移。由于复发或远处转移,晚期RCC患者的5年生存率极低（5-10%）。RCC对放疗和化疗不敏感,因此包括索拉非尼,舒尼替尼和抗血管生成的多酪氨酸激酶抑制剂依维莫司和西罗莫司在内的靶向治疗,已被开发并广泛用作一线和二线治疗。然而,它们对改善患者生存率的影响仍然有限。肿瘤发生和发展是受基因表达变化影响的多步过程,因此,研究肾细胞癌中发生的基因表达变化对改善RCC的诊断,治疗和预防有十分重要的作用。含有 SET（Suppressor of variegation,Enhancer of Zeste,Trithorax）和MYND（myeloid-Nervy-DEAF-1）结构蛋白3（SMYD3）最近由于在各种肿瘤中的失调以及在肿瘤发展中的重要作用而备受关注。SMYD3是一种组蛋白甲基转移酶（Histone lysine methyltransferases,KMTs）,它包含一个 SET 结构域,并具有组蛋白H3-K4二/三和H4-K5-甲基转移酶的活性。它在其下游靶基因的启动子区域识别并占据了5’-CCCTCC-3’的DNA结合基序,并使H3-K4二甲基/三甲基化,从而导致转录激活。在许多类型的正常人体组织中,SMYD3的表达无法检测或非常弱,而研究发现SMYD3的过表达与结直肠癌、肝细胞癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生和发展有关。指导教师刘承教授在2007年以前已经对SMYD3开展相关研究,其研究发现端粒酶逆转录酶（hTERT）基因是组蛋白甲基转移酶SMYD3的直接靶标,而后课题组相继发现SMYD3通过刺激雄激素受体转录而成为前列腺癌的致癌驱动因子以及SMYD3通过IGF-1R/AKT/E2F-1阳性反馈回路促进膀胱癌的肿瘤的进展,因此对于SMYD3基因具有一定的认识以及科研积累。基于SMYD3在癌症中的重要作用,以及对SMYD3的不断研究从而取得的新认识,使课题组对SMYD3是否在肾癌细胞中发挥作用产生浓厚兴趣,遂逐步对SMYD3在肾癌中的作用展开研究。在这项研究中,我们确定了 SMYD3通过在转录水平直接激活EGFR促进了 RCC的增殖。使用实时PCR,免疫印迹及免疫组织化学等研究方法,我们发现肾细胞癌组织中的SMYD3表达与非肿瘤组织相比明显升高。而SMYD3的耗竭抑制RCC细胞增殖、集落形成和异种移植肿瘤的形成,但是增加细胞凋亡。通过染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因分析,在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）启动子区域鉴定出两个功能性SMYD3结合基序。此外,我们验证了 SMYD3和特异性蛋白1(（specifieity protein 1,Sp1）在EGFR启动子结合位点的结合,从而增加了 RCC细胞中EGFR的转录活性。据我们所知,这是首次证明SMYD3促进RCC恶性进展并介导EGFR表达的表观遗传上调。综上所述,通过我们的研究发现SMYD3在人肾细胞癌组织中的表达上调,并且SMYD3通过直接调节EGFR对RCC具有致瘤作用,而EGFR的过表达和包括RCC在内的各种肿瘤细胞的转移、侵润、较差的预后密切相关。我们的研究结果可以很好的为探索SMYD3在促进肾细胞癌的进展机制,治疗肾癌药物研发和预防肿瘤发生的方法提供理论基础。第一部分SMYD3在肾细胞癌组织中的表达及意义研究目的:研究肾细胞癌（RCC）组织及正常肾组织中SMYD3的表达,研究其表达水平与患者预后的关系,探讨SMYD3在RCC的可能作用。研究方法:采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real-time Quantitative PCR,qPCR）检测12例肾癌组织和癌旁正常组织中SMYD3的表达水平,并采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）进一步验证SMYD3的表达;对103例肾癌患者术后标本采用免疫组化（IHC）检测SMYD3在肾癌及癌旁组织中的表达差异;根据肾癌Fuhrman核分级及病理分期、患者预后进行统计学分析,研究SMYD3的表达水平与其相关性。研究结果:qPCR分析显示,与正常组织相比,RCC组织中SMYD3表达水平升高,SMYD3蛋白的表达分析得出相似的结果。肾癌Fuhrman核分级3/4级患者100%（4/4）SMYD3表达呈强阳性,Fuhrman核分级1级患者75%（24/32）呈弱阳性,病理分期Ⅲ和Ⅳ分期RCC中SMYD3的表达水平显着高于Ⅰ期RCC,差异具有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meir生存曲线分析发现SMYD3表达较高的肾细胞癌患者生存率较低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:RCC组织中SMYD3的表达明显升高,表明SMYD3在肾癌中可能起到促癌基因的作用。随着肿瘤分期的增加,SMYD3高表达的比例越高,SMYD3高表达组患者预后不佳,SMYD3高表达可能是患者预后不佳的标志物。第二部分SMYD3在肾癌细胞中的功能研究研究目的:通过研究SMYD3对RCC细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,验证SMYD3在肾癌细胞中的功能。研究方法:用sh-SMYD3或对照shRNA转染4株RCC细胞,以获得抑制SMYD3蛋白在RCC细胞中表达的细胞。使用CCK-8法研究SMYD3的表达对RCC细胞增殖的影响,使用流式细胞仪分析转染细胞中的细胞凋亡和细胞周期分布。建立裸鼠RCC异种移植模型,研究SMYD3对肿瘤生长的影响。研究结果:成功建立sh-SMYD3转染的细胞,SMYD3表达的降低显着抑制了RCC细胞的生长（P<0.05）;与对照组相比,在sh-SMYD3转染的细胞中发现更多的凋亡细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）;但没有证据表明SMYD3的下调会诱导RCC细胞中的G1细胞周期停滞。裸鼠RCC异种移植模型中,sh-SMYD3的小鼠种植肿瘤大小较对照组明显减小,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:下调SMYD3在肾癌中的表达可明显抑制肾癌细胞的增殖能力,并增加细胞凋亡,但并不能证明可诱导G1细胞周期停滞。体外实验进一步证明SMYD3的下调抑制肾癌细胞的增长。第三部分SMYD3通过EGFR调节RCC机制的研究研究目的:探究SMYD3介导RCC细胞效应的分子机制,探索其靶向调控作用。研究方法:基因表达微阵列分析出与SMYD3关联的基因,采用qPCR和Western blot及双荧光素酶报告法分析A498、KRC/Y和786-0细胞株中SMYD3对EGFR转录和表达水平的影响;采用基因芯片法检测EGFR启动子处H3-K4单/二/三甲基化的状态,以确定SMYD3对EGFR表达的影响。通过双荧光素酶报告分析及基因芯片技术研究SMYD3表达的缺失对H3乙酰化和表皮生长因子受体启动子区Sp1占有率的影响,进一步探讨SMYD3通过EGFR调控肾癌细胞发展的机制。研究结果:基因表达微阵列分析发现EGFR在SMYD3缺失的RCC细胞中表达受到抑制;SMYD3的表达抑制导致EGFR mRNA和蛋白质丰度显着降低;双荧光素酶报告分析发现SMYD3对荧光素酶结构的活性具有正向调节作用。EGFR基因转录起始位点上游识别了四个假定的SMYD3结合元件。相应地,MT3或MT4的突变使A498和KRC/Y细胞的EGFR启动子反式激活被阻断。芯片法检测分析发现在EGFR启动子区H3-K4的二甲基化/三甲基化需要SMYD3,且SMYD3的缺失导致肾癌细胞EGFR启动子处组蛋白H3和Sp1结合乙酰化减少。结论:EGFR具有SMYD3的结合位点,并正向调节EGFR的表达。研究发现SMYD3缺失导致肾癌细胞EGFR启动子处组蛋白H3和Sp1结合乙酰化减少,导致EGFR启动子区H3-K4的二甲基化/三甲基化水平降低,从而引起EGFR的转录和表达水平降低,抑制肾肿瘤进展。
祁增[4]（2020）在《人参皂苷及融合毒素的生物活性研究》文中提出第一篇 人参皂苷的化学成分和减毒活性研究五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Meyer）,主要分布在中国东北、韩国和日本,在我国人参的药用历史已有千年之久。通过对化学成分的深入研究,为更好地开发和利用我国东北地区道地中药材资源——人参和西洋参提供了科学依据和物质基础;通过催化氢化反应对一系列达玛烷型人参皂苷（元）进行结构修饰,完善了人参皂苷（元）二氢产物化合物库;采用体内外实验对人参皂苷及其衍生物的减毒作用进行研究。取得的创新科学成果如下:1.林下山参,又称“籽海”,是指在深山或森林中播种后不加人工干预的半野生人参。通过对林下山参“珍珠疙瘩”的研究,分离得到四个新的三萜皂苷类化合物 ginsengenin-S1（1）、ginsengenin-S2（2）、ginsenoside-S3（3）、ginsenoside-S4（4）和一个首次从该部位提取得到的新天然产物ginsenoside-S5（5）。采用香烟烟雾刺激诱导的人肺上皮细胞氧化损伤模型研究了这5个化合物的抗氧化活性发现,ginsengenin-S2能有效抑制香烟烟雾诱导的氧化应激和炎症反应,其抗氧化抗炎作用和Nrf2和HDAC2通路有关。2.西洋参茎叶中发现一个奥克梯隆型新人参皂苷——12-酮-拟人参皂苷F11（21）,其结构式为6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-（1-2）-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-12-酮-20S,24R-环氧-3,6α,12β,25-四醇。采用过氧化氢刺激诱导的人肺上皮细胞氧化损伤模型研究该化合物的抗氧化活性发现,12-酮-拟人参皂苷F11能呈剂量依赖性地提高细胞活力,通过抑制MDA的生成、提高SOD和GSH水平、上调Nrf2和HO-1蛋白表达,缓解过氧化氢引起的肺上皮细胞氧化损伤。3.通过催化氢化反应对一系列人参皂苷（元）化合物进行结构修饰,获得18个二氢人参皂苷（元）衍生物,包括10个新化合物:2H-Rb2（23）、2H-Rb3（24）、2H-Rc（25）、（20S）-2H-Rh2（28）、2H-F2（29）、2H-gypenoside ⅩⅦ（30）、2H-gypenoside LⅩⅩⅤ（31）、2H-Rg1（35）、2H-Rg2（36）、2H-Rh1（37）,完善了人参皂苷（元）二氢产物化合物库;基于人参茎叶,大量制备了稀有皂苷人参皂苷Rh2及其衍生物二氢人参皂苷Rh2、（24R）-拟人参皂苷HQ（40）和（24S）-拟人参皂苷HQ（41）,为开展体内减毒药效学研究提供物质基础。4.采用顺铂诱导的急性肾损伤动物模型,对Rh2的预防性治疗肾损伤作用和相关机制进行研究。研究发现,Rh2能缓解CDDP诱发的肾功能不全和肾脏器质性损伤,减轻氧化应激、炎症反应和肾小管凋亡,同时调节肾脏组织中Bcl-2、p53、Bax、cytochrome c、caspase-8、caspase-9、caspase-3 的蛋白表达水平,提示Rh2的肾脏保护作用与caspase相关信号通路有关;代谢组学分析显示,Rh2能使29个血清代谢物恢复至正常水平。5.（24R）-pseudo-ginsenoside HQ（R-PHQ）和（24S）-pseudo-ginsenoside HQ（S-PHQ）是人参皂苷Rh2的潜在体内代谢物。Rh2、R-PHQ和S-PHQ能上调环磷酰胺（CTX）诱导的免疫抑制动物模型的先天和适应性免疫应答,其表现为白细胞数量、细胞免疫和巨噬细胞吞噬功能的恢复,同时观测到给药使T淋巴细胞亚群和血清细胞因子的水平也恢复正常;另外,联合给药R-PHQ或S-PHQ不影响CTX对H22肝癌的治疗作用。体内抗肿瘤研究发现,R-PHQ和S-PHQ可抑制肿瘤生长并诱导肝癌细胞的凋亡,调节肿瘤组织中Bax、Bcl-2和VEGF的表达,提示其抗肿瘤作用可能与caspase和VEGF相关信号通路有关。本研究为R-PHQ和S-PHQ的后续开发提供理论基础。第二篇 融合毒素靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究表皮生长因子受体在的大多数头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织上呈高表达,现有靶向表皮生长因子受体疗法对头颈部鳞状细胞癌的临床疗效并不是很理想,头颈部鳞状细胞癌患者的总体生存率仍然很低,迫切需要开发新颖的治疗方法来改善其临床治疗需求。在这项研究中,开发了一款新颖的基于白喉毒素的重组双价人表皮生长因子融合毒素。在体外,单价与双价融合毒素均对表皮生长因子受体阳性的头颈部鳞状细胞癌细胞有特异性的结合和杀伤,而对表皮生长因子受体阴性细胞无非特异性结合与杀伤。与单价融合毒素相比,双价融合毒素具有更好的体外结合亲和力。与FDA批准的表皮生长因子受体靶向药物特罗凯相比,本文报道的双价融合毒素在抑制头颈癌实体瘤生长、延长动物带瘤生存期方面表现出同等效力;在原位舌癌模型中也观察到双价融合毒素可延长动物带瘤生存期;值得一提的是,与其他受试药相比,双价融合毒素能更好地延长实验性转移头颈癌荷瘤小鼠的生存期。结果表明,双价人表皮生长因子融合毒素,在抑制原发性肿瘤生长方面优于单价人表皮生长因子融合毒素,在治疗转移性头颈癌方面优于特罗凯。因此,这款新型的双价人表皮生长因子融合毒素作为更好的靶向治疗表皮生长因子受体阳性头颈部鳞状细胞癌的候选药物具有巨大的开发潜力。
吴芳[5]（2020）在《METTL14介导的m6A修饰在HTLV-1致病过程中的作用与机制研究》文中指出人类T淋巴细胞白血病I型病毒（The human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1）是成人T细胞白血病（adult T-cell leukemia,ATL）的致病病毒。而ATL是一类淋巴系统恶性增殖性疾病,死亡率极高,极大威胁人类健康。遗憾的是,目前临床上缺乏针对ATL的有效治疗手段,归根结底是由于人们对HTLV-1致病机制的认识不足。N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A）是RNA转录后修饰的主要方式。研究表明,m6A修饰参与调节多种病毒的复制及病毒重要基因的表达。然而目前尚未有m6A修饰与HTLV-1的相关报道。本课题将从分子-细胞-动物三个水平,多角度探究m6A修饰在HTLV-1致ATL发生中的作用与机制。本研究首先发现HTLV-1感染细胞中m6A修饰水平呈现显着升高趋势,同时甲基化酶METTL14表达量显着升高。我们进一步构建稳定干扰METTL14的ATL细胞株,实验结果显示,抑制METTL14表达会导致m6A修饰水平降低。以上结果表明,METTL14表达可能是ATL细胞中m6A修饰水平异常的主要因素。其次,我们围绕METTL14的表达是否受病毒的影响开展了研究。我们发现病毒可通过自身编码蛋白HBZ促进METTL14表达,而TGF-β刺激因子可进一步促进HBZ的调控作用。紧接着,我们探究了METTL14在ATL细胞中的作用,发现稳定干扰METTL14表达能明显抑制细胞增殖以及ATL细胞的皮下成瘤效果,METTL14过表达则相反。最后,我们对METTL14影响ATL细胞增殖的分子机制进行了探究。我们检测了METTL14下游与细胞增殖相关的基因,发现抑制METTL14表达能明显上调CDKN1A/p21（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A）表达。进一步研究发现,METTL14主要通过m6A修饰负调控p21的表达,而稳定干扰p21表达能显着促进ATL细胞的增殖。综上所述,本研究首次证实了HTLV-1病毒感染细胞中m6A修饰水平升高的现象以及诱发的原因,并验证体内外高甲基化水平的功能,同时也探讨了相关的分子机制:METTL14是导致m6A修饰水平升高的主因且METTL14可以通过介导m6A修饰负调控p21表达,进而影响ATL细胞的增殖,而METTL14的表达又受到病毒蛋白HBZ调控。本研究有助于提高我们对m6A修饰在HTLV-1中的作用与功能的理解,同时也有望从RNA的表观遗传修饰水平为HTLV-1感染类疾病的防治提供新的科学依据。
孙静[6]（2020）在《青藏高原斑头雁与禽流感病毒的时空关系研究》文中研究说明禽流感（Avian Influenza,AI）,是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的家禽和野禽的一种传染病,表现为从呼吸系统到全身败血症等多种综合征。AIV已在全球范围内多种禽类物种中传播,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失,同时,能够感染人类的AIV亚型越来越多,主要以H5和H7为主。候鸟被认为是AIV的天然贮存库和遗传多样性的基因库,候鸟感染后通常不发病,通过迁徙的方式将AIV传播扩散至其他地区,在传播过程中,经过持续不断的基因突变或重组,可能产生新的高致病性毒株,因此候鸟对AIV的持续存在、进化和不断传播具有重要作用。通过对候鸟AIV的主动监测研究,了解掌握候鸟携带AIV的情况、AIV的遗传变异规律,继而阐明候鸟与AIV的时空分布关系,可对禽流感疫情的跨境扩散进行预警指示,为禽流感预警、防控提供科学的依据,意义重大。本研究于2015年5月至2019年8月,在青藏高原斑头雁的繁殖期和越冬期持续对斑头雁等候鸟样品进行采集,进而1、对青藏高原斑头雁等候鸟AIV感染状况进行监测,2、对代表性分离株进行全基因克隆和全基因组序列的遗传进化分析,3、进行斑头雁与青藏高原AIV的时空分布相关性分析。一、青藏高原斑头雁等候鸟AIV的监测研究及代表性分离株的遗传进化分析2015年5月至2019年8月,我们在青藏高原共采集野鸟样品28692份,分离到87株AIV,平均病毒分离率为0.3%。亚型鉴定结果显示,分离到多种亚型的AIV,其中HA优势亚型为H5（90.8%）,NA优势亚型为N1（45.9%）和N8（50.6%）。遗传进化分析结果显示,同一种亚型AIV存在不同的基因型,青藏高原候鸟中流行的AIV间存在广泛的基因重组,部分基因在北美大陆和欧亚大陆之间、在欧亚大陆和非洲大陆之间存在基因交流,青藏高原H5N1和H5N8亚型AIV与斑头雁迁徙路线上其他栖息地AIV高度同源。二、斑头雁与青藏高原AIV的时空分布相关性分析在遗传进化分析的基础上,我们进一步进行谱系地理发生学分析。结果显示,2015年青藏高原候鸟H5N1亚型高致病性禽流感疫情可能来源于印度家禽源H5N1亚型HPAIV:2016年青藏高原候鸟H5N8亚型高致病性禽流感疫情可能经斑头雁等候鸟迁徙由西藏传播扩散至俄罗斯,再由俄罗斯可能扩散至印度等南亚国家。由于中国周边国家缺少流感早期监测数据,因此青藏高原病毒来源尚不清楚;H5N1和H5N8禽流感疫情扩散或病毒传播的时空节点与斑头雁等已知的候鸟迁徙时空节律均一致,揭示斑头雁可能携带H5N1和H5N8亚型HPAIV进行长距离的迁徙,在迁徙过程中可与其他候鸟相互传播病毒,并发生基因重组;病毒的传播不仅发生于候鸟的某一迁徙通道上,而且不同迁徙通道的重叠、不同候鸟的混群交汇加速了 AIV的传播和扩散。
靳换[7]（2017）在《PRRSV nsp2、nsp10、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18、IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制》文中提出猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重危害全球养猪业的重要疫病之一,其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的非结构蛋白（nsps）在调控病毒的复制和致病中发挥着重要作用。研究PRRSV nsps与宿主细胞蛋白之间的相互作用及其生物学功能,对于阐明PRRSV复制和致病性的分子机制具有重要意义。本研究围绕PRRSVnsp2、nsp10、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18、IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制开展研究。在实验室前期研究发现宿主细胞蛋白DDX18分别与PRRSV nsp2和nsp10存在潜在相互作用的基础上,本研究采用免疫共沉淀（Co-IP）技术进一步证实DDX18可以分别与nsp2和nsp10互作,并确定了 nsp2的N端（PL2结构域）可以分别与DDX18的N端（DEXDc结构域）和C端（HELICc结构域）发生相互作用,DDX18 C端（HELICc结构域）又分别与nsp10的N端（ZBD结构域）和C端（解旋酶结构域）发生相互作用。利用间接免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜分析发现,DDX18可以从细胞核移位至细胞质,并分别与nsp2和nsp10共定位于细胞质中。沉默MARC-145细胞中DDX18基因的表达可以显着抑制PRRSV的滴度及ORF7的拷贝数,过表达DDX18蛋白则可增加PRRSV的滴度以及ORF7的拷贝数。以上研究结果提示PRRSV nsp2和nsp10与宿主细胞蛋白DDX18的相互作用可以促进PRRSV的复制。利用杂交瘤技术制备出一株抗PRRSVnsp11的单克隆抗体,命名为3F9,并鉴定出3F9所针对的nsp11抗原表位序列为“DCREY”。利用单克隆抗体3F9研究PRRSVnsp11与宿主细胞蛋白之间的相关性,发现nsp11与IRAK1之间存在互作。分析发现,nsp11与IRAK1共定位于细胞质中,沉默IRAK1基因表达可抑制IFN-β产生,从而促进PRRSV复制;过表达IRAK1蛋白则可抑制PRRSV复制。在MARC-145细胞中,PRRSV的感染可以抑制IRAK1蛋白的表达。进一步研究发现,PRRSV 感染可以上调 mml-miR-146a（MacacamulattamicroRNA-146a）的表达,后者靶向 IRAK1 3’UTR进而抑制 IRAK1 的表达,而 Inhibitor-mml-miR-146a 可以降低 PRRSV 对 IRAK1蛋白表达的抑制作用,并且呈剂量依赖性。此外,研究发现下调IRAK1蛋白的表达可以抑制IRF7蛋白的表达,进而抑制IFN-β的产生;mml-miR-146a还可以直接作用于PRRSV的基因组而抑制PRRSV的复制。上述研究结果证实了 nsp11与IRAK1之间的相互作用,并揭示了 IRAK1参与病毒复制的分子机制以及证实mml-miR-146a在PRRSV的复制过程中发挥双重调控作用。以上研究结果以PRRSV nsp2、nspl0、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18和IRAK1的相互作用为切入点,深入探究DDX18和IRAK1对病毒复制的影响,为阐明病毒的复制和致病机理提供科学依据。
王宇航[8]（2016）在《利用牛乳腺生物反应器表达重组人胆盐激活酯酶的研究》文中研究表明胆盐激活酯酶（bile salt-stimulated lipase,BSSL）是一种脂肪酶,主要在胰腺和泌乳期的乳腺组织中表达。BSSL具有广泛的底物水解活性,可以水解甘油酯、胆固醇酯、脂溶性维生素、鞘磷脂、糖脂和神经酰胺等。母乳来源的BSSL是对婴儿尤其是早产儿胰腺脂肪酶分泌不足的必要补充,对奶脂消化吸收具有重要作用。而BSSL不存在于牛奶和配方奶粉中,巴氏灭菌后人奶中的BSSL也会失活,因此额外的BSSL补充有益于改善婴儿奶脂的吸收,特别是针对由于各种原因不能获得新鲜母乳的婴儿。BSSL也可以被用于改善其他由于胰腺功能不全导致的脂肪消化障碍问题,因此该蛋白具有极高的研究和商业应用价值。在本研究中,我们构建了人源BSSL基因的高效表达载体,在小鼠模型上进行了载体效率的验证,并成功制备了乳腺内表达重组人胆盐激活酯酶（recombinant human bile salt-stimulated lipase,rhBSSL）的转基因牛。本研究成功构建了 rhBSSL的表达载体pBAC-hLF-hBSSL-Neo。该载体是以本实验室之前验证过的可以高效表达外源蛋白的人乳铁蛋白基因（hLF）BAC（bacterial artificial chromosome）序列为调控元件,载体包含乳铁蛋白基因91 kb 5’调控区,31 kb 3’调控区和9.8 kb hBSSL基因组DNA以及一个真核细胞抗性筛选标记Neo基因。原核注射重组BAC载体制备了 rhBSSL转基因小鼠,并在小鼠模型上对表达载体的效率进行了验证。结果表明:rhBSSL可以在小鼠乳腺组织中特异性表达,最高表达水平可达843.6 μg/ml,对应的活性为1023272.2 mU/mL。转基因母鼠代养幼鼠实验表明,rhBSSL可以促进幼鼠奶脂的利用,减少粪便中脂肪的含量。本研究利用在小鼠模型上验证的重组BAC载体转染牛成纤维细胞,并通过体细胞核移植技术制备了转基因克隆牛,成功获得了一头在乳腺组织中高表达rhBSSL的转基因牛。对转基因牛奶中rhBSSL蛋白表达水平进行定量分析,发现在初乳中rhBSSL的表达量约8.89 mg/ml,在常乳中rhBSSL的表达量约5.79 mg/ml,均显着高于之前报道的转基因羊奶中3 mg/ml的表达水平。本研究进一步建立了利用肝素凝胶色谱和凝胶过滤色谱从转基因牛奶中纯化rhBSSL的方法。利用高效液相色谱法对纯化的rhBSSL进行纯度分析,表明其纯度可达96.7%。生理生化分析表明本实验所纯化的rhBSSL与天然人奶BSSL具有相似的活性和等电点,相同的氨基端氨基酸序列,而且两者在胆盐依赖性、pH稳定性、热稳定性和蛋白酶稳定性方面没有显着性差异。综上所述,本研究构建了 rhBSSL乳腺特异性表达载体pBAC-hLF-hBSSL-Neo,成功制备了乳腺中高效表达具有天然生物活性的rhBSSL的转基因牛,并建立了从牛奶中纯化rhBSSL的方法。本研究为rhBSSL未来的商业化的开发和应用奠定了基础。
左陶[9]（2014）在《新型Vif小分子抑制剂的筛选及HIV-1适应性在疾病进程中变化规律的研究》文中认为获得性免疫缺陷症自上世纪80年代被报道以来在全球迅速蔓延，逐渐成为一个困扰全球的公共卫生问题和社会问题。至今还没有能够彻底治愈HIV-1感染的治疗手段。药物治疗受到病毒耐药性的限制，疫苗设计也始终不成功。在药物治疗方面，寻找新的治疗靶点，设计新型抗病毒药物是目前研究的热点。在疫苗设计方面，更深入地探究HIV-1的病毒学特征，了解病毒与疾病进程的关系，将为设计艾滋病疫苗提供信息。Vif （viral infectivity factor）是HIV-1的辅助蛋白之一，在病毒的复制和扩增中发挥重要功能。作为接头分子，Vif与人体内的CBF-ElonginB-ElonginC-Cullin5-Rbx复合物形成E3泛素连接酶，诱导宿主限制因子APOBEC3G（A3G）被蛋白酶体降解。当被Vif缺陷型病毒感染时，宿主细胞内的A3G可有效包装进入出芽的HIV-1颗粒中，并在下一轮感染中诱发针对病毒新生负义链cDNA的脱氨基作用，从而使病毒基因组上产生大量错义突变，提前终止病毒蛋白转录。A3G-Vif-E3复合物因此被认为是抗HIV-1抑制剂作用的潜在靶点。本文的第一部分通过计算机辅助药物设计和虚拟筛选得到了先导化合物VEC-5，并在细胞水平考察了VEC-5的抗病毒活性。结果显示，VEC-5能够干扰Vif介导的A3G降解，提升细胞和病毒颗粒中A3G蛋白的水平，从而降低病毒的感染性，抑制病毒扩增。免疫共沉淀和蛋白结合实验表明，VEC-5直接阻碍了Vif和ElonginC蛋白的相互作用，干扰A3G-Vif-E3复合物的形成。VEC-5是第一个作用于Vif与ElonginC相互作用的小分子抑制剂。以VEC-5为先导物，本文对其分子结构进行系统性优化，设计合成了207个化合物，并考察了它们的抗病毒活性。构效关系研究表明，VEC-5两侧的疏水结构对活性至关重要。萘基与ElonginC的Tyr76形成π-π相互作用，是VEC-5与靶点结合的重要作用力。将萘环替代为取代苯环，或将左侧苯甲酰基的苯环替换为吡啶环都将使活性显着下降。当萘环替换为芳甲胺后，化合物活性得到恢复。从结合模式可看出，芳甲胺的芳环伸入结合口袋，保持了与Tyr76的π-π作用，是保留化合物活性的原因。另外，在保持化合物两侧芳环相对位置不变的前提下取代基位置对调对活性没有影响。最后，VEC-5中氮茚母核的改造对活性影响不大，主要起到固定分子的空间构象的作用。这些研究揭示了VEC-5的作用机制，为开发新型抗HIV-1抑制剂提供了信息。HIV-1进入机体后，病毒载量在短时间内迅速上升，达到峰值后开始下降并逐渐趋于稳定，于6个月之内达到调定点（set point）。作为病毒的基本性质之一，适应性（fitness）被认为是影响病毒传播和疾病发展的重要因素。适应性较低的病毒在机体内引起的病毒载量可能较低，疾病的发展速度也可能较慢。但是，疾病发展进程中适应性的变化规律仍有待完善。本文的第二部分比较了来自感染者体内的奠基者病毒（transmitted/founder，T/F）、感染后6个月（6mo）和两年（2yr）的病毒，尝试寻找适应性与病毒载量及疾病进程间的关系，探究复制适应性的变化规律。以14位感染者为样本，我们构建了12对T/F和6mo，以及2对T/F和2yr病毒，并通过竞争性培养检测了它们的适应性差异。其中，9位感染者的T/F在第一轮竞争性培养中即胜出，几乎完全取代了对应的6mo病毒，说明T/F的复制适应性远高于6mo病毒。2位感染者（CH42、CH77）的T/F与6mo病毒在第一轮培养中适应性相当。但经过几次传代后，T/F最终压制了6mo的生长。即便在初始感染时6mo病毒量远高于T/F的情况下，T/F也显示出了明显的适应性优势，暗示病毒在急性感染期适应性急剧降低，6mo病毒的低适应性可能对维持低调定点病毒载量起着重要作用。同时，竞争性培养的结果显示，我们检测的两个2yr病毒的适应性均高于对应的T/F。T/F与2yr的混合病毒在CD4阳性T细胞中扩增3天后，培养上清中已检测不到T/F，全部是2yr病毒。这些结果表明某些病毒在慢性感染期向适应性更强的方向进化，使病毒能有效地抵御免疫反应的选择压力，维持较高的病毒载量，最终发展为艾滋病。根据这些结果，我们尝试提出了病毒适应性在疾病进程中的U型变化模式，即病毒适应性在急性感染期呈下降趋势，进入慢性感染期后开始反弹，并最终超越T/F时的适应性。病毒复制适应性变化规律的研究为预测感染者的疾病进展，设计合理的疫苗及免疫程序提供了理论依据。
刘霞[10]（2014）在《博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的蛋白质组学和乙酰化修饰组学研究》文中认为背景博尔纳病毒（Borna disease virus，BDV）是一种有包膜的单股负链非节段性RNA病毒，具有高度嗜神经性，能够感染包括人类在内的多种温血动物。近30年来在世界范围内开展了BDV的流行病学调查。尽管有大量流行病学数据显示BDV感染与抑郁、精神分裂症等人类精神疾病紧密相关，但是BDV感染与人类精神疾病的关联仍然存在巨大的争议，其主要原因在于BDV感染的致病机制仍不十分清晰，二者之间关联的直接证据尚不充分。随着定量质谱技术的发展，病毒蛋白质组学、翻译后修饰蛋白质组学对于探索病毒与宿主之间的互作关系和病毒致病机制正在发挥着日益重要的作用。BDV感染后宿主细胞的蛋白质组学改变及乙酰化修饰改变的数据十分有限，限制了从组学及修饰组学角度对BDV致病机制的理解。目的1.运用2种蛋白质组学的方法（双向凝胶电泳分离结合质谱鉴定技术（2D-MS），基于SILAC的定量蛋白质组学技术）鉴定正常和BDV感染的OL细胞的差异蛋白质表达，探讨BDV的可能致病机制。2.应用基于SILAC技术、抗体IP技术的定量蛋白质组学研究对正常和BDV感染的OL细胞的组蛋白乙酰化及巴豆酰化位点进行鉴定和相对定量分析。3.应用基于SILAC技术、抗体IP技术的定量蛋白质组学研究对正常和BDV感染的OL细胞进行蛋白质乙酰化修饰鉴定和相对定量分析，从差异乙酰化蛋白分析BDV的可能致病机制。方法1.构建及培养正常和BDV感染的OL细胞，采用2D-MS鉴定BDV感染相关的差异蛋白表达，运用Western blotting技术验证部分差异蛋白，应用CCK检测及细胞免疫荧光技术进一步探索BDV感染对细胞增殖和pERK1/2蛋白细胞核内表达的影响。2.采用SILAC技术培养正常和BDV感染OL细胞，细胞经传代培养6代后，提取正常和BDV感染的OL细胞的总蛋白和组蛋白。在定量蛋白质组学、组蛋白乙酰化鉴定和全蛋白组乙酰化鉴定这3个不同的实验中，分别将各组轻重同位素标记的样品等量混合，胰蛋白酶法酶解混合蛋白，用HPLC将混合蛋白分为多个组分。采用IP技术，用广谱赖氨酸乙酰化偶联富集乙酰化肽段。用LC-ESI-MS/MS检测蛋白质或富集的乙酰化肽段。组蛋白巴豆酰化修饰鉴定采用同样的方法。3.经过生物信息学分析，探讨BDV感染对OL细胞的蛋白质组的影响，对OL细胞组蛋白、非组蛋白乙酰化修饰的影响，进一步探索其可能的致病机制。结果1.应用2D-MS在正常和BDV感染OL细胞中共鉴定到63个差异蛋白。KEGG分析提示差异蛋白显着富集在戊糖磷酸途径，乙醛酸和二羧酸酯代谢，三羧酸循环，糖酵解/糖异生等能量代谢通路。通过手动查询，发现2个差异蛋白（CrkL，PEBP-1）与MAPK信号通路相关，进而用Western blotting验证了该途径的5个关键蛋白（p-Raf, p-MEK,p-ERK1/2, p-RSK, and p-MSK）。BDV感染导致p-ERK1/2和p-RSK显着上调，p-MSK显着下调。虽然BDV感染激活了ERK-RSK途径，但是OL细胞的增殖和p-ERK1/2在BDV感染的OL细胞的核内表达均受损。2.通过基于SILAC技术的定量蛋白质组学分析，在正常及BDV感染的OL细胞中鉴定到4383个可定量的非冗余蛋白及30个组蛋白乙酰化位点。生物信息学分析提示BDV感染后的差异蛋白富集在多种生物功能及通路上，包括代谢通路、免疫反应、DNA复制、修复及转录调控。此外，一些关键的组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶在BDV感染后发生了显着的改变。BDV感染后15个组蛋白赖氨酸位点乙酰化修饰显着下调，其中部分结果用位点特异性乙酰化抗体进行了Westernblotting验证。3.通过基于SILAC、IP技术的定量蛋白质组学分析，在正常及BDV感染的OL细胞中鉴定到791个可定量的非冗余赖氨酸乙酰化位点，这些位点位于473个可以定量的蛋白中。生物信息学分析提示鉴定到的乙酰化蛋白显着富集在代谢通路上，包括丁酸酯代谢，β-丙氨酸的代谢，色氨酸代谢和脂肪酸代谢。GO分析显示BDV感染后乙酰化的底物显着富集于细胞膜和线粒体，与跨膜转运活性密切相关。此外，BDV感染引起多种组蛋白乙酰转移酶的赖氨酸乙酰化修饰改变。4.初步鉴定到部分组蛋白巴豆酰化位点。结论1. BDV感染引起OL细胞的能量代谢相关蛋白改变。OL细胞中的BDV感染激活了ERK-RSK复合物，但是OL细胞的存活并未因此上调，反而下降，实验中所观察到的pERK核内表达受损可能是这一现象的重要原因。2.本研究在神经胶质细胞中进行了定量蛋白质组学分析，并提示BDV感染影响了代谢通路、免疫反应、DNA复制、修复及转录调控。本研究首次鉴定了组蛋白赖氨酸乙酰化位点。通过探讨BDV感染引起蛋白质组及组蛋白赖氨酸乙酰化改变之间的关联，可以加深我们对BDV感染致病机制的了解。3.本研究在BDV感染的神经胶质细胞中首次进行了乙酰化修饰定量蛋白质组学分析，发现BDV感染后发生改变的乙酰化蛋白富集在代谢通路上，提示BDV感染通过乙酰化修饰调控宿主细胞代谢通路，进一步证实了代谢改变在BDV致病作用中的重要性。4. BDV感染可能调节组蛋白巴豆酰化修饰。
二、BIV在人源细胞MT-4中的活性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、BIV在人源细胞MT-4中的活性研究（论文提纲范文）
（1）基于CRISPR全基因组筛选探究家蚕对污染因子氟/镉的响应机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 日趋严重的环境污染问题 |
| 1.2 环境污染对生态系统的影响 |
| 1.2.1 环境污染对植物的危害 |
| 1.2.2 环境污染对昆虫的危害 |
| 1.2.3 环境污染对哺乳动物的危害 |
| 1.3 环境污染对家蚕的影响 |
| 1.3.1 土壤重金属污染对家蚕的危害与毒理机制 |
| 1.3.2 金属硫因蛋白的研究基础 |
| 1.3.3 大气污染对家蚕的危害与毒理机制 |
| 1.3.4 氟转运蛋白FEX的研究基础 |
| 1.4 CRISPR全基因组筛选技术的研究概况 |
| 1.4.1 CRISPR全基因组筛选技术的发展 |
| 1.4.2 CRISPR技术在家蚕中的应用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景、目的与意义 |
| 2.2 科学目标与研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 通过转基因异源表达创制氟/镉高耐受性的家蚕品系 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 3.1.3 实验试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法与步骤 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 家蚕金属硫因蛋白Bm MT鉴定与分析 |
| 3.2.2 Bm MT原核表达增强E.coli对重金属的耐受性 |
| 3.2.3 Bm MT过表达增强Bm E细胞对镉的耐受性 |
| 3.2.4 Bm MT过表达影响家蚕幼虫的生长发育 |
| 3.2.5 h DMT转基因过表达增强家蚕幼虫对镉的耐受性 |
| 3.2.6 多个Bm MT基因的发现与鉴定 |
| 3.2.7 FEX的异源表达增强Bm E细胞对氟的耐受性 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 利用CRISPR全基因组编辑细胞文库筛选氟/镉靶标基因 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 4.1.3 实验试剂配制 |
| 4.1.4 实验方法与步骤 |
| 4.2 实验结果与分析 |
| 4.2.1 氟/镉在家蚕Bm E细胞中的毒性验证 |
| 4.2.2 针对氟/镉的CRISPR全基因组筛选 |
| 4.2.3 筛选得到候选靶标基因的功能验证 |
| 4.2.4 KEGG与 GO富集分析 |
| 4.2.5 氟/镉暴露引起Bm E细胞基因组损伤 |
| 4.2.6 氟/镉暴露激活MAPK信号通路 |
| 4.2.7 靶基因敲除突变体创制 |
| 4.2.8 BGIBMGA003267 敲除突变体增强幼虫对镉的耐受性 |
| 4.2.9 BGIBMGA007400 敲除突变体增强幼虫对氟的耐受性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 利用家蚕个体突变体库筛选氟/镉的抗性品系 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要实验仪器和试剂 |
| 5.1.3 实验试剂配制 |
| 5.1.4 实验方法与步骤 |
| 5.2 实验结果与分析 |
| 5.2.1 家蚕个体突变体库筛选 |
| 5.2.2 BGIBMGA000475 敲除突变体增强幼虫对镉的耐受性 |
| 5.2.3 Cd~(2+)诱导细胞内Ca~(2+)信号紊乱 |
| 5.2.4 PGAM通过TGF-β信号通路调控氟离子对家蚕的毒害作用 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 综合与讨论 |
| 论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间发表论文及参研课题 |
| 致谢 |
（2）宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.1 宿主细胞蛋白在动物病毒复制过程中作用及机制 |
| 1.1.1 NPM蛋白家族 |
| 1.1.2 Hsp家族成员 |
| 1.1.3 组蛋白分子伴侣 |
| 1.1.4 MCM家族成员 |
| 1.1.5 STAT家族成员 |
| 1.1.6 TRIM家族成员 |
| 1.1.7 波形蛋白 |
| 1.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作研究进展 |
| 1.2.1 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒吸附和入胞过程中作用与机制 |
| 1.2.2 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒入核和复制过程中作用与机制 |
| 1.2.3 PCV2与宿主细胞蛋白互作在病毒出核及出胞过程中作用与机制 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白筛选与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 2.1.2 载体及主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PCV2 Cap宿主细胞互作蛋白的筛选 |
| 2.2.2 stat5克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 npm1克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建 |
| 2.2.5 不同种属来源的STAT5、NPM1及DNAJB6 序列比对 |
| 2.2.6 激光共聚焦检测STAT5、NPM1及DNAJB6 亚细胞定位 |
| 2.2.7 试验动物及分组设计 |
| 2.2.8 STAT5、NPM1、DNAJB6的m RNA水平检测 |
| 2.2.9 组织STAT5、NPM1、DNAJB6 表达情况检测 |
| 2.2.10 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCV2 Cap宿主互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 2.3.2 stat5克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.3 npm1克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.4 dnajb6克隆及真核表达载体的构建与鉴定 |
| 2.3.5 STAT5序列比对分析 |
| 2.3.6 NPM1序列比对分析 |
| 2.3.7 DNAJB6序列比对分析 |
| 2.3.8 STAT5在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.9 NPM1在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.10 DNAJB6在PCV2 感染细胞中的亚细胞定位 |
| 2.3.11 STAT5在PCV2 感染猪组织中的表达量变化 |
| 2.3.12 NPM1在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.3.13 DNAJB6在PCV2 感染猪组织中的表达变化 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 宿主细胞蛋白STAT5在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒及菌种 |
| 3.1.2 载体、主要试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 stat5原核表达载体的构建 |
| 3.2.2 免疫共沉淀检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.3 GST-pull down检测Cap和 STAT5 的互作 |
| 3.2.4 干扰stat5 表达对PCV2 复制的影响 |
| 3.2.5 DNA pull-down检测STAT5与PCV2 DNA互作区域 |
| 3.2.6 PCV2 DNA结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 3.2.7 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 3.2.8 荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 STAT5原核表达载体的鉴定 |
| 3.3.2 免疫共沉淀检测Cap与 STAT5 互作 |
| 3.3.3 GST-pull down鉴定Cap和 STAT5 互作 |
| 3.3.4 干扰stat5 表达显着抑制 PCV2 的复制 |
| 3.3.5 PCV2突变毒株的构建与鉴定 |
| 3.3.6 DNA pull down验证PCV2 DNA与 STAT5 互作区域 |
| 3.3.7 突变毒株PCV2-MDS在细胞内的复制情况 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 宿主细胞蛋白NPM1在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 4.1.2 载体和主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 干扰npm1 表达对PCV2 复制影响 |
| 4.2.2 干扰npm1 表达对PCV2 Cap表达影响 |
| 4.2.3 利用CRISPR/Cas9 系统敲除PK-15中npm1 |
| 4.2.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建 |
| 4.2.5 Cap及截短体真核表达载体的构建 |
| 4.2.6 GST-pull down检测Cap及其截短体与NPM1 的互作 |
| 4.2.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株的构建与鉴定 |
| 4.2.8 荧光定量PCR检测PCV2 突变毒株的复制水平 |
| 4.2.9 荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 干扰npm1对Cap表达和PCV2 DNA复制影响 |
| 4.3.2 npm1敲除的 PK-15 建立与鉴定 |
| 4.3.3 GST-pull down 检测 Cap、NPM1 以及 STAT5 之间的互作 |
| 4.3.4 NPM1及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.5 Cap及截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 4.3.6 GST-pull down确定NPM1与Cap互作区域 |
| 4.3.7 NPM1 结合活性缺失的PCV2 突变毒株构建与鉴定 |
| 4.3.8 PCV2 突变毒株PCV2-Nm A复制水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 宿主细胞蛋白DNAJB6在PCV2 复制过程中作用及机制 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞、病毒及菌株 |
| 5.1.2 载体和主要试剂 |
| 5.1.3 仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 荧光定量PCR检测PCV2 拷贝数 |
| 5.2.2 western blotting检测DNAJB6和Cap的表达 |
| 5.2.3 间接免疫荧光检测Cap及 DNAJB6 的定位情况 |
| 5.2.4 免疫共沉淀检测Cap与 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.5 DNAJB6及截短体原核表达载体的构建 |
| 5.2.6 Cap截短体真核表达载体的构建 |
| 5.2.7 DNAJB6突变体真核表达载体的构建 |
| 5.2.8 DNAJB6及截短体原核表达及纯化鉴定 |
| 5.2.9 GST-pull down检测Cap及 DNAJB6 的互作 |
| 5.2.10 激光共聚焦检测PCV2及PCV2 Cap诱导的自噬小体 |
| 5.2.11 相对荧光定量PCR检测DNAJB6的m RNA水平 |
| 5.2.12 利用si RNA干扰atg5 的表达 |
| 5.2.13 抑制试验 |
| 5.2.14 数据分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCV2 感染上调PK-15中DNAJB6 的表达 |
| 5.3.2 DNAJB6与PCV2 Cap共定位 |
| 5.3.3 DNAJB6与PCV2 Cap的互作 |
| 5.3.4 DNAJB6全长及截短体原核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.5 Cap截短体真核表达载体的构建与鉴定 |
| 5.3.6 鉴定DNAJB6与Cap的互作区域 |
| 5.3.7 dnajb6敲除的 PK-15 细胞鉴定 |
| 5.3.8 dnajb6敲除抑制自噬小体的形成和病毒复制 |
| 5.3.9 DNAJB6过表达促进自噬体的形成和病毒复制 |
| 5.3.10 DNAJB6与Cap的互作促进自噬体的形成 |
| 5.3.11 DNAJB6与Cap的互作通过增强自噬促进PCV2 复制 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）SMYD3基因在肾细胞癌中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 SMYD3在肾细胞癌组织中的表达及意义 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SMYD3在肾癌细胞中的功能研究 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SMYD3通过EGFR调节RCC机制的研究 |
| 实验材料及方法 |
| 实验结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 |
| 1. SMYD3蛋白研究现状 |
| 2 本文的研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附件 |
（4）人参皂苷及融合毒素的生物活性研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一篇 人参皂苷的化学成分及生物活性研究 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 二氢类天然产物的研究进展 |
| 1.1.1 二氢类天然产物的化学研究 |
| 1.1.2 二氢类天然产物的生物活性研究 |
| 1.2 人参皂苷的结构修饰研究进展 |
| 1.2.1 降解反应 |
| 1.2.2 对C-17 位侧链的修饰 |
| 1.2.3 取代反应 |
| 1.2.4 开环反应 |
| 1.3 天然产物小分子减毒的研究进展 |
| 1.3.1 对顺铂毒副作用的减毒作用 |
| 1.3.2 对环磷酰胺副作用的减毒作用 |
| 1.4 立题依据与研究思路 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究思路 |
| 1.5 本文拟解决的科学问题 |
| 第2章 人参皂苷(元)化学成分、结构修饰及生物活性研究 |
| 2.1 林下山参“珍珠疙瘩”化学成分及生物活性研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 小结与讨论 |
| 2.2 拟人参皂苷 12-酮-F11的分离及生物活性研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 小结与讨论 |
| 2.3 人参皂苷(元)的结构修饰研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 结构解析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 人参皂苷Rh_2对顺铂诱导肾毒性的保护作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 药品与试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 肾损伤疾病模型的建立及药物评价 |
| 3.2.2 肿瘤模型的建立及药物评价 |
| 3.2.3 数据分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 对肾脏功能的保护作用 |
| 3.3.2 对氧化应激的影响 |
| 3.3.3 对肾脏组织病理学损伤的影响 |
| 3.3.4 对炎症反应的影响 |
| 3.3.5 对肾小管细胞凋亡的影响 |
| 3.3.6 对caspase介导的信号通路的调节作用 |
| 3.3.7 抗肾损伤靶点预测 |
| 3.3.8 抗肾损伤的代谢组学分析 |
| 3.3.9 联合给药的抗肿瘤药效学研究 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第4章 人参皂苷Rh_2及衍生物的免疫调节和抗肿瘤作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品与试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫抑制模型的建立及药物评价 |
| 4.2.2 荷瘤小鼠模型的建立及药物抗肿瘤活性评价 |
| 4.2.3 数据分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 对免疫功能的调节作用 |
| 4.3.2 抗肿瘤活性研究 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第二篇 融合毒素的构建及靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究 |
| 第5章 重组人表皮生长因子融合毒素的构建 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 试剂与耗材 |
| 5.1.2 仪器 |
| 5.1.3 主要载体与宿主菌 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 质粒构建 |
| 5.2.2 酵母蛋白表达系统的构建 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 重组质粒的鉴定 |
| 5.3.2 重组蛋白的鉴定 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 融合毒素靶向治疗头颈部鳞状细胞癌的研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 试剂与耗材 |
| 6.1.3 仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 药物体外功能试验 |
| 6.2.2 药物体内功能试验 |
| 6.2.3 数据分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 EGFR单靶点药物体外功能分析 |
| 6.3.2 EGFR单靶点药物体内功能分析 |
| 6.3.3 双特异性药物体外功能分析 |
| 6.3.4 双特异性药物体内功能分析 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第7章 总结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）METTL14介导的m6A修饰在HTLV-1致病过程中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 HTLV-1病毒及相关疾病 |
| 1.2 HTLV-1病毒结构及相关蛋白 |
| 1.2.1 Tax蛋白结构与功能 |
| 1.2.2 HBZ结构与功能 |
| 1.2.3 Rex结构与功能 |
| 1.2.4 p12/p8结构与功能 |
| 1.2.5 p13结构与功能 |
| 1.2.6 p30结构与功能 |
| 1.3 HTLV-1病毒的传播方式及治疗手段 |
| 1.3.1 化学治疗 |
| 1.3.2 抗病毒治疗 |
| 1.3.3 免疫疗法 |
| 1.3.4 干细胞移植 |
| 1.4 RNAm6A修饰 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第2章 HTLV-1 感染细胞株中m6A修饰水平及其相关基因检测 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 质粒 |
| 2.1.4 主要试剂与耗材 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与冻存 |
| 2.2.2 RNA提取 |
| 2.2.3 总RNAm6A含量测定 |
| 2.2.4 plko.1-puro-shMETTL14 载体构建 |
| 2.2.5 shMETTL14 稳定株构建 |
| 2.2.6 细胞总蛋白提取与western blot检测 |
| 2.2.6.1 细胞总蛋白提取 |
| 2.2.6.2 Western blot |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 小提质粒 |
| 2.2.9 大提质粒 |
| 2.2.10 质粒转染(贴壁细胞) |
| 2.2.11 统计学处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 在ATL细胞中m6A修饰水平异常 |
| 2.3.2 METTL14在HTLV-1 感染细胞株中高表达 |
| 2.3.3 沉默METTL14 抑制ATL细胞株中m6A修饰水平 |
| 2.4 结果讨论与分析 |
| 第3章 METTL14在HTLV-1 感染细胞中过表达的分子机制 |
| 3.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 菌株 |
| 3.1.3 质粒 |
| 3.1.4 主要试剂与耗材 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养与冻存 |
| 3.2.2 RNA提取 |
| 3.2.3 细胞总蛋白提取与western blot |
| 3.2.4 实时荧光定量PCR |
| 3.2.5 PCR反应及琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.6 小提质粒 |
| 3.2.7 大提质粒 |
| 3.2.8 质粒转染(贴壁细胞) |
| 3.2.9 质粒转染(悬浮细胞) |
| 3.2.10 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 HTLV-1 病毒影响METTL14 表达 |
| 3.3.2 Tax及 p30对METTL14 表达的影响 |
| 3.3.3 HBZ对 METTL14 表达的影响 |
| 3.3.4 HBZ通过TGF-β影响METTL14 表达 |
| 3.4 结果讨论与分析 |
| 第4章 METTL14对ATL细胞增殖的影响 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 细胞株 |
| 4.1.2 菌株 |
| 4.1.3 质粒 |
| 4.1.4 主要试剂与耗材 |
| 4.1.5 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养与冻存 |
| 4.2.2 RNA提取 |
| 4.2.3 plko.1-puro-shMETTL14 载体构建 |
| 4.2.4 shMETTL14 稳定株构建 |
| 4.2.5 oeMETTL14 稳定株构建 |
| 4.2.6 细胞总蛋白提取与western blot |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR |
| 4.2.8 小提质粒 |
| 4.2.9 大提质粒 |
| 4.2.10 质粒转染(贴壁细胞) |
| 4.2.11 细胞活力检测 |
| 4.2.12 动物实验 |
| 4.2.13 苏木精-伊红染色法 |
| 4.2.14 统计学处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 沉默METTL14 抑制ATL细胞增殖 |
| 4.3.2 沉默METTL14 抑制ATL细胞体内肿瘤形成 |
| 4.3.3 过表达METTL14 促进ATL发生 |
| 4.4 结果讨论与分析 |
| 第5章 METTL14 通过m6A修饰调控p21 表达促进ATL发生 |
| 5.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 主要试剂与耗材 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养与冻存 |
| 5.2.2 RNA提取 |
| 5.2.3 sh-p21稳定株构建 |
| 5.2.4 细胞总蛋白提取与western-blot |
| 5.2.5 实时荧光定量PCR |
| 5.2.6 细胞活力检测 |
| 5.2.7 mRNA纯化 |
| 5.2.8 m6A特异性qPCR |
| 5.2.9 统计学处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 METTL14 通过介导m6A修饰调控p21 表达 |
| 5.3.2 p21影响ATL细胞的增殖 |
| 5.4 结果讨论与分析 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果 |
（6）青藏高原斑头雁与禽流感病毒的时空关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 AIV的研究进展 |
| 1.2.1 AIV基因组及编码蛋白的功能 |
| 1.3 候鸟对AIV的持续存在和不断传播具有重要作用 |
| 1.3.1 候鸟对H5N1亚型HPAIV传播的作用 |
| 1.3.2 候鸟对H5N6亚型HPAIV传播的作用 |
| 1.3.3 候鸟对H5N8亚型HPAIV传播的作用 |
| 1.3.4 野鸟与H7N9亚型AIV |
| 1.4 青藏高原候鸟及禽流感疫情发生情况 |
| 1.5 斑头雁在AIV传播中具有重要作用 |
| 1.5.1 斑头雁可携带HPAIV进行迁徙 |
| 1.5.2 “中亚候鸟迁徙通道”上斑头雁的完整迁徙路线 |
| 1.5.3 斑头雁是AIV的易感物种 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 1.7 本研究的创新点 |
| 2 青藏高原斑头雁等候鸟禽流感病毒的监测研究 |
| 2.1 实验材料和实验仪器 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 实验试剂及配方 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 鸡胚及鸡红细胞 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集、运输、保存与实验室处理 |
| 2.2.2 病毒的分离与增殖 |
| 2.2.3 红细胞凝集试验(HA试验) |
| 2.2.4 反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)试验 |
| 2.2.5 血凝素(HA)亚型鉴定 |
| 2.2.6 神经氨酸酶(NA)亚型鉴定 |
| 2.3 本章结果 |
| 2.3.1 病毒分离结果 |
| 2.3.2 病毒亚型鉴定结果 |
| 2.4 本章讨论 |
| 2.4.1 青藏高原AIV时间分布特点 |
| 2.4.2 青藏高原AIV空间分布特点 |
| 2.4.3 青藏高原AIV的种类分布特点 |
| 2.4.4 斑头雁对AIV易感,可作为青藏高原AIV的指示物种 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 青藏高原代表性分离株的遗传进化分析 |
| 3.1 实验材料及实验仪器 |
| 3.1.1 实验毒株 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 所用引物序列 |
| 3.2.2 RT-PCR扩增目的条带 |
| 3.2.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.2.4 PCR回收产物鉴定 |
| 3.2.5 连接 |
| 3.2.6 转化 |
| 3.2.7 重组质粒提取 |
| 3.2.8 重组质粒鉴定 |
| 3.2.9 测序与分析 |
| 3.2.10 序列拼接 |
| 3.2.11 同源性比较 |
| 3.2.12 遗传进化分析 |
| 3.3 本章结果 |
| 3.3.1 同源性比较结果 |
| 3.3.2 遗传进化树 |
| 3.3.3 HA蛋白裂解位点 |
| 3.3.4 潜在糖基化位点分析 |
| 3.3.5 HA蛋白受体结合位点 |
| 3.4 本章讨论 |
| 3.4.1 PB2基因的遗传进化分析 |
| 3.4.2 PB1基因的遗传进化分析 |
| 3.4.3 PA基因的遗传进化分析 |
| 3.4.4 H1基因的遗传进化分析 |
| 3.4.5 H3基因的遗传进化分析 |
| 3.4.6 H4基因的遗传进化分析 |
| 3.4.7 H5基因的遗传进化分析 |
| 3.4.8 H6基因的遗传进化分析 |
| 3.4.9 H13基因的遗传进化分析 |
| 3.4.10 NP基因的遗传进化分析 |
| 3.4.11 N1基因的遗传进化分析 |
| 3.4.12 N6基因的遗传进化分析 |
| 3.4.13 N8基因的遗传进化分析 |
| 3.4.14 M基因的遗传进化分析 |
| 3.4.15 NS基因的遗传进化分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 斑头雁与青藏高原禽流感病毒的时空分布相关性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 病毒基因MCC树构建 |
| 4.2.2 tMRCA时间计算 |
| 4.2.3 谱系地理发生学分析 |
| 4.3 本章结果 |
| 4.3.1 MCC树构建 |
| 4.3.2 H5N1亚型HPAIV的tMRCA |
| 4.3.3 H5N8亚型HPAIV的tMRCA |
| 4.3.4 谱系地理发生学分析 |
| 4.4 本章讨论 |
| 4.4.1 斑头雁与H5N1亚型HPAIV的时空分布相关性 |
| 4.4.2 斑头雁与H5N8亚型HPAIV的时空分布相关性 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 同源性比较结果 |
| 附录B 遗传进化树 |
| 附录C 基因MCC树 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）PRRSV nsp2、nsp10、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18、IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 国内外研究进展 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 PRRSV nsp2、nsp10与宿主细胞蛋白DDX18相互作用及其生物学意义的分析 |
| 1.3.2 PRRSV nsp11单克隆抗体的制备 |
| 1.3.3 与PRRSV nsp11相互作用的宿主蛋白的筛选 |
| 1.3.4 PRRSV nsp11与宿主细胞蛋白IRAK1相互作用的分析及IRAK1调控病毒复制的分子机制 |
| 1.4 研究目标 |
| 第二章 PRRSV nsp2、nsp10与宿主细胞蛋白DDX18的相互作用及其生物学意义 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 宿主细胞蛋白DDX18的扩增 |
| 2.3.2 免疫共沉淀(Co-IP)验证nsp2、nsp10与DDX18的相互作用 |
| 2.3.3 nsp2、nsp10与DDX18相互作用区域的确定 |
| 2.3.4 激光共聚焦验证nsp2、nsp10与DDX18的相互作用 |
| 2.3.5 沉默DDX18基因对PRRSV复制和增殖的影响 |
| 2.3.6 过表达DDX18对PRRSV复制和增殖的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PRRSV nsp11与宿主细胞蛋白IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 nsp11单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.3.2 nsp11与宿主细胞蛋白互作的筛选 |
| 3.3.3 质谱分析鉴定差异条带 |
| 3.3.4 宿主细胞蛋白IRAK1基因的扩增 |
| 3.3.5 免疫共沉淀(Co-IP)验证nsp11与IRAK1的相互作用 |
| 3.3.6 激光共聚焦验证nsp11与宿主细胞蛋白IRAK1的相互作用 |
| 3.3.7 沉默宿主细胞IRAK1基因对PRRSV复制和增殖的影响 |
| 3.3.8 过表达IRAK1对PRRSV复制和增殖的影响 |
| 3.3.9 PRRSV感染对IRAK1表达的影响 |
| 3.3.10 mml-miR-146a可以抑制IRAK1的表达 |
| 3.3.11 PRRSV通过上调mm1-miR-146a而抑制IRAK1的表达 |
| 3.3.12 下调IRAK1影响IRF7的表达 |
| 3.3.13 下调IRAKI抑制IFN-β的表达 |
| 3.3.14 mm1-miR-146a对PRRSV复制的影响 |
| 3.3.15 mm1-miR-146a对RvJXwn-BS2-Mut复制影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 第五章 创新点 |
| 第六章 文献综述 |
| 6.1 白介素-1受体相关激酶(IRAKs)的功能域 |
| 6.2 IRAK1的生物学功能 |
| 6.3 IRAK2的生物学功能 |
| 6.4 IRAK-M的生物学功能 |
| 6.5 IRAK4的生物学功能 |
| 6.6 MicroRNA-146a与IRAKs |
| 6.7 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）利用牛乳腺生物反应器表达重组人胆盐激活酯酶的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 实验技术路线图 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胆盐激活酯酶的结构及生理生化特点 |
| 1.1.1 胆盐激活酯酶基因结构特点 |
| 1.1.2 胆盐激活酯酶蛋白结构特点 |
| 1.1.3 胆盐激活酯酶的糖基化修饰特点 |
| 1.1.4 胆盐激活酯酶的底物特异性 |
| 1.1.5 胆盐激活酯酶的胆盐依赖性及酶稳定性 |
| 1.2 肠道内的胆盐激活酯酶 |
| 1.2.1 肠道内的胆盐激活酯酶的来源 |
| 1.2.2 乳脂的结构特点及其消化吸收 |
| 1.2.3 奶中胆盐激活酯酶的促脂消化作用 |
| 1.2.4 胆盐激活酯酶的抗病菌作用 |
| 1.2.5 胆盐激活酯酶对肠道菌群的调节作用 |
| 1.2.6 胆盐激活酯酶在固有免疫调节方面的潜在作用 |
| 1.3 胆盐激活酯酶在其他组织中的表达及病理涉及 |
| 1.3.1 胆盐激活酯酶与脂代谢及粥样动脉硬化 |
| 1.3.2 胆盐激活酯酶在血小板中的表达与血栓的调节 |
| 1.3.3 胆盐激活酯酶与炎症 |
| 1.3.4 胆盐激活酯酶多态性与疾病 |
| 1.4 胆盐激活酯酶转基因表达、纯化及应用进展 |
| 1.4.1 人胆盐激活酯酶转基因研究进展 |
| 1.4.2 人胆盐激活酯酶纯化方法研究进展 |
| 1.4.3 重组胆盐激活酯酶产品临床试验进展 |
| 1.5 总结 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 实验动物和细胞系 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要溶液 |
| 2.1.5 实验仪器及耗材 |
| 2.1.6 实验分析软件 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态的制备 |
| 2.2.2 质粒提取 |
| 2.2.3 BAC的提取 |
| 2.2.4 组织基因组提取 |
| 2.2.5 组织RNA提取 |
| 2.2.6 DNA片段的连接反应 |
| 2.2.7 常规的酶切体系 |
| 2.2.8 重组质粒Cracking的快速鉴定法 |
| 2.2.9 PCR反应条件及体系 |
| 2.2.10 RNA的反转录 |
| 2.2.11 实时定量PCR测定转基因拷贝数 |
| 2.2.12 Southern blot |
| 2.2.13 蛋白浓度测定 |
| 2.2.14 Western blot |
| 2.2.15 鼠奶采集及处理 |
| 2.2.16 转基因小鼠的制备 |
| 2.2.17 转基因克隆牛的制备 |
| 2.2.18 激素诱导泌乳及正常泌乳 |
| 2.2.19 肝素凝胶色谱 |
| 2.2.20 凝胶过滤色谱 |
| 2.2.21 高效液相色谱测定蛋白纯度 |
| 2.2.22 重组人胆盐激活酯酶理化性质分析 |
| 2.2.23 酶联免疫法测定BSSL含量 |
| 2.2.24 放射性标记法测定人胆盐激活酯酶活性 |
| 2.2.25 重组人胆盐激活酯酶胆盐依赖性分析 |
| 2.2.26 重组人胆盐激活酯酶热稳定性分析 |
| 2.2.27 重组人胆盐激活酯酶pH稳定性分析 |
| 2.2.28 重组人胆盐激活酯酶胰蛋白酶稳定性分析 |
| 2.2.29 重组人胆盐激活酯酶与小分子的互作分析 |
| 第三章 利用BAC载体在小鼠乳腺中表达人胆盐激活酯酶 |
| 3.1 人胆盐激活酯酶BAC表达载体的构建及鉴定 |
| 3.1.1 将筛选基因Neo插入到BSSL基因下游 |
| 3.1.2 利用打靶载体抓捕BSSL-Neo基因 |
| 3.1.3 利用打靶载体将BSSL-Neo基因替换掉hLF基因 |
| 3.2 转基因小鼠的制备 |
| 3.3 胆盐激活酯酶小鼠模型鉴定 |
| 3.3.1 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠PCR鉴定 |
| 3.3.2 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠Southern blot鉴定 |
| 3.3.3 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠拷贝数鉴定 |
| 3.3.4 pBAC-hLF-hBSSL-Neo转基因阳性小鼠的传代情况 |
| 3.3.5 RT-PCR鉴定转基因小鼠人BSSLmRNA表达 |
| 3.3.6 Western blot鉴定rhBSSL在转基因小鼠奶中的表达 |
| 3.4 重组人胆盐激活酯酶的定量检测与活性评价 |
| 3.5 重组人胆盐激活酯酶对幼鼠生长和脂代谢的影响 |
| 3.6 结果分析与讨论 |
| 第四章 利用BAC载体在牛乳腺中表达人胆盐激活酯酶 |
| 4.1 重组人胆盐激活酯酶转基因牛的制备 |
| 4.2 重组人胆盐激活酯酶转基因牛的鉴定 |
| 4.2.1 pBAC-hLF-hBSSL转基因牛的分子鉴定 |
| 4.2.2 转基因牛的血生化和血常规分析 |
| 4.2.3 转基因牛的传代情况 |
| 4.3 rhBSSL在转基因牛乳中的表达与纯化 |
| 4.3.1 rhBSSL转基因牛的催乳及泌乳 |
| 4.3.2 目的蛋白在转基因牛奶中的表达鉴定 |
| 4.3.3 从转基因牛乳中纯化rhBSSL |
| 4.3.4 重组人胆盐激活酯酶蛋白回收率分析 |
| 4.4 rhBSSL的理化性质分析 |
| 4.4.1 重组人胆盐激活酯酶分子量测定 |
| 4.4.2 重组人胆盐激活酯酶N端氨基酸分析 |
| 4.4.3 重组人胆盐激活酯酶等电点分析 |
| 4.4.4 重组人胆盐激活酯酶活性分析 |
| 4.4.5 重组人胆盐激活酯酶N-糖基化位点分析 |
| 4.4.6 rhBSSL的胆盐依赖性及稳定性分析 |
| 4.4.7 rhBSSL与小分子的互作研究 |
| 4.5 结果分析与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1. 人胆盐激活酯酶基因及氨基酸序列 |
| 附录2. 重组人胆盐激活酯酶N-端序列测试图谱 |
| 附录3. 天然人胆盐激活酯酶N-端序列测试图谱 |
| 附录4. 重组人胆盐激活酯酶氨基酸组成摩尔百分比 |
| 附录5. 天然人胆盐激活酯酶氨基酸组成摩尔百分比 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）新型Vif小分子抑制剂的筛选及HIV-1适应性在疾病进程中变化规律的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HIV-1 及抗艾滋病药物的研究现状简介 |
| 1.1.1 HIV-1 简介 |
| 1.1.2 抗艾滋病药物简述 |
| 1.2 A3G-VIF-E3 复合物的研究现状简介 |
| 1.2.1 APOBEC3G 蛋白与 Vif 蛋白的相互作用 |
| 1.2.2 HIV-1 Vif 的功能 |
| 1.2.3 以 A3G-Vif-E3 复合物为靶点的抗病毒药物的研究现状 |
| 1.3 艾滋病疾病进程简介 |
| 1.3.1 HIV-1 感染的几个阶段 |
| 1.3.2 艾滋病疾病进程中的几个关键时间点 |
| 1.4 HIV-1 复制适应性的定义和意义 |
| 1.4.1 复制适应性的定义及与疾病发展的关系 |
| 1.4.2 影响复制适应性的因素 |
| 1.4.3 复制适应性对 HIV-1 传播的影响 |
| 1.5 复制适应性检测方法概述 |
| 1.5.1 病毒培养方式对适应性检测的影响 |
| 1.5.2 病毒来源对适应性检测的影响 |
| 1.5.3 检测手段对适应性检测的影响 |
| 1.5.4 等位基因测序适应性检测法（Parallel Allele-Specific Sequencing Fitness Assay） |
| 1.6 立题依据 |
| 1.6.1 以 Vif 为靶点的抗 HIV-1 小分子抑制剂的发现和结构优化 |
| 1.6.2 HIV-1 适应性在疾病进程中变化规律的研究 |
| 第二章 以 VIF 为靶点的抗 HIV-1 小分子抑制剂的发现和结构优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与常规试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 方法与试剂 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 Vif 小分抑制剂的初步筛选 |
| 2.2.2 VEC-5 作用机制的研究 |
| 2.2.3 以 Vif 为靶点的小分子抑制剂的结构优化及构效关系研究 |
| 第三章 HIV-1 适应性在疾病进程中变化规律的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 仪器与设备 |
| 3.1.2 方法与相关试剂 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 研究对象的选择及病毒生长曲线的初步测定 |
| 3.2.2 PFA 法测定 T/F 与 6mo 病毒的相对适应性 |
| 3.2.3 PFA 法测定 T/F 与慢性感染期病毒的复制适应性 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（10）博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的蛋白质组学和乙酰化修饰组学研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的基于双向凝胶电泳-质谱技术的蛋白质组学研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的定量蛋白质组学研究及组蛋白乙酰化修饰鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的乙酰化蛋白质组学研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 新型修饰组蛋白巴豆酰化鉴定初探 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文及参加会议 |
四、BIV在人源细胞MT-4中的活性研究（论文参考文献）
- [1]基于CRISPR全基因组筛选探究家蚕对污染因子氟/镉的响应机制[D]. 刘越. 西南大学, 2021(01)
- [2]宿主细胞蛋白STAT5、NPM1和DNAJB6在PCV2复制过程中作用及机制研究[D]. 韩聪. 西北农林科技大学, 2020
- [3]SMYD3基因在肾细胞癌中的作用及机制研究[D]. 项平. 山东大学, 2020(04)
- [4]人参皂苷及融合毒素的生物活性研究[D]. 祁增. 吉林大学, 2020(08)
- [5]METTL14介导的m6A修饰在HTLV-1致病过程中的作用与机制研究[D]. 吴芳. 华侨大学, 2020(01)
- [6]青藏高原斑头雁与禽流感病毒的时空关系研究[D]. 孙静. 东北林业大学, 2020
- [7]PRRSV nsp2、nsp10、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18、IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制[D]. 靳换. 中国农业大学, 2017(02)
- [8]利用牛乳腺生物反应器表达重组人胆盐激活酯酶的研究[D]. 王宇航. 中国农业大学, 2016(07)
- [9]新型Vif小分子抑制剂的筛选及HIV-1适应性在疾病进程中变化规律的研究[D]. 左陶. 吉林大学, 2014(03)
- [10]博尔纳病毒感染人少突胶质细胞的蛋白质组学和乙酰化修饰组学研究[D]. 刘霞. 重庆医科大学, 2014(02)