一、番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析（论文文献综述）
彭斌[1]（2019）在《中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究》文中研究指明葫芦科作物是我国重要的经济作物。在中国28种以上病毒侵染为害葫芦科作物,每年可造成高达300亿元人民币的损失。随着全球气候变暖,国际贸易交流频繁,种植地域的扩张以及种植模式的多样化,侵染葫芦科作物的病毒病种类发生报道也逐年增加。本研究调查全国西瓜和甜瓜的主要产区的病毒病的发生情况并采集疑似病毒样本应用二代测序技术（next-generation sequencing,NGS）结合常规检测方法鉴定和检测病毒种类;鉴定了2种葫芦科作物上新发生的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒;鉴定了1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）新病毒;对4种常见的病毒进行系统进化和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分析,本文取得如下主要结果:（1）明确了中国葫芦科作物病毒种类与分布。调查了华南沿海冬季产区,长江以南丘陵产区,华中平原优势产区,西南坡地和山区种植区以及西北旱地优势产区为代表的9个省份,31个区县,52块种植地块的以西瓜和甜瓜为主的葫芦科作物上病毒病发生情况。共采集了288份疑似病毒样本,其中西瓜109份,甜瓜95份,南瓜57份,其他葫芦作物共27份。初步比较了小RNA测序（Small RNA sequencing,sRNA-seq）和去核糖体RNA测序（Ribo-minus RNA sequencing,rmRNA-seq）技术应用于鉴定和检测病毒的差异。应用NGS测序技术和常规检测技术检测到12个属22种病毒,其中已知病毒种21个,新病毒种1种。以病毒核酸类型分类比较,正单链RNA病毒（Positive-sense single-stranded RNA virus,+ssRNA virus）占优;以病毒属分类比较:马铃薯Y病毒属占优;以病毒种分类比较:小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）占优;以田间传播类型分类比较:以蚜虫传播方式占优;以侵染单个样本的病毒数量分类;单个病毒侵染样本数量占优。比较分析了不同葫芦科作物中检出病毒的种类与分布差异。比较分析了不同种植地区病毒发生与分布情况,其中明显差异是华南地区以蓟马传播病毒种类占优,而其他地区均是以蚜虫传播方式占优。（2）明确了小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜畸形花叶病毒的生物学特性和基因组信息。在NGS和RT-PCR鉴定的基础上,测定了小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus）和番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus）的全基因组序列,分析了其基因组特性。ZTMV是一种重组病毒;PLDMV与目前报道的番木瓜株系基因组水平差异较大。通过重组融合方法成功构建了ZTMV和PLDMV侵染性克隆,从多种病毒复合侵染样本中获得2种病毒3个分离物纯化病毒材料并验证了其侵染性和传毒能力。测定了2种病毒4个分离物的寄主范围以及在不同葫芦科作物上的症状表现。（3）发现和鉴定一株马铃薯卷叶病毒属新病毒。我们鉴定了新疆维吾尔自治区阜康市西葫芦上的一株马铃薯卷叶病毒属新病毒命名为小西葫芦蚜传黄化病毒（zucchini aphid-borne yellows virus）。测定该病毒的全长基因组序列5792nt并分析其基因组符合马铃薯卷叶病毒属病毒基因组特性。通过多重比对,系统进化和重组分析明确该病毒由同属的鹰嘴豆褪绿丛矮病毒（chickpea chlorotic stunt virus）与芜菁黄化病毒（turnip yellow virus）,芸苔黄化病毒（brassica yellows virus）进化关系较近的未知病毒重组而来的新病毒。（4）明确了4种常见葫芦科作物病毒的进化特征,发现了一些新类群。基于NGS测序数据获得病毒的近似全长基因组序列用于4种主要病毒系统进化分析。来自本研究的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）全基因组序列遗传多样性不高都属于ⅠB亚组,检测到可能的重配现象;ZYMV的遗传多样性丰富,发现一个区别已报道所有ZYMV分离物的新组,提出ZYMV系统进化可能与地理位置相关性的假设;基于西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）全基因组序列系统进化关系重新规划了病毒群体的系统进化关系;基于番木瓜花叶病毒（papaya ring spot virus）全基因组序列系统进化分析,定义1个PRSV新组,讨论了PRSV系统进化与寄主和地理位置的相关性。基于NGS数据结合生物信息学方法对4种主要病毒基因组的SNP分析。本论文研究通过大量采集以西瓜甜瓜为主的葫芦科病毒病害样本,通过NGS,结合常规检测方法,明确了中国葫芦科作物病毒发生的种类与分布,建立了中国葫芦科病毒组;鉴定了2种新发生病毒、1种病毒新种;分析了4种常见病毒的进化特征,发现了一些类群。这些研究结果,丰富了对中国乃至世界葫芦科病毒发生与分布的认识,有利于病毒病害的防控。
熊越[2]（2018）在《番木瓜畸形花叶病毒（PLDMY）侵染性克隆的高效构建及遗传分析》文中研究说明目前海南番木瓜病毒病防治对象主要为木瓜环斑病毒（PRSV）,但近年来研究发现木瓜畸形花叶病毒（PLDMV）,既能感染非转基因番木瓜,也能感染抗PRSV的转基因番木瓜,而且极大加速 papaya leaf distortion mosaic virus 的传播,因此 papaya leaf distortion mosaic virus是番木瓜生产的新威胁,与PRSV（常见的木瓜环斑病毒）一样都是具有毁灭性的。因此研究PLDMV致病机制及其防治方法意义重大。构建含有荧光标记的PLDMV侵染性克隆是研究PLDMV致病机制及其防治策略的重要工具。本研究在克隆获得PLDMV-DF（海南东方毒源）全长cDNA基础上,利用Gibson组装融合克隆法成功构建由花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的与农杆菌感染相容的pPLDMV病毒表达载体,以及绿色荧光和红色荧光蛋白标记的pPLDMV-GFP、pPLDMV-mCherry病毒表达载体。将这些载体直接转化到根癌农杆菌C58C1中构建成农杆菌工程菌株,通过注射接种番木瓜植株,接种30天时发现有95%的番木瓜幼苗感染了 PLDMV-GFP或PLDMV-mCherry,表现出典型的如野生型PLDMV引起的系统性症状;在荧光显微镜和紫外光照灯下观察,发现受侵染的番木瓜植株叶片、茎和根中可见绿色和红色荧光。经过RT-PCR监测分析,表明PLDMV、PLDMV-GFP和PLDMV-mCherry在番木瓜植株中稳定了 90天以上,并连续传代至第六代以上（30天/代）;同时Western blot分析结果表明GFP、mCherry荧光蛋白在被感染的番木瓜植株中获得了表达。以上这些侵染性克隆尤其是含荧光的侵染性克隆的构建将有助于研究PLDMV致病机制、病毒与宿主互作和病毒运动等方面,还可构建弱毒株系用于番木瓜抗PLDMV的研究。这是一种新的克隆策略,基于Gibson组装融合克隆法和直接的根杆癌转化,与传统方法相比,这种构建植物病毒全长侵染性cDNA克隆方法具有简单、高效、快速等优点。本研究通过前人实验的基础之上构建（PLDMV-DF）cDNA全长侵染性克隆及其插入外源（GFP、mCherry）报告基因的病毒表达载体,所设立的这些实验不仅为研究番木瓜畸形花叶病毒PLDMV的病理、分子机制、防治PLDMV新策略等方面奠定理论基础和实验依据,而且亦为多种其它病毒属（马铃薯Y病毒）的侵染性克隆构建方法及相关应用提供了新的借鉴和参考。
赵辉,贺萍萍,郭静远,孔华,郭安平[3]（2017）在《应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展》文中指出植物病毒几乎都是RNA病毒,所占比例达93.9%,以番木瓜环斑病毒（papaya ringspot virus,PRSV）和番木瓜畸叶嵌纹病毒（papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）为代表的RNA病毒是番木瓜生产上的最大限制因子,不抗病的品种几乎绝产。在物理和化学防治措施效果不佳与抗性品种缺乏的情况下,现代生物技术方法被引入番木瓜的防治工作,并取得可喜的成绩。迄今为止,被实际应用的番木瓜抗病毒基因都是来自其病毒本身的基因,这类转基因番木瓜的抗病行为主要是由RNA所诱导的后转录基因沉默（RNAmediated post-transcriptional gene silencing,PTGS）所致,亦即RNA干扰。本研究综述了现代生物技术在防治番木瓜RNA病毒上的主要成果和问题,并展望了利用最新CRISPR技术防治番木瓜RNA病毒的策略。
赵辉[4]（2016）在《利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质》文中研究表明番木瓜（Carica papaya）位居世界最有营养价值十大水果首位,是热带地区重要的消费和出口水果。番木瓜环斑病毒病（papaya ringspot virus;PRSV）是番木瓜生产上最大的限制因子,危害严重时可导致大幅度减产甚至绝收。海南是我国最大番木瓜种植区,目前生产上还没有表现较好的抗番木瓜环斑病毒病品种,番木瓜产业受到该病的严重威胁。由于缺少抗病种质,常规育种方法不能培育出抗病毒品种;且此种病害尚无有效药剂治理;因而采用转基因策略培育抗病品种是解决番木瓜病毒病危害经济有效的最主要途径之一。PRSV存在地理株系,不同地域的病毒株系有差异,已有的研究发现,转夏威夷或台湾PRSV外壳蛋白基因的品种只对夏威夷或台湾的病毒株系具有较好的抗性。因而尽管转基因番木瓜“Rainbow”于1998年就在美国通过安全性评价被批准商业化,是全球商业化应用较早的转基因农作物之一,但它只对夏威夷的PRSV株系有抗性,而不能为其他地区所推广应用。迄今为止,被实际生产上应用的番木瓜抗病毒基因都是来自其病毒本身的基因,这类转基因番木瓜的抗病行为是由RNA所诱导的转录后基因沉默（RNA-mediated post-transcriptional gene silencing;PTGS）后所致,亦即RNA干扰。RNAi（反向重复双链RNA分子）被认为是最适宜的RNA沉默启动者,一般来说转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒抗性只有20%左右,但是转入能够产生dsRNA的反向重复IR序列的植物对病毒的抗性却高达90%。本研究在对海南PRSV株系进行多样性分析和对关键基因保守序列分析的基础上通过分析不同PRSV株系关键基因的保守序列并采用RNAi发夹结构高效抗病设计策略进行三类载体构建,通过优化后的遗传转化体系进行转化,获得3000多个转化体,从中分子鉴定、筛选出一批高效广谱性抗病株系已进入转基因生物安全评价程序,为尽快培育出抗病优质高产新品种打下了良好的基础。主要研究结果如下:1、通过调查、采样、PCR鉴定、测序、聚类分析等工作,对海南的PRSV病毒株系的种类与分布,在生理水平和分子水平上进行了研究。（1）确认了早期发现的两类海南PRSV类型（Hainan Ⅱ,and Ⅲ）;（2）发现和报道了一个新的PRSV类型（Hainan Ⅰ）;（3）三种类型的PRSV在海南不同种植区间分布不同,Hainan Ⅰ组株系主要分布在三亚,Hainan Ⅱ组株系主要分布在澄迈,HainanⅢ组株系主要分布在文昌和昌江,乐东位于3类株系的交汇处,病毒株系最为复杂,变异多样;（4）对海南PRSV种类与分布的调查和接种鉴定结果,证实了台湾和夏威夷的转基因番木瓜不抗海南的PRSV株系;（5）由于受达尔文和非达尔文选择的极大影响,海南PRSV具有较高的变异率,需要在育种中加以考虑。2、根据前人番木瓜抗病转基因育种经验,选择PRSV病毒重要功能基因 CP、Nib、Hc-Pro为研究对象,针对这些基因挑选海南各地区有代表性的株系进行测序,将测序结果进行生物信息学比对,找到这些基因功能区的保守区域,克隆海南PRSV典型株系关键基因保守区域;利用CP、RPa Hc-Pro基因功能区的保守区域构建高效RNAi干扰载体转化番木瓜,获得批量转基因株系;该设计结合了分别转化CP、RP、Hc-Pro基因使番木瓜获得抗PRSV的成功经验和不足,并且将RNAi的设计理念引入番木瓜抗病基因工程育种中。3、在分子水平上对转基因番木瓜株系进行鉴定;扩繁转基因株系,在实验室和温室条件下对转基因株系的抗病能力与抗病范围进行评估。4、下一步工作重点是进一步开展转基因番木瓜株系及第三代抗性植株的抗性及抗性稳定性评价,完成转基因生物安全评价的相关实验。本论文综合应用病毒学、生物信息学、抗病生理学、分子生物学、转基因遗传育种学等多种技术手段,培养具有高效广谱抗海南PRSV转基因番木瓜新种质,项目的成功将获得具有我国自主知识产权的、在我国海南及华南地区广谱抗番木瓜环斑病毒的转基因当家品种,将大大推进我国番木瓜产业的发展。
刘芳[5]（2016）在《番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究》文中研究说明番木瓜是重要的热带果蔬之一,影响番木瓜产业的重要限制因子为番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）以及番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）,尤其,近几年发现了 PRSV和PLDMV存在混合感染的现象,且发病率逐年递增,极有可能成为威胁番木瓜产业新的限制因素,因此急需对其混合感染机制作深入研究,本研究所进行的研究内容及取得研究结果如下:1、PRSV/PLDMV混合感染样品中核苷酸序列和氨基酸序列分析:运用RT-PCR和RACE方法从海南陵水采集到的PRSV/PLDMV混合感染的番木瓜病叶中分离到两种病毒（分别命名PRSV-LM和PLDMV-LM,GenBank登录号分别为:KT633943和KT633944）,通过测序获得两种病毒的基因组全长,大小分别为1,0325 bp和1,0153 bp（不包括3’端的polyA）,序列分析表明:PRSV-LM分离物与单感染样品中的PRSV海南分离物Hainan-DF（GenB ank登录号:EF183499）的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高（均为94%）,PLDMV-LM分离物与单感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF（GenBank登录号:JX974555）核苷酸和氨基酸序列相似性最高（分别为99%和97%）。通过系统进化树分析可以看出,PRSV-LM分离物和PLDMV-LM分离物均与海南地区其他PRSV和PLDMV分离物具有亲缘关系。2、PRSV/PLDMV两种病毒单独感染番木瓜的研究:利用酵母同源重组系统,成功构建了适用农杆菌侵染法接种的PRSV-LM和PLDMV-LM的侵染性克隆,经过侵染性测试,结果成功获得了具有侵染能力的PRSV-LM和PLDMV-LM克隆,并且PRSV-LM侵染番木瓜的病症表现要比PLDMV-LM严重。经测序发现,PRSV-LM基因组序列第1825位碱基由A突变为G,但对应氨基酸未发生变化,仍为苏氨酸,PLDMV-LM未发生突变,所以可以进行后续试验。3、PRSV/PLDMV两种病毒之间的相互作用的研究:以同步及非同步接种PRSV-LM和PLDMV-LM到非转基因番木瓜品种蔬罗（solo）上,并运用荧光实时定量PCR监测病毒积累量及增殖动态,结果发现PRSV-LM和PLDMV-LM混合感染的病症介于两种病毒单独感染的之间,且差别不大;而两种病毒积累量变化动态中,发现不同处理下,从接种3周后开始,PRSV-LM积累量总体大于PLDMV-LM,PRSV-LM积累量比较稳定,约在107～108拷贝数之间,而PLDMV-LM病毒积累量在103～108拷贝数之间,波动比较大。同步接种时,PLDMV-LM积累量在103～105拷贝数之间,PRSV-LM积累量高于PLDMV-LM,且增殖情况稳定,非同步接种中先接种PRSV-LM后接种PLDMV-LM时,与同步接种时的情况大致相当,说明侵染能力较强的PRSV-LM在空间及养分等条件的竞争中占优势地位;而先接种PLDMV-LM后接种PRSV-LM时,侵染能力较弱的PLDMV-LM在接种初期比较占优势,对PRSV-LM有类似于交叉保护的作用,到后期PRSV-LM积累量会超过PLDMV-LM,最终,两种病毒会稳定共存于寄主番木瓜中。由此可见,混合感染中的PRSV-LM与PLDMV-LM之间可能有一定的干扰和竞争作用,但两者最后都能稳定共存于田间。以上可作为后续混合感染交互作用研究的基础,用作推测田间可能发病生态及制定正确有效防治措施的参考。
赵光远[6]（2015）在《利用酵母同源重组系统构建PRSV-HN2侵染性克隆及其侵染力分析》文中研究说明番木瓜是一种重要的热带和南亚热带地区经济作物。番木瓜环斑病毒病（Papaya ringspot virus, PRSV）是影响其品质和产量的主要病毒病害,发病率高达90%以上,致使其种植业和相关加工产业的发展受到了极大的制约。目前,在栽培技术上仍然不能通过化学方法进行有效防治,而利用基因技术选育抗病的新品种是防治番木瓜环斑病毒病的有效途经之一。国内外研究人员已先后将PRSV外壳蛋白、复制酶等基因导入番木瓜,从而获得了抗环斑病毒的转基因番木瓜,但研究发现由于各地区PRSV的病毒株存在差异,导致目前已经获得的各种抗PRSV转基因番木瓜在不同种植地区表现出来的抗病能力不稳定且存在抗性差异,这使得通过基因工程技术培育的新品种在生产应用上受到限制。所以,从分子水平上深入解析番木瓜环斑病毒的致病机理,这对寻找更广谱更有效的抗病毒新策略,以及培育具有应用前景的抗病新品种有重要的现实意义。本研究利用RT-PCR技术和快速cDNA末端扩增技术（RACE）,对引起番木瓜环斑病毒病的PRSV海南海口分离物（PRSV-HN2）的基因组cDNA进行了克隆和全序列测定,全长cDNA包含10326nt（不包括3’端的polyA, GenBank登录号为KF791028）,能编码3346个氨基酸。同时对PRSV-HN2基因组核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行了结构和功能分析,与台湾、泰国、印度、巴西、黑西哥、法国和夏威夷等国家和地区的PRSV分离物相比较,其核酸序列相似度达81%-91%,氨基酸相似度为88%-94%。利用大肠杆菌构建基因组较大的Potyvirus属的RNA病毒全长cDNA克隆时,会出现基因组结构（突变及缺失）不稳定的现象。所以在本研究中作者将PRSV-HN2全长基因组分成四个大片段进行克隆,获得了pG-A、pG-B、pG-C、pG-D等4个亚克隆；通过穿梭质粒并利用酵母同源重组系统构建了5种全长cDNA克隆,第一种为包含PRSV-HN2全长的克隆载体,命名为PB-P （pBS70T-PRSV-HN2）;第二种为包含PRSV-HN2全长的表达载体侵染性克隆,命名为PPH （pBIN61-PRSV-HN2）;另外三种克隆为包含PRSV-HN2全长并在其P1蛋白、P3蛋白、Nib蛋白后分别插入酶切位点,构建成含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的表达载体,分别命名为PPHP1G （pBIN61-PRSV-HN2-P1-GFP）、PPHP3G（pBIN61-PRSV-HN2-P3-GFP）与PPHNIBG （pBIN61-PRSV-HN2-NIB-GFP）。PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆通过农杆菌侵染法接种西葫芦和番木瓜,其PPH、PPHP1G、PPHP3G、PPHNIBG的侵染效率达到30%-60%。PRSVHN-2全长cDNA的4个侵染性克隆在接种40天后都表现出系统性侵染,比接种自然病毒的对照组推迟了1周左右表现出病症。病毒与寄主的相互作用是病毒学领域重要的研究课题,而该领域取得的最新的研究进展很大程度上取决于侵染性病毒载体的构建,因此构建PRSV全长cDNA的侵染性克隆,不仅为在分子水平上研究PRSV侵染、遗传变异及发病机制奠定理论基础,而且实验中使用的酵母同源重组系统的快速构建方法也为其它马铃薯Y病毒属病毒侵染克隆构建提供了新的技术方法。
朱静,谭冠林,包改丽,刘芳,李晓静,吴祖建,李凡[7]（2014）在《云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性》文中指出【目的】明确云南省番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）发生情况,并对其进行遗传多样性分析。【方法】利用RT-PCR技术,于2011-2012年对采自云南省昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州、文山州等地的24个番木瓜、南瓜和罗汉果疑似病样进行扩增、测序,对样品中获得的940 bp PRSV部分cp基因及3′端非编码区的序列应用分子生物学软件MEGA 5进行系统发育分析。【结果】从17个样品中检测到了PRSV,检出率为70.8%,表明该病毒在云南的发生较为普遍。云南PRSV不同分离物间的核苷酸序列变异较大,与其他已报道的PRSV分离物之间的基因组3′端核苷酸序列一致性为81.7%-100%。基于PRSV的CP部分氨基酸序列及基因组3′端核苷酸的系统进化分析结果表明,来自亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲的PRSV分离物可以分为2个组,其中第Ⅰ组均为来自中国的分离物,包括了大部分的PRSV云南分离物,第Ⅰ组内分离物间的差异较第Ⅱ组大;第Ⅱ组的分离物来源较为复杂,亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲均有分布。基于PRSV CP部分氨基酸序列构建的系统进化树中,各分离物之间没有明显的地理和寄主相关性,而基于PRSV基因组3′端核苷酸序列构建的系统进化树中,除中国大陆分离物和印度分离物外,其他地区的PRSV在进化上与其地理来源有明显的相关性。【结论】PRSV在云南的昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州和文山州等地都有不同程度发生,且为害寄主植物涉及番木瓜、南瓜及罗汉果,PRSV侵染罗汉果为云南首次发现。云南PRSV分离物的分子变异很大,但是关于PRSV的分子变异是否与其地理分布及症状表现有关,以及P型和W型的分子区分特征还有待进一步研究。
汪倩,谭德冠,吴丽娟,孙雪飘,张家明[8]（2012）在《番木瓜畸形花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析》文中指出从海南乐东的感病番木瓜叶片上提取总RNA,用RT-PCR方法扩增番木瓜环斑病毒（PRSV）外壳蛋白基因组序列。测序结果显示,该环斑病毒外壳蛋白基因扩增片段长867个核苷酸。相似性分析表明,该核苷酸序列与GenBank中报道的47株PRSV和1株畸形花叶病毒核苷酸序列的相似性在62.41%～94.71%之间。运用CLUSTALX和MEGA软件绘制系统进化树,结果表明,番木瓜PRSV病毒大致可分为美洲-澳洲类群和东亚-东南亚类群2大类,后者又可分为SB1、SB2、SB3等3个亚类。乐东毒株和已报到的畸形花叶病毒PaMLV病毒都属于PRSV。不过乐东毒株属于SB1亚类,而PaMLV属于SB2亚类。乐东毒株（JQ318029）和另一海南毒株（HQ424465）属于SB1亚簇,信心指数分别达到89%、83%、96%。不过乐东毒株与越南北部的4种毒株（AF506875、FN808408、AJ875115、U14742）的同源性更高,说明导致乐东畸形花叶病的毒株可能来自越南,而不是由海南本地毒株变异而来。
杨国慧,张仲凯,崔崇士[9]（2007）在《番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析》文中进行了进一步梳理利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒（Papayaring spot virus,PRSV）。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类,并为下一步转基因育种提供抗性基因,采用反转录PCR（RT-PCR）方法扩增了5个分离物的外壳蛋白（coat protein,CP）基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,番木瓜环斑病毒石屏分离物（PRSV-SP）和番木瓜环斑病毒蒙自分离物（PRSV-MZ）的CP基因长873nt,编码290个氨基酸,番木瓜环斑病毒峨山分离物（PRSV-ES）、番木瓜环斑病毒版纳分离物（PRSV-BN）和番木瓜环斑病毒宾川分离物（PRSV-BC）,3个分离物CP基因长867nt,编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。与国内外17个分离物相比,核苷酸序列同源性为89.6%98.7%,氨基酸序列同源性为86.5%99.6%。其中PRSV-SP和来自于越南分离物PRSV-V47无论是核苷酸序列,还是氨基酸序列同源性都达到了最高,而5个分离物与来自于巴西（PRSV-BR）、美国（PRSV-USA）、墨西哥（PRSV-Y）核苷酸序列同源性均低于90%。
卢雅薇[10]（2007）在《番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-HN）全基因组克隆与序列分析》文中研究表明番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus）是国内外番木瓜产区分布最广、为害最严重的病毒之一,其严重危害番木瓜的产量和质量,并降低其商品价值,同时也会危害葫芦科作物。本研究针对引起番术瓜环斑病毒病的一个PRSV海南海口分离物（PRSV—HN）的基因组RNA进行了全序列测定,并对PRSV—HN基因组核苷酸序列及其推导的氮基酸序列进行了结构和功能分析,这为在分子水平上研究PRSV遗传变异、侵染及发病机制奠定理论基础。以病毒RNA为模板反转录合成cDNA,利用保守序列设计引物,将PRSV—HN基因组分段进行PCR扩增,通过目的片段连接、转化、筛选、测序和序列拼接后获得该分离物的编码区序列。利用快速cDNA术端扩增方法（RACE）获得了该分离物完整的5’-非编码区序列。基因组全序列在GenBank中的登录号为:EFl83499。序列分析结果表明:PRSV—HN基因组全序列共10323个核鞑苷酸,5’-和3’-非编码区序列分别为85和209个核苷酸（不包括po1yA尾）,中间为10029个核苷酸的单一开放阅读框架,编码一个3343个氨基酸的多聚蛋白:该蛋白自身催化裂解为10个多肽,相邻多肽问的切割位点顺次为:Y/N,G/G,Q/A,Q/s,Q/G,Q/G, E/G,Q/S和Q/S。将PRSV-HN分离物与目前已报道的12株PRSV全基因组序列进行比较,结果表明,基因组序列核苷酸数目存在一定的差异,为10317bp-10332bp,主要是由在cP基因N端富A区出现了三联体缺失现象。PRSV-HN与12株PRSV的基因组核苷酸全序列同源性为82.3%-89.1%,编码的多聚蛋白氨基酸序列同源性为89.8%-93.1%。5-UTR同源性较低,仅65.9%-87.1%,而3—UTR同源性较高,达到90.8%-96.6%。Pl蛋白是病毒编码蛋白巾变异最大的,氨基酸序列同源性仅为65.4%-80.1%,而HC—Pro、CI及CP同源性较高。拿长氨基酸序列N-J树显示,PRSV分离物问存在三个进化相关簇群,W-W、W-1、HA以及Mex-Vrpo彼此非常相似,成为一个簇群。DEL分离物形成一独立的分支。Thai-1、Thal-2、HN以及来源于台湾的五个分离物（YK,TW-l,TW-2, TW-3,CI）形成一个进化簇。进化树显示,尽管DE1L分离物与美洲分离物更接近,但总体而言美洲分离物与亚洲分离物的分化与地理分布有一定的相关性。另外,进化树分布也显示,病毒的进化方向与P型和W型无明显十目关性。PRSV-HN全长核苷酸序列与Thai-1、Thai-2以及来源于台湾的五个分离物（YS,TW-l,TW-2,TW-3,CI）同源性最高,然而,却仅为88.4%-89.1%;而且,进化树显示,PRSV—HN单独形成一独立的分支。因此,建议将PRSV-HN与Thai-l、Thai-2以及来源于台湾的五个分离物归于不同一株系。将PRSV—HN分离物与部分已报道的PRSV分离物的外壳蛋白氨基酸序列作了比较和进化树分析,结果表明,PRSV- HN与中国株系YS的亲缘性最高。对P3蛋白的研究表明该蛋白内存在跨膜结构,可能与该病毒在寄主细胞内的传播有关。
二、番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 侵染葫芦科作物的病毒种类 |
| 1.3 中国葫芦科作物发生现状 |
| 1.3.1 布尼亚病毒目 |
| 1.3.2 小RNA病毒目 |
| 1.3.3 芜菁黄花叶病毒目 |
| 1.3.4 混合病毒科 |
| 1.3.5 雀麦花叶病毒科 |
| 1.3.6 长线型病毒科 |
| 1.3.7 内生病毒科 |
| 1.3.8 双生病毒科 |
| 1.3.9 黄症病毒科 |
| 1.3.10 双分病毒科 |
| 1.3.11 马铃薯Y病毒科 |
| 1.3.12 番茄丛矮病毒科 |
| 1.3.13 植物杆状病毒科 |
| 1.4 主要葫芦科作物病毒的遗传多样性研究 |
| 1.4.1 番茄斑萎病毒属遗传多样性 |
| 1.4.2 黄瓜花叶病毒遗传多样性 |
| 1.4.3 马铃薯卷叶病毒属遗传多样性 |
| 1.4.4 马铃薯Y病毒属遗传多样性 |
| 1.4.5 甜瓜坏死斑点病毒遗传多样性 |
| 1.5 应用高通量测序技术鉴定植物病毒及遗传变异的研究进展 |
| 1.5.1 应用NGS于植物病毒鉴定的测序方法 |
| 1.5.2 植物病毒组数据分析 |
| 1.5.3 NGS测序应用园艺作物病毒检测和鉴定 |
| 1.6 技术路线与研究目的和意义 |
| 第二章 中国葫芦作物病毒种类与地理分布特点 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病毒样本采集 |
| 2.2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 中国葫芦科作物病毒田间样品采集 |
| 2.3.2 两种不同NGS测序方法的鉴定植物病毒初步比较 |
| 2.3.3 中国葫芦科作物病毒发生种类 |
| 2.3.4 中国主要产区间病毒种类和传毒方式比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜叶畸形花叶病毒侵染性克隆的构建和生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究材料 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ZTMV和 PLDMV田间症状以及VirusDetect组装contig结果 |
| 3.3.2 ZTMV和 PLDMV全基因组特性及系统进化分析 |
| 3.3.3 ZTMV和 PLDMV侵染性克隆构建与生物学鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属病毒的发现鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 病毒材料来源 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 血清学和RT-PCR检测 |
| 4.3.2 NGS测序结果分析 |
| 4.3.3 ZABYV基因组特性 |
| 4.3.4 ZABYV基因组的系统进化和重组分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 中国主要葫芦科作物病毒的系统进化与SNP变异初步分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 NGS数据中获取病毒全基因组序列 |
| 5.2.2 系统进化分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 CMV系统进化分析 |
| 5.3.2 ZYMV的系统进化分析 |
| 5.3.3 WMV的系统进化分析 |
| 5.3.4 PRSV系统进化分析 |
| 5.3.5 CMV,ZYMV,WMV和 PRSV的 SNP分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论及展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 下一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 葫芦科作物病毒名录 |
| 附录 Ⅱ 本研究用于RT-PCR检测于鉴定的引物 |
| 附录 Ⅲ 采样地理信息表 |
| 附录 Ⅳ 病毒样本信息以及检测结果 |
| 附录 Ⅴ 作者简介 |
| 附录 Ⅵ 研究生期间已发表论文 |
| 致谢 |
（2）番木瓜畸形花叶病毒（PLDMY）侵染性克隆的高效构建及遗传分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1、文献综述 |
| 1.1 番木瓜畸形花叶病毒(PLDMV) |
| 1.1.1 PLDMV的发现 |
| 1.1.2 PLDMV的病害特征与传播方式 |
| 1.1.3 PLDMV的感染寄主与分型 |
| 1.1.4 PLDMV的基因结构及超微特征 |
| 1.2 利用弱毒株交叉保护作用防治病毒病 |
| 1.2.1 交叉保护原理及应用 |
| 1.2.2 病毒弱毒株的获得途径 |
| 1.2.3 用现代分子生物技术获得工程植株 |
| 1.3 侵染性克隆载体的构建及应用 |
| 1.3.1 病毒全长cDNA侵染性克隆研究 |
| 1.4 病毒侵染性克隆接种方法 |
| 1.4.1 基因枪法接种 |
| 1.4.2 机械接种法 |
| 1.4.3 农杆菌侵染法 |
| 1.4.4 浸根法 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2、材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料和病毒株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 菌株及载体 |
| 2.1.4 引物设计和合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 总RNA质量分析 |
| 2.2.3 合成PLDMV cDNA第一链 |
| 2.2.4 利用RT-PCR、5'RACE和3'RACE扩增PLDMV全基因组 |
| 2.2.5 T-载体PCR产物克隆 |
| 2.2.6 pPLDMV、pPLDMV-GFP和pPLDMV-mCherry表达载体的构建 |
| 2.2.7 农杆菌兼容性侵染工程菌构建 |
| 2.2.8 pPLDMV/C58C1、pPLDMV-GFP/C58C1、pPLDMV-mCherry/C58C1侵染性试验 |
| 2.2.9 利用Western blot检测GFP及mCherry表达 |
| 3、结果与分析 |
| 3.1 PLDMV-DF病叶总RNA提取及电泳检测 |
| 3.2 PLDMV-DF分离物全长基因组克隆及序列测定 |
| 3.3 PPLDMV、PPLDMV-GFP和PPLDMV-MCHERRY表达载体的构建结果 |
| 3.4 PPLDMV、PPLDMV-GFP和PPLDMV-MCHERRY侵染病症观察及GFP、MCHERRY表达分析 |
| 3.5 PLDMV、PLDMV-GFP、PLDMV-MCHERRY侵染稳定性分析 |
| 4、讨论 |
| 4.1 影响GIBSON组装融合克隆法构建侵染性克隆的关键因素 |
| 4.2 PLDMV侵染性克隆构建的重要意义 |
| 4.3 PPLDMV-GFP、PPLDMV-MCHERRY侵染性表达载体构建及应用 |
| 4.4 利用弱毒株进行交叉保护的机制、存在的问题及改进措施 |
| 4.4.1 弱毒株交叉保护的机制及其假说 |
| 4.4.2 弱毒株交叉保护作用存在的问题及改进措施 |
| 5、主要研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（3）应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物技术在抗PRSV和PLDMV中的研究进展 |
| 1.1 PRSV、PLDMV外壳蛋白 (coat protein, CP) 基因的转化 |
| 1.2 PRSV复制酶 (replicase, RP) 基因的转化 |
| 1.3 辅助成分-蛋白酶 (helper component proteinase, HC-Pro) 基因的转化 |
| 1.4 PRSV核酶基因的转化 |
| 1.5 RNA介导的抗PRSV、PLDMV基因工程的研究 |
| 1.6 PRSV交叉保护措施的运用 |
| 2 抗病毒转基因番木瓜商业化应用的成就与挑战 |
| 3 CRISPR基因编辑技术为番木瓜分子抗病育种提供了新的策略 |
| 作者贡献 |
（4）利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒研究进展 |
| 1.2 抗番木瓜环斑病毒分子育种研究进展 |
| 1.2.1 PRSV外壳蛋白基因的转化 |
| 1.2.2 PRSV复制酶基因的转化 |
| 1.2.3 PRSV辅助成分-蛋白酶基因的转化 |
| 1.2.4 PRSV核酶基因的转化 |
| 1.2.5 RNA介导的抗PRSV基因工程的研究进展 |
| 1.2.6 PRSV交叉保护措施的运用 |
| 1.3 抗病毒转基因番木瓜商业化应用的成就与挑战 |
| 1.4 基于RNAi技术分子育种研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 海南PRSV多样性调查与分析 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 病毒样品分子检测,序列及相关性分析方法 |
| 2.2 番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建方法 |
| 2.2.1 实验材料和载体 |
| 2.2.2 RNAi表达载体载体构建方法 |
| 2.3 RNAi表达载体转化番木瓜 |
| 2.3.1 番木瓜转化受体材料及再生方法 |
| 2.3.2 番木瓜基因枪转化方法 |
| 2.3.3 番木瓜转基因株系的检测方法 |
| 2.4 转基因番木瓜抗病性检测方法 |
| 2.4.1 番木瓜转基因株系病毒接种观察法 |
| 2.4.2 ELISA分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 海南PRSV多样性分析 |
| 3.1.1 海南地区番木瓜PRSV感染情况检测 |
| 3.1.2 海南PRSV株系基因变异情况分析 |
| 3.1.3 海南PRSV株系的级联多基因树系统发育分析 |
| 3.1.4 海南PRSV株系的地理分布特点 |
| 3.2 番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建 |
| 3.2.1 海南PRSV基因保守区域分析情况 |
| 3.2.2 具有粘性末端保守区域干扰片断的获得 |
| 3.2.3 干扰片断RNAi发夹结构的获得 |
| 3.2.4 番木瓜抗病毒RNAi植物表达载体的获得 |
| 3.3 RNAi转基因番木瓜株系的获得 |
| 3.3.1 番木瓜RNAi转化抗性苗的获得 |
| 3.3.2 RNAi转基因番木瓜株系的PCR检测 |
| 3.4 转基因番木瓜抗病性检测 |
| 3.4.1 转基因番木瓜株系温室接种抗病表现 |
| 3.4.2 ELISA反应对转基因株系群定性和定量分析 |
| 3.4.3 大田种植转基因株系自然发病情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 海南PRSV株系的生物多样性分析的成因及其对制定番木瓜转基因育种策略的影响 |
| 4.2 RNAi技术是番木瓜高效广谱的转基因抗病育种可行的策略 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间发表学术论文、申请专利和学术交流情况 |
| 致谢 |
（5）番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 番木瓜简介 |
| 1.2 番木瓜环斑病毒 |
| 1.2.1 病毒特征 |
| 1.2.2 寄主范围 |
| 1.2.3 分布 |
| 1.2.4 危害及传播途径 |
| 1.2.5 防治 |
| 1.3 番木瓜畸形花叶病毒 |
| 1.4 马铃薯Y病毒属病毒混合感染的相关研究 |
| 1.5 植物病毒cDNA侵染性克隆的相关研究 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要试剂配方 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 混合感染PRSV/PLDMV病毒分离及基因组全长分段扩增 |
| 2.2.2 混合感染PRSV/PLDMV病毒分离株侵染性cDNA克隆的构建 |
| 2.3 PRSV与PLDMV的交互作用 |
| 2.3.1 植物病毒接种方法 |
| 2.3.2 侵染性克隆侵染性测试 |
| 2.3.3 寄主范围测试 |
| 2.3.4 同步及非同步接种 |
| 2.3.5 PRSV和PLDMV病症表现分级 |
| 2.3.6 利用荧光实时定量PCR检测病毒积累量变化趋势 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRSV-LM/PLDMV-LM基因组全长序列分析 |
| 3.1.1 植物叶片总RNA提取检测 |
| 3.1.2 PRSV-LM/PLDMV-LM分离物全长基因组序列的测定及分析 |
| 3.2 构建PRSV-LM和PLDMV-LM全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.3 混合感染PRSV-LM/PLDMV-LM病毒的番木瓜病叶症状表现 |
| 3.3.1 PRSV-LM和PLDMV-LM侵染性及侵染番木瓜的症状表现 |
| 3.3.2 PRSV-LM/PLDMV-LM的寄主范围 |
| 3.3.3 同步及非同步接种PRSV-LM和PLDMV-LM在番木瓜上的症状表现 |
| 3.3.4 病程发展曲线下面积(AUPDC) |
| 3.3.5 Real-Time荧光定量PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRSV和PLDMV侵染性克隆构建技术难度 |
| 4.2 PRSV和PLDMV交互作用实验关键影响因子 |
| 4.3 PRSV和PLDMV在不同处理下的积累量及其增殖动态 |
| 4.4 PRSV/PLDMV混合侵染的防治策略 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）利用酵母同源重组系统构建PRSV-HN2侵染性克隆及其侵染力分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 一 导论 |
| 1 前言 |
| 2 番木瓜环斑病毒(PRSV)的国内外研究现状及分析 |
| 2.1 马铃薯Y病毒属 |
| 2.2 番木瓜环斑病毒 |
| 2.3 症状 |
| 2.4 传播途径 |
| 2.5 PRSV 株系 |
| 2.6 病毒粒子的生物学特性 |
| 2.7 结构功能 |
| 2.8 PRSV基因组结构与功能 |
| 3 防治技术研究 |
| 3.1 番木瓜抗病育种和组培研究 |
| 3.2 弱株系的研究和利用 |
| 3.3 基因工程抗病性 |
| 4 侵染性cDNA克隆的构建 |
| 5 侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的稳定性 |
| 6 穿梭质粒及双元载体系统 |
| 7 酵母同源重组系统 |
| 8 农杆菌侵染法 |
| 9 本研究目的和意义 |
| 10 技术路线 |
| 二 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 植物材料和病毒株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 菌株 |
| 1.5 载体 |
| 1.6 培养基 |
| 1.7 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 植物总RNA的提取 |
| 2.2 RNA纯度及完整性检测 |
| 2.3 DNA第一链的合成 |
| 2.4 3'RACE |
| 2.5 5'RACE |
| 2.6 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) |
| 2.7 琼脂糖凝胶电泳及回收 |
| 2.8 T载体的连接反应 |
| 2.9 In-Fusion反应 |
| 2.10 大肠杆菌感受态细胞化学转化 |
| 2.11 常规的PCR反应 |
| 2.12 长片段重叠延伸PCR |
| 2.13 大肠杆菌质粒的提取 |
| 2.14 DNA测序与数据分析 |
| 2.15 酵母感受态细胞的制备 |
| 2.16 酵母感受态细胞的化学转化 |
| 2.17 酵母质粒的提取 |
| 2.18 农杆菌化学转化感受态细胞的制备 |
| 2.19 农杆菌的转化 |
| 2.20 注射接种 |
| 2.21 侵染性检测 |
| 三 结果与分析 |
| 1 番木瓜叶片提取的总RNA的凝胶电泳检测 |
| 2 质粒p-A、p-B、p-C、p-D的构建 |
| 3 质粒p-E、p-F的构建 |
| 4 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA克隆载体pB-P |
| 5 酵母重组系统构建PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆PPH |
| 6 酵母重组系统构建带有GFP序列的PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆 |
| 6.1 构建P1蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP1G |
| 6.2 构建P3蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHP3G |
| 6.3 构建NIB蛋白后插入GFP序列的全长cDNA侵染性克隆PPHNIBG |
| 7 PRSV-HN2全长基因组序列的测定 |
| 8 PRSV全长测序及序列分析 |
| 9 与己克隆公布序列核苷酸、氨基酸同源性比较及系统发育树分析 |
| 10 PRSV-HN2全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 四 讨论 |
| 1 利用RACE-PCR获得末端序列的技术改进 |
| 2 长片段的RT-PCR的技术要领 |
| 3 全长cDNA侵染性克隆在大肠杆菌(E.coli)中的不稳定性及解决方案 |
| 4 三种插入GFP基因的PRSV-HN2病毒表达载体的构建与表达情况 |
| 5 利用酵母同源重组系统构建PRSV全长序列的意义 |
| 6 PRSV-HN2分离物cDNA侵染性克隆的潜在利用价值 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 PRSV基因组3′端扩增及克隆 |
| 1.3 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 云南PRSV病害的调查结果 |
| 2.2 云南PRSV的RT-PCR检测 |
| 2.3 序列分析 |
| 2.3.1 PRSV不同分离物部分CP氨基酸序列分析及其分子进化关系: |
| 2.3.2 PRSV不同分离物基因组3′端系统进化关系: |
| 3 讨论 |
（8）番木瓜畸形花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒总RNA提取 |
| 1.2.2 病毒外壳蛋白基因的扩增 |
| 1.2.3 PCR 产物纯化和产物的序列测定 PCR |
| 1.2.4 DNA序列分析和进化树的构建 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRSV外壳蛋白基因的克隆 |
| 2.2 病毒外壳蛋白基因的核苷酸序列测定 |
| 2.3 核苷酸序列同源性比较 |
| 2.4 系统进化分析 |
| 3 讨论 |
（9）番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒样品 |
| 1.2 外壳蛋白基因的克隆及测序 |
| 1.3 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRSV的RT-PCR检测结果 |
| 2.2 插入片段的序列分析 |
| 3 讨论 |
（10）番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-HN）全基因组克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一 文献综述 |
| 1 番木瓜环斑病毒（PRSV）的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 番木瓜环斑病毒 |
| 1.2.1 症状 |
| 1.2.2 病毒粒子特性 |
| 1.2.3 传播途径 |
| 2 马铃薯丫病毒属病毒研究进展 |
| 2.1 马铃薯丫病毒属病毒的生物学特性 |
| 2.2 马铃薯Y 病毒属基因组结构与功能 |
| 2.2.1 非翻译区(NTR) |
| 2.2.2 P1 蛋白 |
| 2.2.3 HC-Pro 蛋白 |
| 2.2.4 P3 蛋白 |
| 2.2.5 其它 |
| 3 防治研究 |
| 3.1 番木瓜抗病育种和组培研究 |
| 3.2 弱株系的研究和利用 |
| 3.3 基因工程抗病性 |
| 3.3.1 外壳蛋白(Coat Protein，CP)基因介导的抗性 |
| 3.3.2 复制酶(replicase ,RP)基因介导的抗性 |
| 3.3.3 运动蛋白(Movement Protein, MP)基因介导的抗性 |
| 3.3.4 其他基因介导的抗性 |
| 4 本研究的目的意义和技术路线 |
| 4.1 目的意义 |
| 4.2 技术路线 |
| 二 材料和方法 |
| 1 材料和试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 菌株与载体质粒 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒RNA 的抽提 |
| 2.1.1 总RNA 提取 |
| 2.1.2 RNA 纯度及完整性检测 |
| 2.2 病毒基因组全序列的扩增 |
| 2.2.1 中间序列的RT-PCR |
| 2.2.2 末端序列的测定:3'-RACE 和5'-RACE |
| 2.2.3 PCR 扩增全长 |
| 2.3 PCR 产物纯化 |
| 2.4 回收的PCR 片段与T-载体连接 |
| 2.5 感受态细胞的制备 |
| 2.6 重组质粒转化感受态细胞 |
| 2.7 质粒载体的小量制备(碱裂法) |
| 2.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.9 序列测定和分析 |
| 三 结果与分析 |
| 1 感病总RNA 的电泳检测 |
| 2 基因组各段RT-PCR 及末端RACE 扩增检测 |
| 3 一步法RT-PCR 扩增PRSV-HN 分离物全序列 |
| 4 病毒基因组结构与功能的分析 |
| 4.1 PRSV-HN 分离物基因组全序列和ORF 结构分析 |
| 4.2 PRSV-HN 分离物ORF 编码的聚合蛋白酶切位点分析 |
| 4.3 PRSV-HN 分离物与12 株PRSV 全基因组序列特征的比较 |
| 4.3.1 PRSV 基因组酶解位点 |
| 4.3.2 PRSV 基因组核苷酸数目 |
| 4.3.3 核苷酸、氨基酸序列同源性 |
| 4.3.4 系统进化树分析 |
| 4.4 PRSV-HN 分离物基因组结构保守基序及其功能分析 |
| 四 讨论 |
| 1 利用RACE-PCR 获得末端序列 |
| 2 长片段的RT-PCR |
| 3 PRSV-HN 分离物CDNA 克隆的可能利用价值 |
| 3.1 研究病毒运动 |
| 3.2 研究病毒基因功能 |
| 五 主要结论与进一步研究的建议 |
| 1 主要结论 |
| 2 进一步研究的建议 |
| 参考文献 |
| 论文涉及的部分缩略词（Abbreviation） |
| 致谢 |
四、番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究[D]. 彭斌. 华中农业大学, 2019
- [2]番木瓜畸形花叶病毒（PLDMY）侵染性克隆的高效构建及遗传分析[D]. 熊越. 海南大学, 2018(08)
- [3]应用现代生物技术防治番木瓜RNA病毒研究进展[J]. 赵辉,贺萍萍,郭静远,孔华,郭安平. 分子植物育种, 2017(11)
- [4]利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质[D]. 赵辉. 海南大学, 2016(07)
- [5]番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究[D]. 刘芳. 海南大学, 2016(05)
- [6]利用酵母同源重组系统构建PRSV-HN2侵染性克隆及其侵染力分析[D]. 赵光远. 海南大学, 2015(07)
- [7]云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性[J]. 朱静,谭冠林,包改丽,刘芳,李晓静,吴祖建,李凡. 微生物学通报, 2014(06)
- [8]番木瓜畸形花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 汪倩,谭德冠,吴丽娟,孙雪飘,张家明. 江苏农业科学, 2012(08)
- [9]番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析[J]. 杨国慧,张仲凯,崔崇士. 植物保护学报, 2007(03)
- [10]番木瓜环斑病毒海南分离物（PRSV-HN）全基因组克隆与序列分析[D]. 卢雅薇. 华南热带农业大学, 2007(03)