一、人脐静脉内皮细胞重建成功（论文文献综述）
赵豆豆,林开利[1]（2022）在《多细胞构建血管化组织工程骨在骨修复中的应用》文中进行了进一步梳理背景:组织工程骨构建体的血管化性能不足是限制骨组织工程用于修复大尺寸骨缺损临床应用的主要挑战。目的:对近年来利用骨形成细胞和血管生成细胞构建组织工程构建体（基于支架或无支架）在骨修复中的应用进行了概述,以期实现组织工程骨可持续的血管生成及生成功能完善的血管,从而提高骨组织工程在大尺寸骨缺损修复应用中的细胞存活率、并为促进骨的形成和重塑提供参考。方法:应用计算机对中国知网、Pub Med及Web of Science数据库2000-2021年发表的文献进行了检索,中文检索词为"骨组织工程、成骨成血管、多细胞",英文检索词为"Bone Tissue Engineering,Osteogenesis and angiogenesis,Multicellular",根据纳入和排除标准,最终纳入63篇文献进行结果分析。结果与结论:（1）目前最常用的骨形成细胞主要有间充质干细胞、脂肪干细胞和成骨细胞,常用的血管生成细胞有人脐静脉内皮细胞和内皮祖细胞。（2）支架内包封细胞在实现各类细胞的精准定位方面优于在支架上接种细胞。（3）将两种单一细胞膜片相叠加或者共培养单层细胞膜片相叠加的方法,可以调控各类细胞的位置,从而构建血管化网络。（4）目前,基于支架的组织工程技术还需克服支架降解速率与组织再生速率的不匹配性、细胞与生物材料相互作用不可控等问题,而基于无支架细胞膜片的组织工程还需要克服力学强度低的难题。（5）未来研究需构建具有临床所需大小的功能性3D血管化组织工程骨,还需关注包括细胞培养和生物学作用机制;结合组织工程、细胞工程和基因工程构建组织工程骨,有望实现刺激早期血管生成、保持血液循环,防止构建体内部的细胞死亡,并起到加速构建体修复临床大体积骨缺损的作用。
陈芳芳[2]（2021）在《脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究》文中认为研究背景糖尿病是21世纪全球最严重的公共卫生问题之一,我国已成为糖尿病患者总数最多的国家。与未患糖尿病的成年人相比,大约75%的2型糖尿病患者死于心血管并发症。研究表明,冠心病合并2型糖尿病患者的冠状动脉受累程度高且弥漫病变较多、狭窄程度较重,临床治疗困难明显增加。经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary interventions,PCI）是目前用于治疗冠心病合并糖尿病的有效手段。但是在PCI日臻完善的今天,糖尿病一直是PCI术中并发症和术后近、远期预后不良的独立危险因素。糖尿病患者PCI术后支架内再狭窄发生率显着升高,是严重影响患者预后的主要因素。支架内再狭窄（Int-stentrestenosis,ISR）是涉及多种机制的复杂疾病过程,是恶化2型糖尿病心血管并发症患者预后的核心问题。现有观点认为以平滑肌细胞增殖为核心的血管内膜增生是支架内再狭窄的主要病理过程和关键环节。以此为靶点开发的雷帕霉素、紫杉醇药物洗脱支架可在一定程度上降低支架内再狭窄的发生率,但存在“晚期追赶现象”,且晚期支架内再狭窄发生率仍高达10%。由此推测平滑肌细胞增殖可能只是血管内膜增生的主要中间过程而非启动因素,而糖尿病导致PCI术后支架内再狭窄发生率显着增高的关键机制也尚未阐明。因此,探索糖尿病条件下血管内膜增生的启动环节,寻找以此为靶点的干预方法,才能从源头上阻断支架内再狭窄的发生发展。对于血管结构而言,内皮细胞作为管壁组织与血液中各种病理性刺激的天然屏障,是保护平滑肌细胞免受刺激因素干扰的关键,在血管内膜增生过程中可能是先于平滑肌细胞发挥作用的核心角色。支架的植入过程中存在内皮细胞受损,内皮细胞损伤是启动动脉粥样硬化的关键步骤。围手术期药物的规范应用已在最大程度上保护了内皮细胞的完整性,而平滑肌细胞仍能不断受到刺激而增殖。近期关于内皮细胞在刺激因素下向间质细胞转变即内皮间质转化（Endothelial-Mesenchymal Transition,EndMT）的研究给了我们一定的启示。EndMT 是指在某些特定的生理或病理条件下,内皮细胞失去其自身特异性抗原,而获得间质细胞抗原,同时其生物学特性明显改变,获得较强的增殖、迁移、收缩能力。EndMT在冠状动脉和肺动脉的发育过程中可使内皮细胞向平滑肌细胞进行转化,对心血管系统的正常发育有至关重要的作用。EndMT参与了诸多与血管内膜增生相关疾病的发生过程,促进动脉粥样硬化,但未涉及PCI术后再狭窄防治的研究。因此,EndMT可能是支架内再狭窄发生的关键步骤。近来研究证实,多种外界刺激因素在内皮细胞发生EndMT中起重要作用,包括高糖、炎症、低氧、脂代谢异常、氧化应激、机械牵张力、吸烟等,但是糖尿病、动脉粥样硬化及支架内再狭窄的发病机制复杂,涉及上述多种机制的协同作用。外泌体（Exosomes）能够携带大量蛋白质、核酸及脂质成分,整合来源细胞的有效刺激信息,有效实现信号的级联放大和远距离传输。Exosomes所携带、传递的信息成分多与其来源细胞/组织密切相关。糖尿病状态下,脂肪细胞来源外泌体（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）含有脂肪组织炎症及胰岛素抵抗的相关蛋白及核酸成分,能够通过作用于靶细胞诱发多种生物学功能,可能是链接胰岛素抵抗的脂肪组织与糖尿病动脉血管之间的重要桥梁,是整合机体多种刺激因素,诱发EndMT的关键载体。Sonic hedgehog（Shh）作为Hedgehog蛋白三种同源形式之一,表达最广泛,活性最高,是参与胚胎发育的关键蛋白。在肿瘤领域的研究发现,Shh具有激活Snail信号通路促进上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的作用,而EndMT是EMT的一种特殊类型。进一步研究证实,Snail信号通路亦是调节EndMT形成的关键信号通路。综上,我们提出研究假说:糖尿病状态下,携带Shh的AdExos增多,被内皮细胞摄取,AdExos通过其表面携带的Shh激活Snail依赖的EndMT过程,导致内皮细胞发生表型转换,逐渐向间质细胞转化,促进血管内膜增生,最终导致支架内再狭窄的发生。鉴于以上假说,我们将进行体内及体外实验,在整体和细胞水平研究脂肪细胞来源外泌体在血管再狭窄中的作用及具体机制。研究目的1.在整体动物水平证实AdExos通过其携带的Shh促进内皮间质转化,加剧血管内膜增生,进而影响糖尿病血管再狭窄的发生;2.从细胞水平探索AdExos促内皮间质转化的特性,验证AdExos通过其携带的Shh激活内皮细胞Snail信号通路并促进EndMT,为2型糖尿病PCI术后支架内再狭窄防治提供新的靶点。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型首先,我们通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基,黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞,再通过高糖联合高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型,采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取及特征鉴定将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）;再采用透射电镜、动态光散射粒度仪、流式细胞仪及Western blot等方法进行AdExos的特征鉴定。4.2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型的构建4周龄的雄性ApoE-/-小鼠,适应性喂养1周后,禁食处理12～14小时,进行腹腔糖耐量试验（Intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT）后随机分为高脂饮食组和普通饮食组,高脂饮食组予以高脂饲料喂养,普通饮食组予以普通生长繁殖饲料喂养;6周后再次进行IPGTT试验,出现胰岛素抵抗的高脂饮食组小鼠给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）（剂量标准为75mg/kg）,普通饮食组小鼠给予同等剂量的枸橼酸钠缓冲液进行腹腔注射;继续以原饲料喂养2周后,再次进行IPGTT试验和随机血糖检测,如果小鼠的随机血糖水平≥11.1mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象,则纳入2型糖尿病组。对2型糖尿病组小鼠和对照组小鼠通过植入股动脉袖套的方法构建血管再狭窄模型。分别给予生理盐水、IR-AdExos及IR-AdExosshh-经尾静脉注射,最后得到动物分组分别为普通饮食再狭窄组（Chow）、普通饮食+IR-AdExos再狭窄组（Chow+IR-AdExos）、普通饮食+IR-AdExosshh-再狭窄组（Chow+IR-AdExosshh）、糖尿病再狭窄组（DM）、糖尿病+IR-AdExos再狭窄组（DM+IR-AdExos）及糖尿病+IR-AdExosshh-再狭窄组（DM+IR-AdExosshh-）。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取为了验证小鼠血管能够摄取AdExos,我们采用PKH26染料标记AdExos,经尾静脉注射入再狭窄模型小鼠,制作血管标本切片,通过免疫荧光染色观察AdExos在体内的摄取情况。6.病理组织学染色观察血管再狭窄情况对股动脉再狭窄部位组织标本切片进行Hematoxylin-eosin staining（HE）染色、Verhoeffs Van Gieson弹性纤维染色及免疫组化染色,观察血管再狭窄情况。7.免疫荧光染色检测再狭窄部位EndMT发生情况通过进行 CD31 和 SM22α、CD31 和 Vimentin、Ve-Cadherin 和 SM22α、Ve-Cadherin和Vimentin免疫荧光共定位染色的方法检测血管再狭窄部位EndMT的发生情况。8.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞发生内皮间质转化的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,采用鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。9.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测细胞中EndMT发生情况再将所获取的Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过免疫荧光染色及Western blot的方法评价内皮标记物和间质标记物的表达变化及EndMT的发生情况。10.Western blot 检测分子机制方面,取AdExos及重组蛋白刺激孵育后的小鼠主动脉内皮细胞,提取蛋白质,采用Western blot方法检测Shh、内皮细胞及间质细胞标记物的表达及信号通路分子的表达情况。研究结果1.建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型3T3-L1前脂肪细胞诱导分化至成熟脂肪细胞后,细胞质内出现较多、较大的脂滴;高糖高胰岛素条件培养成熟脂肪细胞24h后,脂肪细胞总蛋白中总IRS1表达量显着减少,磷酸化Ser307位点的IRS1表达量显着增高,Akt的磷酸化水平降低;脂肪细胞细胞膜蛋白Glut4表达减少而细胞浆蛋白Glut4表达增加,提示胰岛素抵抗状态下Glut4细胞膜转位减少;胰岛素抵抗状态下,脂肪细胞脂质沉积增多。上述结果表明我们成功建立了 3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。2.AdExos的分离提取及特征鉴定透射电镜观察下发现AdExos呈膜包被的囊泡状,直径在30～100nm范围内;动态光散射粒度仪结果表明AdExos直径范围分布于30～100nm;Western blot及流式细胞学结果表明AdExos阳性表达CD63、TSG101及CD81,而不表达GRP94和Calnexin。3.构建2型糖尿病血管再狭窄ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠通过高脂饮食饲养联合链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）一次性注射的方法构建2型糖尿病模型,糖尿病小鼠随机血糖≥11.1 mmol/L,且有多饮、多尿、多食等现象。在此模型的基础上,通过股动脉袖套植入的方式构建再狭窄模型。4.糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子通过Western blot方法检测对照组和糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体蛋白中Shh分子的表达情况,结果表明糖尿病组小鼠脂肪组织来源外泌体中Shh含量显着高于对照组,证明糖尿病脂肪组织来源外泌体富集Shh分子。5.小鼠体内血管对AdExos的摄取在免疫荧光显微镜下进行观察,发现PKH26标记的AdExos呈红色荧光,分布于小鼠血管范围内,证明小鼠血管能够成功摄取AdExos。6.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进血管再狭窄高分辨率显微超声技术检测股动脉收缩期最大流速（Peak systolic velocity,PSV）,HE染色分析血管再狭窄,综合二者结果确定血管再狭窄情况。结果表明,糖尿病组小鼠股动脉再狭窄情况与普通饮食组相比明显加重;与普通饮食组或糖尿病组相比,普通饮食+IR-AdExos组或糖尿病+IR-AdExos组的再狭窄情况进一步加重;而Shh蛋白敲减后的IR-AdExos,其促血管再狭窄的能力有所下降,即普通饮食+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄较普通饮食+IR-AdExos组小鼠更轻,糖尿病+IR-AdExosshh-组小鼠股动脉再狭窄程度比糖尿病+IR-AdExos组小鼠更轻。7.IR-AdExos通过携带的Shh分子促进股动脉再狭窄部位EndMT的发生通过免疫荧光共定位的方法检测血管再狭窄部位发生EndMT的情况,免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（SM22α、Vimentin）则记为发生内皮细间质转化的细胞。结果表明糖尿病状态下,内皮细胞标志物减少,间质细胞标志物增加,提示发生EndMT;尾静脉注射IR-AdExos能够进一步促进EndMT的发生,而敲减Shh的IR-AdExos其促EndMT作用减弱,证明IR-AdExos表面的Shh分子是IR-AdExos发挥促EndMT作用的主要分子靶点。8.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。9.AdExos促进内皮细胞发生EndMT将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及TGF-β、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞后,通过免疫荧光共定位的方法检测内皮细胞EndMT的发生。免疫荧光共定位时,如果内皮细胞同时表达内皮细胞特征性标志物（CD31、Ve-Cadherin）和间充质细胞特征性标志物（α-SMA、FAP、FSP-1）则记为发生内皮细间质转化的细胞。与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞发生EndMT增多;与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组发生EndMT的内皮细胞数量并无显着增加,而IR-AdExosshh+组中发生EndMT的内皮细胞数量进一步增加;TGF-β作为阳性对照,在其刺激下,发生EndMT的内皮细胞数量显着增加;SHH重组蛋白刺激组中,发生EndMT的内皮细胞数量也有显着增加。上述结果表明,IR-AdExos能够促进内皮细胞发生EndMT,且该作用是经由其携带的Shh分子发挥的。另,TGF-β及SHH也具有促进内皮细胞发生EndMT的作用。10.IR-AdExos促进血管再狭窄EndMT的分子机制与Ctrl组相比,IR-AdExos组内皮细胞中Snail和Slug表达显着升高。证明IR-AdExos的促EndMT作用是通过其表面的Shh作用于下游的Snail和Slug分子发挥作用。研究结论1.胰岛素抵抗条件下,脂肪细胞中脂质含量增多,脂肪细胞来源外泌体富集Shh分子;2.IR-AdExos能够通过携带的Shh分子,经由Shh/Snail/Slug信号通路促进小鼠主动脉内皮细胞发生EndMT;3.富集Shh的IR-AdExos能够明显促进血管内皮细胞发生间质转化,进而加剧糖尿病小鼠血管再狭窄的发生,可能是糖尿病脂肪组织促进血管再狭窄的重要机制之一,IR-AdExos有望成为进一步防治糖尿病ISR的新靶点。研究背景糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的重大慢性疾病之一。近年来,我国糖尿病患病率增长迅速,中国已成为全球糖尿病患者总数最多的国家。心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。粥样斑块破裂导致的急性冠脉综合征是糖尿病患者心血管事件的主要原因。但是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的机制尚未完全阐明。循证医学证据表明,积极控制血糖可以降低糖尿病患者微血管病变的发生率,但强化降糖治疗能否降低2型糖尿病患者心血管事件的发生率尚未得到证实。这提示血糖和胰岛素水平仅能反映代谢水平,而不是糖尿病患者冠状动脉病变严重、易损斑块发生率高的根本原因。因此,亟需深入探讨糖尿病患者大血管并发症增加的深层次机制。既往研究发现动脉粥样硬化斑块内常出现病理性新生血管,且在易损斑块和斑块易损部位尤为明显,与斑块稳定性密切相关。病理性新生血管是动脉粥样硬化易损斑块形成的关键环节。越来越多的证据表明,动脉损伤部位病理性新生血管形成与粥样硬化斑块引起的急性冠脉综合症有关,这些斑块脆性较大且易发生破裂,进而导致血管阻塞。除了斑块内出血机制以外,病理性新生血管还通过白细胞征募来促进动脉粥样硬化斑块的不稳定性。2型糖尿病和动脉粥样硬化同属慢性炎症性疾病,在2型糖尿病状态下,脂质在脂肪细胞中不断存储,随着脂肪细胞逐渐增大,导致脂肪细胞功能失调,脂肪因子分泌紊乱,大量促炎因子合成释放,引发全身代谢性炎症反应、胰岛素抵抗,从而加速斑块进展,促进易损斑块的形成。此外,有研究发现,脂肪细胞能够分泌内皮特异性丝裂原和促血管生长因子,参与新生血管的形成。但功能失调的脂肪组织如何促进斑块内新生血管的形成,从而促进斑块发生发展的确切机制至今尚未见报道。近期,有学者认为外泌体（Exosomes）是脂肪组织与血管间信息传递的重要载体。Exosomes是由多种细胞（如血小板、内皮细胞、单核细胞等）产生的,携带大量与其细胞/组织来源和功能密切相关的蛋白质、核酸和脂质成分。可实现信号的级联放大和远距离传输。在人体内所有exosomes中,脂肪细胞来源的exosomes（Adipocyte-derived exosomes,AdExos）与糖尿病动脉粥样硬化的发生发展及新生血管形成的关系日益引起人们的关注。Hulsmans等认为,AdExos是将脂肪组织产生的炎症及氧化应激信息传递到血管的重要使者,从而引起内皮损伤、诱发动脉粥样硬化。但是,AdExos对于斑块稳定性变化及斑块内病理性新生血管的形成有无影响尚未见报道。研究发现AdExos富含纤粘连蛋白、层粘连蛋白,有利于循环中的AdExos粘附、迁移、浸润于内皮细胞。糖尿病慢性低度炎症状态下,受损的内皮细胞通透性增加且炎症因子（IL-6、IL-8）、趋化因子（MCP-1）、粘附因子（VCAM-1、E-selectin）表达上调,为循环中的AdExos粘附、浸润创造了良好的条件。此外,AdExos携带丰富的促血管生成miRNA,如miR221、miR27b、miR21、miR17～92等。脂肪组织作为内分泌器官,是多器官间相互联系的纽带。Hedgehog 蛋白在哺乳动物中有 Sonichedgehog（Shh）、Indianhedgehog（Ihh）及Desert hedgehog（Dhh）三种同源形式,其中Shh表达最广泛,活性最高。Hedgehog在斑马鱼胚胎发育中通过VEGF促进主动脉生成。Shh缺失的小鼠发育中的肺缺乏正常血管化的能力。Hedgehog信号可通过控制众多促血管生成因子包括VEGF-a,VEGF-b,VEGF-c及AngII的表达而调控新生血管的生成。Hedgehog蛋白促血管生成功能的发挥是通过连接到一种12次跨膜受体蛋白--Patched实现的。在正常情况下,Patched受体与另一种7次跨膜受体蛋白——Smoothened（Smo）相结合且抑制Smo的作用。当Hedgehog蛋白与Patched受体结合后,解除了对Smo的抑制作用,进而启动信号转导。Smo是Hedgehog信号通路的信息转换器,把细胞外的Hedgehog蛋白信号向细胞内传递,激活胶质瘤相关原癌基因（Glioma-associated oncogene homolog,Gli）转录因子。综上所述,我们提出了如下假说:糖尿病状态下,功能失调的脂肪组织释放入循环血液中的AdExos数量增多,其通过其表面的Hedgehog蛋白与内皮细胞上的Patched受体结合,促进病理性新生血管的形成,加速斑块进展及易损斑块的形成。研究目的1.从细胞水平分析AdExos促血管生成的特性;2.体外验证AdExos是否通过启动Hedgehog信号通路,促进新生血管的形成。研究方法1.培养、诱导分化3T3-L1前脂肪细胞并建立胰岛素抵抗模型通过胰岛素、3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤与地塞米松联合诱导的方法将3T3-LI前脂肪细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。再通过高糖+高胰岛素的方法建立胰岛素抵抗的脂肪细胞模型。采用无exosomes血清培养并收集细胞上清,获取对照组（Control,Ctrl）及胰岛素抵抗组（Insulin resistance,IR）脂肪细胞上清。2.Shh腺病毒转染3T3-L1脂肪细胞在建立胰岛素抵抗模型的基础上,我们再将Shh干扰及过表达的腺病毒转染入成熟脂肪细胞中,采用无exosomes血清培养后,收集细胞上清,获取胰岛素抵抗组、Shh干扰的胰岛素抵抗组、Shh过表达的胰岛素抵抗组及空载体胰岛素抵抗组的脂肪细胞上清。3.AdExos的分离提取将前文中获得的多种脂肪细胞上清通过超速差速离心法,分离提取上清中的外泌体,由此获得对照组外泌体（Ctrl-AdExos）、胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExos）、Shh干扰的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh-）、Shh过表达的胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosshh+）及空载体胰岛素抵抗组外泌体（IR-AdExosvector）。4.分离提取小鼠主动脉内皮细胞,验证内皮细胞对AdExos的摄取为了进一步研究AdExos对内皮细胞血管新生能力的影响,我们进行了体外细胞实验,通过酶消法提取小鼠主动脉内皮细胞,给予PKH26标记的AdExos,显微镜下观察内皮细胞对AdExos的摄取。5.AdExos刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,检测内皮细胞功能的改变将所获取的 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过PCNA/KI67免疫荧光染色检测内皮细胞增殖功能,通过细胞划痕实验检测迁移功能。6.小管形成实验检测AdExos促血管新生的特性将 Ctrl-AdExos、IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白用以刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,评价AdExos的促血管新生的能力。7.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用分子机制方面,给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺阻断Hedgehog信号通路,通过小管形成实验观察小管形成的数量及分支长度,检测内皮细胞的小管形成功能。给予Hedgehog蛋白阻断剂——环巴胺和Gli抑制剂——Gant61刺激孵育,提取小鼠主动脉内皮细胞的蛋白质,通过Western blot方法检测信号通路分子的表达情况。研究结果1.成功提取原代小鼠主动脉内皮细胞,小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos我们采用酶消法成功提取小鼠主动脉内皮细胞,经免疫荧光染色证明所提取的内皮细胞阳性表达内皮细胞标记物CD31,证明小鼠主动脉内皮细胞提取成功。将PKH26标记的AdExos与小鼠主动脉内皮细胞共同孵育,显微镜下观察可见细胞浆内有红色荧光,即为被小鼠主动脉内皮细胞摄取的AdExos,证明小鼠主动脉内皮细胞能够摄取AdExos。2.IR-AdExos改变小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。首先进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量有所增加,IR-AdExos刺激组的PCNA和KI67的表达量显着增加,以VEGF作为促血管新生的阳性对照用以刺激内皮细胞,结果发现,与对照组相比,VEGF刺激组中内皮细胞的PCNA及KI67表达量均显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的增殖功能。细胞划痕实验结果显示:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组的细胞迁移率有增加,IR-AdExos细胞迁移率显着增加,VEGF刺激组细胞迁移率明显增加。表明IR-AdExos、VEGF能够显着增强内皮细胞的迁移功能。3.AdExos促进小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用Ctrl-AdExos、IR-AdExos、VEGF及SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果发现:与对照组相比,Ctrl-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度增加,IR-AdExos刺激组细胞小管形成数量、分支长度显着增加,VEGF阳性对照组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明IR-AdExos、VEGF能够明显增强内皮细胞的小管形成功能。4.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的增殖和迁移功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行PCNA和KI67免疫荧光染色,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞PCNA、KI67的表达量有所降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞中PCNA、KI67的表达量显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞增殖功能的重要分子。细胞划痕实验结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中细胞迁移率降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞细胞迁移率显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞迁移功能的重要分子。5.Shh基因干预的IR-AdExos影响小鼠主动脉内皮细胞的小管形成功能用 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector 等不同培养条件来源的AdExos及VEGF、SHH重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞。进行小管形成实验,结果显示:与IR-AdExos组相比,IR-AdExosshh-组中内皮细胞小管形成数量、分支长度降低,IR-AdExosshh+组内皮细胞小管形成数量、分支长度显着增加。表明Shh是IR-AdExos促进内皮细胞血管新生的重要分子。6.Hedgehog信号通路在AdExos促血管新生中的作用给予 Hedgehog 抑制剂环巴胺和 IR-AdExos、IR-AdExosshh-、IR-AdExosshh+、IR-AdExosvector等不同培养条件来源的AdExos以及VEGF重组蛋白刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞,检测内皮细胞小管形成功能,结果表明IR-AdExos+环巴胺组的小管形成数量、分支长度显着降低,证明Hedgehog是AdExos促血管新生的关键分子。7.AdExos促血管新生信号通路分子的表达情况给予Hedgehog抑制剂环巴胺、Gli抑制剂Gant61及IR-AdExosshh+刺激孵育小鼠主动脉内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。Western blot结果显示:IR-AdExosshh+刺激条件下,小鼠主动脉内皮细胞中Gli表达量显着升高;给予环巴胺和Gant61（Gli抑制剂）后,Gli表达量显着降低,证明AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。研究结论1.IR-AdExos能够增强小鼠主动脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成功能,促进血管新生;2.Shh是IR-AdExos促进内皮细胞功能改变的关键分子;3.IR-AdExos通过Patched/Gli信号通路促进血管新生。
陈爱贞[3]（2021）在《类外泌体纳米囊泡与外泌体在提高脂肪移植存活率的比较研究》文中研究说明目的:目前,自体脂肪移植在整形美容外科发挥着日益重要的作用,不仅被广泛应用于面部年轻化等美容外科,同时,因其具有操作简便、创伤小、恢复快、易于推广、生物相容性好、来源丰富、填充效果好等显着优势,也被逐渐应用于填充组织凹陷等组织器官修复重建领域。然而,传统单纯脂肪采集及注射技术存在着高吸收率、低存活率等不足,特别在大范围体表组织缺损重建等需要较大量脂肪移植时,自体脂肪移植技术的不足又限制了其进一步应用和推广。为了更好推广自体脂肪移植技术在整形美容领域的应用,已经有许多方法被提出来用来提高脂肪移植物的存活率。其中干细胞在脂肪移植领域的再生作用得到多个研究的验证。但是,干细胞增殖分化调控机制尚未完全明确、存在转化为肿瘤细胞的风险,并且近来研究显示脂肪干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）主要通过旁分泌途径发挥作用。ADSCs可通过分泌外泌体（exosomes,EXOs）的方式携带可溶性因子,执行生物学功能。但细胞释放的EXOs数量非常少,且获取过程繁琐。克服这一缺点的一种策略是大规模制备细胞来源的纳米级囊泡。（exosome-mimetic nanovesicles,NVs）。本研究旨在对比人工制备纳米级NVs与EXOs在提高脂肪移植存活率效果的比较研究。方法:1.利用水动力抽脂方式获取人源性脂肪组织,通过酶解分离提取P4代hADSCs。行成脂成骨分化诱导和流式细胞鉴定。2.提取P4代hADSCs衍生的NVs和EXOs。利用电镜、NTA、纳米流式和zeta进行NVs和EXOs的形态、粒径大小、表面蛋白标记和zeta电位鉴定和比较。3.体外细胞实验:荧光标记NVs和EXOs,动态追踪NVs和EXOs内化到人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的过程。设置不同浓度梯度的NVs和EXOs,研究它们促进HUVECs增殖、迁移、血管形成的最适浓度。4.动物实验:创建裸鼠脂肪移植模型,以体外实验结果获得的最适浓度的NVs和EXOs分别与等量的水动力抽脂获得的脂肪组织混合,移植到裸鼠皮下。观察1、2、3月后处死裸鼠取出移植组织,进行体积及重量的称量对比,继而进行切片后H&E染色镜下观察移植组织内细胞形态完整性、空泡形成和纤维化表现;免疫组织化学染色（CD34、VEGF、Ki67）观察新生血管生成、增殖情况。结果:1.光学显微镜可见hADSCs呈细长纺锤状特征形态。油红O染色结果显示细胞中有大小不一的红色脂肪滴,茜素红染色可见特征性的大量红色着色区。hADSCs表面标记物表达CD29+/CD34+/CD90+/CD31-/CD45-。2.电镜结果显示NVs和EXOs均为球形双层膜结构,NTA粒径范围约为50-150nm,纳米流式分析CD9和CD81表达阳性,zeta电位为负值。3.体外实验我们发现NVs和EXOs在低浓度时,随浓度增高其促进HUVECs的增殖、迁移、血管形成能力越显着,当达到最适浓度后,继续增加浓度效果反而下降。NVs的最适浓度为60ug/m L,EXOs的最适浓度为40ug/m L。4.体内实验验证了NVs和EXOs能够有效提高脂肪移植存活率。且NVs和EXOs提高脂肪移植存活的机制主要与其促进新生血管形成有关。结论:NVs的形态、大小、膜结构与EXOs相似。在脂肪移植领域可以达到跟EXOs相当的效果。同时NVs产量高远远高于EXOs。因此,其有望替代EXOs用于脂肪移植领域,且对其他再生医学领域提供新的思路。
牛文豪[4]（2021）在《小鼠甲基化转移酶SUV39h1在下肢缺血损伤和血管新生中的作用和机制研究》文中研究说明研究背景和假设:外周血管性疾病（Peripheral Artery Disease,PAD）是指外周动脉因动脉粥样硬化阻塞、血流灌注不畅,致使外周肢端乃至肢体因血氧供应不足所引发致残、致死的一类疾病,其中严重下肢缺血（Critical limb ischemia,CLI）是PAD疾病晚期阶段。CLI病程长、恢复慢,现已成为威胁人类健康的重大医学难题。CLI在临床治疗上主要以恢复缺血肢体血流供应、缓解缺血性疼痛以及最大程度的保留患肢功能为目标。目前虽然血管外科手术是其主要治疗措施,但考虑到患者病情的复杂性,手术的适应人群逐渐减少,同时临床数据显示即使手术干预,部分患者远期获益也并不显着。传统抗凝、抗血小板药物也因其明显的副作用在一定程度上限制了适用人群。总而言之CLI的病理过程比较复杂,仅通过改善血管系统的物理结构无法最大程度上恢复血流灌注。因此临床应进一步研究CLI的发病机制,探索更有效的治疗手段。CLI发生后患肢组织在缺血、缺氧和氧化应激等复杂的条件下,细胞内蛋白质进行各种修饰,以最大程度上减轻组织损伤。蛋白质修饰属于表观遗传学范畴,因此本研究将研究焦点聚集于表观遗传学对CLI进展的影响。SUV39h1（Suppressor Of Variegation 3-9 Homolog 1）是人类发现的首个组蛋白赖氨酸甲基转移酶,参与H3组蛋白第9号赖氨酸甲基化修饰,影响靶基因染色体上定位,进而调节细胞分裂增殖。既往研究发现SUV39h1参与局部血管内膜的病理性增厚,与组织缺血密切相关。但作为血管系统的主要组成部分的血管内皮细胞,目前尚无SUV39h1对其的研究报导,也无该基因对缺血下肢血流灌注恢复影响的研究。因此本研究拟从动物、细胞、分子机制三个维度结合转录组测序阐释SUV39h1对下肢血流灌注转归及人脐静脉内皮细胞功能表型的影响,并对其分子机制进行探讨。其次通过计算机模拟分子对接技术联合网络药理学来筛选靶向结合SUV39h1的小分子化合物,通过动物和细胞实验验证其对SUV39h1的表达及下肢血流灌注恢复的影响。上述研究旨在为CLI的临床治疗和药物筛选提供新思路。研究方法:第一部分实验,本研究首先通过结扎小鼠股动脉及其分支动脉构建小鼠下肢缺血模型,并利用激光多普勒血流灌注成像仪检测小鼠下肢血流灌注转归情况。其次对缺血下肢肌肉行HE染色和CD31免疫组织化学染色来评估肌纤维损伤和血管新生程度。最后通过下肢缺血小鼠腹腔注射SUV39h1抑制剂（毛壳素,chaetocin,0.25mg/Kg,1/日）观察SUV39h1表达变化对肌纤维损伤修复和血管新生的影响。第二部分实验,本研究首先通过Human Proteinatlas数据库中的m RNA表达模块查询SUV39h1 m RNA在血管系统相关细胞中的表达情况,锁定人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）为研究对象,然后通过转录组测序联合Metascape数据库在SUV39h1敲减的HUVEC上对表达差异基因进行功能聚类。在上述结果基础上,通过给予H2O2刺激,构建氧化应激下内皮细胞模型,探讨该条件对细胞增殖、凋亡、体外血管形成及线粒体膜电位的影响。为进一步探讨氧化应激条件下SUV39h1敲减对上述表型影响的发生机制,本研究进一步检测H2O2干预下的细胞自噬情况,将细胞自噬与上述细胞表型变化构建联系,然后在HUVEC上通过SUV39h1敲减联合雷帕霉素诱导自噬探索SUV39h1是否为诱导HUVEC发生自噬的重要基因。最后通过STRING数据库筛选与SUV39h1存在关联的分子,从细胞层次探讨H2O2刺激下SUV39h1影响上述生物学行为的具体分子机制。第三部分实验,本研究首先通过计算机模拟分子对接技术联合网络药理学等生物信息学手段筛选出能够与SUV39h1结合良好的小分子化合物（丹参多酚酸盐B）。其次给予下肢缺血模型小鼠腹腔注射丹参多酚酸盐B（15 mg/Kg,1/日）并通过细胞实验进行功能验证,旨在为CLI患者临床药物筛选提供思路。研究结果:第一部分实验,本研究首先在成功构建小鼠严重下肢缺血模型基础上,根据小鼠下肢血流灌注曲线的变化的特点,分别在术前、术后第4天和第16天采集小鼠下肢缺血侧腓肠肌,从m RNA和蛋白质表达两个角度发现,术前手术组和假手术组小鼠SUV39h1表达无差异,但术后第4天和第16天手术组小鼠较假手术组小鼠SUV39h1表达明显升高。上述两组小鼠术侧腓肠肌行HE染色显示,手术组小鼠较假手术组小鼠肌纤维轮廓不清且水肿较重,CD31免疫组织化学染色显示手术组小鼠新生血管数量较少。最后根据SUV39h1表达特点,我们使用chaetocin抑制手术小鼠SUV39h1表达发现,其下肢血流灌注在用药后明显改善,恢复速度明显快于未干预的手术小鼠。对小鼠腓肠肌行HE染色显示,chaetocin组小鼠缺血下肢肌纤维轮廓和水肿程度明显减轻,CD31免疫组织化学染色显示chaetocin组小鼠肌肉中新生血管数量显着增多。第二部分实验,Human Proteinatlas数据库中显示SUV39h1在HUVEC表达较高,提示HUVEC极有可能是SUV39h1影响血管新生的效应细胞。转录组测序结合Metascape数据库结果显示,在SUV39h1敲减的HUVEC中“血管发育（Vasculature development）”和“凋亡（Positive regulation of apoptotic process）”等与血管新生密切相关的生物学过程被高度富集,提示SUV39h1与血管新生关系紧密。接下来本研究在H2O2干预的HUVEC上发现,氧化应激可使SUV39h1蛋白水平表达升高,同时伴随细胞增殖、体外血管形成受阻、线粒体膜电位下降和凋亡增加。H2O2刺激下SUV39h1的敲减可部分恢复细胞增殖、血管形成能力、线粒体膜电位和一定程度上减轻H2O2诱导的细胞凋亡。同时发现H2O2的干预可使HUVEC自噬程度升高,在此基础上敲减SUV39h1可显着降低细胞自噬程度。进一步在SUV39h1敲减的内皮细胞模型上使用雷帕霉素诱导自噬发现,SUV39h1是诱导HUVEC自噬发生的重要基因。最后通过STRING数据库联合HUVEC细胞增殖和体外血管形成实验,本研究发现出核糖体RNA加工蛋白8（Ribosomal RNA Processing 8,RRP8）可作为SUV39h1上游调控因子参与上述生物学过程。第三部分实验,本研究首先通过计算机模拟分子对接联合网络药理学等生物信息学技术从小分子化合物库中筛选出诸多能与SUV39h1结合的化合物,并根据结合能高低对化合物进行排序。通过对丹参多酚酸盐B、安石榴苷和雷公藤红素等结合能排名前三的小分子化合物进行细胞实验验证后,本研究发现丹参多酚酸盐B较于其他两种化合物可显着降低SUV39h1表达。对下肢缺血小鼠腹腔注射丹参多酚酸盐B发现其在降低SUV39h1蛋白表达的同时,可显着改善肌纤维水肿和促进血管新生。最后本研究对HUVEC转染SUV39h1质粒,通过细胞增殖和体外血管形成实验验证了丹参多酚酸盐B通过降低SUV39h1表达促进了细胞增殖和血管形成。研究结论:第一部分实验结论:SUV39h1表达上调可抑制下肢缺血小鼠肌纤维的修复和血管新生。第二部分实验结论:抑制H2O2刺激下SUV39h1的表达上调可部分改善血管内皮细胞增殖和血管形成能力以及部分降低细胞凋亡、自噬水平。RRP8作为SUV39h1上游,参与上述生物学过程调控。第三部分结论:丹参多酚酸盐B可通过降低SUV39h1表达改善小鼠缺血下肢肌纤维损伤和血管新生。通过抑制SUV39h1表达,丹参多酚酸盐B可提高血管内皮细胞增殖及血管新生能力。
钱佳佳[5]（2021）在《基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制》文中研究说明目的:通过蛋白组学及网络药理学分析温经通络汤调控血管内皮细胞功能的多靶点信号网络,明确温经通络汤抑制血管新生的机制;基于ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型分析骨关节炎不同病理阶段软骨组织中血管新生特点,以及相关信号通路（VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT）表达特点,明确其与膝骨关节炎病理进程相关性;阐明温经通络汤调控血管新生干预膝骨关节炎的分子机制,为温经通络汤治疗膝骨关节炎提供实验依据。方法:（1）蛋白组学检测温经通络汤调控内皮细胞的多靶点信号机制:培养永生化人脐静脉内皮细胞,分为不同浓度温经通络汤含药血清及空白血清干预组,CCK8筛选温经通络汤含药血清抑制内皮细胞生长的最适浓度、划痕实验、Transwell及管腔形成实验检测最适浓度的温经通络汤含药血清调控内皮细胞增殖、迁移及管腔形成的作用。通过蛋白组学分析温经通络汤含药血清干预内皮细胞后与空白血清组间差异表达蛋白,并通过GO、KEGG富集分析筛选出与血管生成相关的富集度较高的信号通路及蛋白进行下一步研究。（2）网络药理学研究温经通络汤治疗膝骨关节炎作用靶点:通过网络药理学方法筛选出温经通络汤的有效成分和药物靶点,并探讨其治疗膝骨关节炎的作用靶点和信号通路,推测温经通络汤治疗膝骨关节炎的关键靶点。（3）前交叉韧带横断术（ACLT）诱导的小鼠膝骨关节炎模型病理特点研究:建立ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型,运用病理染色、免疫荧光、免疫组化、Western Blot、RT-PCR等实验方法,明确不同病理阶段血管新生情况及VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT通路与炎症、软骨退变（Mankin评分）的关系。（4）温经通络汤对膝骨关节炎小鼠的治疗作用及机制研究:建立膝骨关节炎小鼠模型,造模四周后给予不同浓度温经通络汤4周灌胃治疗,WB及免疫组化检测各组小鼠软骨炎症、软骨基质降解情况;RT-PCR及WB检测软骨中VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2及PI3K/AKT通路的变化规律,初步揭示温经通络汤调控血管生成的潜在分子机制。结果:（1）CCK8、划痕实验、Transwell及管腔形成实验结果表明4%温经通络汤含药血清干预脐静脉内皮细胞后,可显着延缓其增殖、迁移及管腔形成。蛋白组学分析结果显示温经通络汤含药血清及空白血清干预后,两组脐静脉内皮细胞中共有148种差异蛋白质,其中87个蛋白出现上调,61个蛋白下调。对这些差异蛋白进行GO和KEGG富集分析显示差异蛋白主要与血管内皮细胞迁移调控、血管生成正调控、凋亡过程负调控、细胞外基质结合、铁死亡等通路相关,并筛选出差异蛋白VEGF-A、VEGFR2进行验证。（2）通过韦恩图对温经通络汤药物预测靶点和骨关节炎疾病靶点进行映射,共得到温经通络汤治疗膝骨关节炎的131个共同作用靶点,筛选出其中38个关键靶点进行GO及KEGG富集分析,结果显示相关信号通路涉及炎症、免疫、代谢和血管新生等方面。其中与血管新生相关的通路包括HIF1信号通路、VEGF及PI3K-AKT等信号通路。（3）ACLT诱导的膝骨关节炎小鼠模型软骨退变程度呈时间依赖性,软骨基质降解和炎症反应与骨关节炎病变程度基本一致,VEGF-A/VEGFR2信号通路在ACLT模型的发生发展中起着重要作用。研究结果显示PI3K/AKT信号通路在该模型病理进程中呈现下降趋势,表明其可能通过其他途径参与膝骨关节炎病理进程。（4）温经通络汤可降低膝骨关节炎小鼠软骨中COL-X的表达,增加COL-Ⅱ表达（P<0.01）,从而延缓软骨基质降解;减少炎症介质COX2及iNOS表达（P<0.01）,延缓膝骨关节炎病理进程。初步明确温经通络汤可能通过VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2信号通路调控血管侵袭参与膝骨关节炎;温经通络汤可激活软骨中PI3K/AKT通路表达,表明PI3K/AKT信号通路可能通过其他途径参与调控膝骨关节炎进程,具体作用机制还有待进一步验证。结论:体外实验证实温经通络汤含药血清可抑制脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及管腔形成,从而抑制血管生成;蛋白组学技术及网络药理学分析结果表明温经通络汤含药血清可从血管内皮细胞迁移调控、血管生成正调控、凋亡过程负调控、细胞外基质结合、铁死亡等多通路多靶点抑制血管生成;CD31免疫荧光染色可清晰显示膝骨关节炎小鼠软骨组织中血管新生情况,VEGF-A/VEGFR2及PI3K/AKT通路通过不同途径参与调控膝骨关节炎病理进程;温经通络汤可通过调控VEGF-A/VEGFR2/ERK1/2及PI3K/AKT信号通路的表达,抑制血管新生,改善膝骨关节炎小鼠的软骨基质降解及炎症反应。
覃中杰[6]（2021）在《流体剪切力-材料表面化学共刺激对人脐静脉内皮细胞行为影响的研究》文中进行了进一步梳理目的:流体剪切力（FSS）联合材料表面化学官能团共同刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）,观察不同材料表面上HUVECs对梯度FSS的应答情况,探讨材料化学对细胞响应剪切力刺激的作用。方法:通过自组装单分子层技术在玻片表面分别制备末端基团为-OH、-CH3和-NH2的自组装单分子层,空白Glass玻片作为对照,通过检测材料表面水接触角对材料进行表征。将HUVECs分别接种于Glass、-OH、-NH2和-CH3组玻片表面,培养15分钟内检测ATP的释放量,1小时检测NO的释放量,1小时后Western blotting对内皮型一氧化氮合酶（e NOS）的表达进行测定,48小时后在激光共聚焦显微镜下观察HUVECs中黏着斑及细胞骨架的形成,BCA法测定总蛋白量。根据已有的平行板流动腔搭建剪切力刺激平台,将HUVECs分别接种于4组玻片表面,当细胞融合至80%时分别加载5dyn/cm2、15dyn/cm2、20dyn/cm2 FSS 1小时,加载剪切力15分钟内检测ATP的释放量;1小时检测NO的释放量。加载剪切力1小时后Western blotting检测e NOS的表达,BCA法测定总蛋白量。结果:通过水接触角的检测证明自组装单分子层技术成功制备了表面分别具有亲/疏水性适中的-NH2、强亲水性-OH和强疏水性-CH3化学官能团的材料。将HUVECs接种在Glass以及具有不同末端基团的玻片上,单纯材料表面化学刺激下各组内皮细胞各项应答无明显差异。与内皮细胞在Glass表面上细胞骨架和黏着斑对比:-NH2亲水性和疏水性适中,内皮细胞在-NH2玻片上形成了黏附质量最佳的细胞骨架和黏着斑;-OH基团具有强亲水性,-CH3基团具有强疏水性,均不利于细胞黏附,-OH和-CH3玻片上形成了黏附质量相对较差的细胞骨架和黏着斑。在已有的平行板流动腔装置的基础上成功搭建了剪切力刺激平台。加载梯度FSS于材料表面化学共同刺激内皮细胞后发现,LFSS（5dyn/cm2）没有引起Glass和-NH2上的内皮细胞产生应答,但是低剪切力引起了-OH和-CH3的强烈应答;PFSS（15dyn/cm2）和HFSS（20dyn/cm2）引起了所有组细胞的应答,其中-NH2组的应答水平最强烈,其次为Glass组,-OH与-CH3组应答水平相当且处于最低状态。-OH和-CH3组在FSS梯度刺激时,LFSS时应答最强烈,其次PFSS,最弱为HFSS。结论:材料表面化学官能团通过影响HUVECs在材料表面形成的黏着斑和细胞骨架的质量,改变了HUVECs响应FSS刺激的起始阈值和使细胞产生最佳应答的剪切力阈值,从而使内皮细胞对剪切力刺激的应答状态发生改变。HUVECs上黏着斑和细胞骨架可能是材料表面化学刺激与物理剪切力刺激的共同作用位点。
张昭远[7]（2020）在《定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用》文中研究指明目的:优化富白细胞富血小板血浆（L-PRP）和纯富血小板血浆（P-PRP）的离心方案,并观察通过不同血小板膜受体选择性激活的富血小板血浆释放的生长因子对肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞增殖、迁移、分化的影响,初步探究其机制。方法:取76例志愿者外周血样（45 mL）与5mL输血用枸橼酸钠注射液混匀,采用两次离心法制备L-PRP。计算并比较实验组A（12例,400×g、10 min,1100×g、10 min）、实验组B（27例,800×g、10min,1100×g、10 min）及对照组（37例,1360×g、10 min,1360×g、10 min）离心方案的L-PRP血小板富集系数及回收率和白细胞富集系数。将此离心方案应用于大鼠PRP的制备,计算大鼠PRP的血小板富集系数及回收率。探索并调整P-PRP的第一次离心及第二次离心的离心力及离心时间,并取28例志愿者外周血（45 mL+5mL输血用枸橼酸钠注射液）验证研究过程中获得的最适宜的P-PRP的离心条件:260g、10min,360g、15min。大鼠肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞在37℃、5%CO2环境下分别加入由TFLLR-NH2（PAR-1组）、AYPGK-NH2（PAR-4组）和凝血酶（凝血酶组）激活PRP后离心提取的上清液。通过细胞增殖实验检测各组肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖能力;通过细胞迁移试验观察各组肌腱干细胞和人脐静脉内皮细胞的迁移能力;通过q PCR检测各组肌腱干细胞干性（Oct-4、Nanog）和分化（腱系分化:Scx;非腱系分化:PPARγ、Sox9、Collagen II、Runx2、Collagen Iα1、DCN、TNC）相关基因的表达水平。通过油红O、茜素红S染色,观察各组肌腱干细胞成脂、成骨的分化情况。结果:剔除异常血样后（血小板回收率高于100%或出现白色血栓）,剩余55例纳入统计分析,其中实验组A 10例,实验组B 21例,对照组24例。实验组B血小板富集系数和血小板回收率显着高于实验组A和对照组,差异有统计学意义;实验组A和对照组的组间比较差异无统计学意义。实验组A、B和对照组的白细胞富集系数差异没有统计学意义。260g、10min,360g、15min条件下制备的P-PRP,血小板回收率为52.30±15.72%,血小板富集系数为5.230±1.572,白细胞富集系数为1.145±0.650。与凝血酶组相比,PAR-1组对肌腱干细胞进而血管内皮细胞的增殖和迁移有显着地促进作用,而PAR-4的作用则正相反;4天后,各组的肌腱干细胞的增殖趋势减弱。通过PAR1激活的PRP对促进肌腱干细胞成脂、成软骨分化的趋势明显,且成脂分化的趋势在较早期（7天）即可表现出来;通过PAR4激活的PRP具有较强的保持肌腱干细胞干性的作用;同时,凝血酶激活的PRP也可表现出抑制肌腱干细胞正常分化的趋势。并且,14天后,PAR1组的肌腱干细胞的油红O染色呈阳性。结论:两次离心法（800×g、10 min,1100×g、10 min）是一种较为理想且可行的L-PRP制备方案;两次离心法（260×g、10 min,360×g、15 min）是一种较为理想且可行的P-PRP制备方案。在肌腱损伤后的24-48小时（早期）,可以注射通过PAR1受体选择性激活血小板的PRP,以促进血管增生和肌腱干细胞增殖、迁移;在肌腱损伤后5-6周（晚期）,可以注射通过PAR4受体选择性激活血小板的PRP,可抑制血管增生并抑制肌腱干细胞分化,避免肌腱病的发生。
邢彦彦[8]（2020）在《猪膀胱脱细胞基质膜在大鼠卵巢自体移植中的应用与研究》文中认为由于恶性肿瘤发病率逐年增加,发病年龄逐渐降低以及推迟生育年龄等原因,对生育力保存的需求急剧增加。相较于卵子和胚胎冻存,卵巢组织冻存后移植能够恢复卵巢内分泌功能和生育能力,并允许多个周期受孕,是目前最有希望的女性生育力保存方法,卵巢组织冷冻保存和移植获得的婴儿诞生,是人类生殖医学的里程碑,之后,各地相继有卵巢组织移植后婴儿出生的报道,并在近两年呈指数增加,迄今为止,全世界共有约130余例婴儿由卵巢组织冷冻移植后诞生。许多学者认为卵巢组织移植可作为一种行之有效的技术应用。卵巢组织冷冻有程序化冷冻和玻璃化冷冻两种方法。程序化冷冻已在临床上用于卵子和胚胎冷冻30余年。玻璃化冷冻在卵巢组织冷冻中是否优于程序化冷冻目前尚无定论,然而其用于卵子和胚胎冷冻的优越性已经被证明。由于玻璃化冷冻具有不需要昂贵仪器、冷冻过程中无冰晶形成等优点,有光明的应用前景。在过去的十年中,许多实验研究了不同的动物模型如狗、山羊、大鼠、小鼠等卵巢组织冷冻移植情况,然而,研究结果具有较大差异,基于这些实验结果,很难估计玻璃化冷冻过程造成的卵巢组织损伤程度。除物种差异外,移植物的大小、冷冻保护剂的选择等均会对移植效果产生影响。现有的关于冷冻及移植过程中卵泡丢失率的报道结果相差悬殊,缺乏详细分析。文献报道,相较于卵巢组织冷冻复苏,卵巢组织移植过程中可能丢失的卵泡更多,其原因主要为移植物在血供重新建立前缺血缺氧,然而在卵巢移植过程中卵泡丢失的具体程度仍缺乏详尽分析。卵巢组织移植较其他生育力保存方法有不可替代的优越性,因此,有良好的临床应用前景。然而,卵巢移植过程中的大量卵泡丢失,严重制约卵巢移植技术的发展。因此,如何促进新生血管形成,及早恢复移植物血供,是移植成功的关键。猪膀胱脱细胞基质膜（Urinary Bladder Matrix,UBM）是细胞外基质膜（Extracelluar Matrix,ECM）的一种,具有完整的活体组织细胞外基质的三维超微结构,以及生长因子、糖胺聚糖、粘连蛋白等生物活性成分,其中确认与组织粘附、促结合、抗凋亡、促增殖的成分有42种,目前已在临床上用于皮肤、脂肪、肌肉等组织的修复。干细胞在缺血及损伤性疾病的治疗中应用广泛。研究表明,干细胞能够促进血管形成和组织修复。脂肪间充质干细胞来源方便、增殖力强,不具有成瘤性,使用安全。近年来,有数篇关于干细胞用于卵巢移植的研究。这些研究证实,脂肪间充质干细胞在改善卵巢移植效果方面有良好的应用前景。然而,移植后的干细胞存活率较低,这阻碍了干细胞治疗技术的推广和应用。有文献研究表明,应用合适的生物支架可以提高干细胞存活率。而UBM能促进干细胞增殖和分化,我们尝试将干细胞接种在UBM上后用于大鼠卵巢自体移植,验证应用UBM是否会增加脂肪间充质干细胞的作用,进一步改善卵巢移植效果。第一部分大鼠卵巢玻璃化冷冻及自体移植对卵巢组织的影响目的:观察大鼠卵巢玻璃化冷冻复苏及自体移植过程对卵巢组织的影响,探讨冷冻和移植操作对卵巢产生影响的作用机制。方法:SD雌性大鼠随机分为正常对照组、冷冻组、移植组,移植组大鼠将两侧卵巢组织取出,一分为二分别移植于同侧肾背膜下,冷冻组将大鼠卵巢组织玻璃化冷冻复苏,将各组卵巢组织石蜡切片并HE染色,观察卵泡形态并卵泡计数;采用Tunel荧光染色技术,观察细胞凋亡情况;免疫组化方法观察各组VEGF阳性面积比。结果:正常对照组、冷冻组及移植组分别计数卵泡1231、1077、575个,移植组减少明显,移植组形态异常卵泡数较正常对照组增加明显（P<0.05）。凋亡检测中,冷冻组和移植组凋亡率较正常对照组显着增加（P<0.05）。VEGF在3组卵巢组织中均有表达,但冷冻组及移植组表达较正常对照组减少,差异有统计学意义。结论:卵巢组织冷冻或自体移植过程中均伴有卵泡丢失、VEGF表达下降。提高移植卵巢组织的VEGF表达,可能对促进移植物血管形成、提高卵巢移植效率有积极作用。第二部分UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用目的:验证UBM能促进移植卵巢新生血管形成,减少移植组织卵泡数量的丢失,改善移植效果,探讨其促进血管生成的作用机制。方法:1.8周龄SD大鼠行卵巢自体移植,根据术中处理方法不同分为5组:正常对照组、自体移植组、自体移植+UBM（UBM组）、自体移植+VEGF组（VEGF组）、去势组,其中,正常对照组用于卵泡计数比较,去势组仅用于血清激素水平比较。在自体移植后28天,行卵巢组织HE染色,观察细胞形态、卵泡计数;术后28天,ELISA测定血清FSH、AMH水平;分别于移植后7天和28天CD31染色,观察血管生成情况;自体移植后7天,Tunel及Masson染色观察凋亡和纤维化情况。2.将第3代人脐静脉内皮细胞分为对照组和UBM组,分别接种在六孔板上,UBM组预先将UBM铺在六孔板底,观察细胞增殖情况,并于接种后第1、3、5天行CCK8实验,检测细胞增殖情况;同时进行Western-blot和RT-PCR检测,探讨UBM体外促进血管生成的作用机制。3.8周龄SD大鼠行卵巢自体移植术,依据术中处理方法不同分为自体移植组和自体移植+UBM组（UBM组）,卵巢自体移植后7天,微血管CT成像比较两组移植卵巢血管生成情况,取出卵巢组织,行Western-blot和RT-PCR检测,探讨UBM在体内促进血管生成的作用机制。结果:1.自体移植组、UBM组、VEGF组卵泡均较正常对照组减少,（P<0.05）;UBM组原始卵泡及生长卵泡数量较单纯移植组均增加;UBM组FSH显着低于自体移植组及VEGF组（P<0.05）,AMH激素水平测定结果同FSH基本一致;同单纯移植组及VEGF组相比,UBM组CD31阳性表达率显着增加（P<0.05）;Tunel染色显示,与单纯移植组相比,UBM组、VEGF组凋亡细胞均减少（P<0.05）,且UBM组凋亡率最低,差异有统计学意义（P<0.05）;Masson染色结果:与单纯移植组相比,UBM组、VEGF组相对纤维化明显减少,且UBM组纤维化面积最小,差异有统计学意义（P<0.05）。2.CCK8实验:人脐静脉内皮细胞在UBM上增殖与对照组相比无统计学差异（P>0.05）;Western-blot和RT-PCR结果提示,UBM组人脐静脉内皮细胞KDR、Notch1、Ang2表达增加;术后7天,Western-blot和RT-PCR结果提示,UBM组KDR、Notch1、Ang2表达增加。体内和体外实验均表明,UBM上调KDR、Notch1、Ang2表达,促进血管形成。结论:UBM通过上调KDR、Notch1、Ang2表达,激活血管生成信号通路,通过促进血管形成改善卵巢移植效果,值得进一步研究和推广。第三部分脂肪间充质干细胞联合UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用目的:验证脂肪间充质干细胞能促进移植卵巢新生血管形成,改善移植效果;证明应用脂肪间充质干细胞联合UBM能进一步改善卵巢移植效果。方法:1.分离并制备大鼠脂肪间充质干细胞,经成脂、成骨实验鉴定其有多向分化的能力,通过流式细胞技术对其表面抗原进行测定。2.SD大鼠行卵巢自体移植,根据术中处理方法不同分为5组:正常对照组、自体移植组、自体移植+ADMSCs组（ADMSCs组）、自体移植+ADMSCs组+UBM组（联合组）、去势组,其中,正常对照组用于卵泡计数比较,去势组仅用于血清激素水平比较。在自体移植后28天,行卵巢组织HE染色,观察细胞形态、卵泡计数;术后28天,ELISA测定血清FSH、AMH水平;分别于移植后7天和28天CD31染色,观察血管生成情况;自体移植后7天,Masson染色观察纤维化情况。结果:1.成功制备大鼠脂肪间充质干细胞。2.同单纯移植组相比,ADMSCs组原始卵泡及生长卵泡数量均增加显着（P<0.05）,联合组原始卵泡数及生长卵泡个数较ADMSCs组均增加,差异有统计学意义（P<0.05）;同自体移植组相比,ADMSCs组及联合组FSH水平显着均降低（P<0.05）,AMH激素水平测定结果同FSH基本一致;CD31结果提示:ADMSCs组、联合组新生血管数量均较单纯移植组增加;Masson染色结果:联合组纤维化面积较单纯移植组减少明显,差异有统计学意义。结论:应用脂肪间充质干细胞可改善卵巢移植效果,UBM可促进脂肪间充质干细胞在移植部位的附着、定植,ADMSCs联合UBM可显着增加移植卵巢组织血供。
黄磊[9]（2020）在《含铜硫酸钙材料生物学性能及促血管和骨修复相关实验研究》文中认为研究目的血管生成在生物体内损伤修复起着重要的作用。已有动物实验证实硫酸铜能促进角膜血管生成。同时硫酸钙也能促进胫骨骨缺损周围血管形成。另外含铜生物陶瓷材料证实具备促成骨效应。于是本实验制备硫酸铜及硫酸钙复合材料,旨在验证复合材料理化表征及促血管和骨修复效应。方法1、含铜硫酸钙胶合剂的制备、物理表征及体外降解实验通过按照固定固液比例物理混合α-半水硫酸钙粉末和不同浓度的五水硫酸铜溶液,通过制模得到圆柱状含铜硫酸钙复合材料样品。检测材料表征及了解体外降解特性。2、含铜硫酸钙骨水泥对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及骨髓间充质干细胞（BMSCs）增值分化、迁移的影响按照国际标准制备不同浓度复合材料浸提液,以浸提液干预HUVECs及BMSCs,通过CCK-8实验检测细胞增值能力;划痕实验及成管实验检测浸提液对HUVECs迁移和成管能力;PCR（Qrt-PCR）检测相关血管基因（VEGF/HIF-1α/eNOS）和相关成骨分化基因（OCN、ALP、RUNX2 及 BSP）表达;细胞免疫荧光检测相关蛋白（VEGF/HIF-1α）表达;茜素红染色检测浸提液对BMSCs矿化的影响。3、复合材料对大鼠胫骨临界性骨缺损处血管生成及骨修复实验研究对SD大鼠胫骨上端造成临界性骨缺损模型,填充一定浓度的含铜硫酸钙及单纯硫酸钙材料,6周后通过MicroCT对血管造影和骨重建及组织形态学方法,评估含铜硫酸钙复合材料对血管形成及骨修复的效果。结果1、SEM观察材料可见硫酸铜含量越高,表面板状二水硫酸钙结构越明显。复合材料抗压强度随着铜浓度的升高逐渐升高,材料在前三周时降解最快。2、CCK-8实验证明低浓度铜的浸提液对HUVECs及BMSCs有促进增值作用,而高浓度铜浸提液对细胞出现毒性。细胞划痕实验和成管实验表明材料浸提液对内皮细胞有迁移和成管作用。随着铜浓度的升高,相关血管基因（VEGF/HIF-1α）表达明显增加,细胞荧光结果同样证明,而对eNOS基因表达有一定促进作用,但组间不明显;而相关成骨基因表达出现减弱。茜素红实验证明随着铜离子逐渐升高,相对应细胞矿化逐渐减弱。3、血管造影的Micro-CT和CD31免疫组化显示含铜硫酸钙与单纯硫酸钙和空白对照组相比,6周后胫骨骨缺损处血管数量增多;而骨修复能力减弱,但比空白组增强。结论1、低浓度含铜硫酸钙对HUVECs及BMSCs有增值效应,高浓度含铜硫酸钙对细胞有毒性作用,但能促进相关血管基因表达,同时抑制成骨相关基因表达。2、含铜硫酸钙复合材料明显促进SD大鼠胫骨上端骨缺损处血管增生效应,而骨修复能力减弱。
曹百川,曾高峰,高云兵,邓贵营,岑忠喜,张传阳,郭彦德,宗少晖[10]（2020）在《热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化》文中进行了进一步梳理背景:目前关于间充质干细胞向内皮细胞分化的研究,多采用细胞因子或2种细胞共培养的方法进行诱导,热休克处理的内皮细胞诱导间充质干细胞向内皮细胞分化尚未见报道。目的:观察热休克处理的人脐静脉内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的能力,并探究诱导骨髓间充质干细胞形成血管的能力。方法:将热休克处理后的人脐静脉内皮细胞与人骨髓间充质干细胞体外非接触共培养,诱导14 d后采用流式细胞仪和免疫荧光检测骨髓间充质干细胞中CD144、CD31、VEGFR2、v WF表型的表达;将诱导14 d后的骨髓间充质干细胞、未诱导的骨髓间充质干细胞移植到裸鼠皮下,14 d后取移植物做苏木精-伊红染色,观察体内血管形成能力;Matrigel成血管实验观察诱导14 d后的骨髓间充质干细胞和未诱导的骨髓间充质干细胞的体外血管生成能力。结果与结论:①共培养后骨髓间充质干细胞形态改变,呈类似铺路石状排列,流式细胞仪及细胞免疫荧光结果显示共培养后骨髓间充质干细胞VEGFR2、CD31、CD144、v WF表达增加;②体内移植物苏木精-伊红染色显示诱导后的骨髓间充质干细胞排列较对照组规律,有成血管倾向;③体外Matrigel成血管实验显示诱导后骨髓间充质干细胞成血管能力较对照组有所增加;④结果表明,与热休克处理的人脐静脉内皮细胞共培养能促进人骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,内皮细胞特异性表型转化较明显,具有一定血管形成倾向。
二、人脐静脉内皮细胞重建成功（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人脐静脉内皮细胞重建成功（论文提纲范文）
（2）脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 脂肪细胞来源外泌体介导的内皮间质转化在糖尿病血管再狭窄中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 脂肪细胞来源外泌体在血管新生中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| SCI论文Ⅰ |
| SCI论文Ⅱ |
| SCI论文Ⅲ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）类外泌体纳米囊泡与外泌体在提高脂肪移植存活率的比较研究（论文提纲范文）
| 附录一 英文缩写词汇表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 脂肪组织 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器及器械 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 各种溶液的配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 人脂肪干细胞获取、培养、诱导及鉴定 |
| 2.2 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的提取、鉴别及分析 |
| 2.3 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的体外实验 |
| 2.4 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的体内实验 |
| 2.5 资料及数据统计分析 |
| 结果 |
| 1 人脂肪干细胞获取、培养、诱导及鉴定 |
| 1.1 人脂肪来源干细胞 |
| 1.2 人脂肪来源干细胞的成脂成骨分化诱导检测 |
| 1.3 人脂肪来源干细胞表面标记物鉴定 |
| 2 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的提取、鉴别及分析 |
| 2.1 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体提取 |
| 2.2 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体透射电镜检测 |
| 2.3 纳米流式分析NVs和 EXOs的表面分子标记物 |
| 2.4 NVs和 EXOs纳米追踪分析(NTA)检测 |
| 2.5 NVs和 EXOs的 zeta电位检测 |
| 2.6 相同细胞数产生的NVs和 EXOs总蛋白含量和颗粒数的比较 |
| 3 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的体外实验 |
| 3.1 NVs和 EXOs的体外示踪实验 |
| 3.2 CCK-8 法检测不同浓度的NVs和 EXOs对人脐静脉内皮细胞的增殖能力的影响 |
| 3.3 划痕实验检测不同浓度的NVs和 EXOs对人脐静脉内皮细胞的迁移能力的影响 |
| 3.4 血管形成实验检测不同浓度的NVs和EXOs对人脐静脉内皮细胞的血管形成能力的影响 |
| 4 人脂肪干细胞来源类外泌体纳米囊泡和外泌体的体内实验 |
| 4.1 脂肪移植裸鼠模型的大体观察 |
| 4.2 移植脂肪组织重量和体积的测量与比较 |
| 4.3 移植脂肪组织HE染色 |
| 4.4 移植脂肪组织的免疫组化分析 |
| 讨论 |
| 1 人脂肪间充质干细胞及其来源NVs和 EXOs的特性和鉴定 |
| 2 NVs和 EXOs在细胞水平的验证及其发挥作用的有效浓度 |
| 3 NVs和 EXOs在动物水平的验证及其机制探索 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 类外泌体纳米囊泡与外泌体在提高脂肪移植存活率的比较研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）小鼠甲基化转移酶SUV39h1在下肢缺血损伤和血管新生中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一部分 探讨SUV39h1 对小鼠缺血下肢血流灌注影响 |
| 引言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 探讨SUV39h1 对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡、血管形成和自噬的影响 |
| 引言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 基于计算机模拟分子对接技术和网络药理学探索下调SUV39h1 表达的小分子化合物 |
| 引言 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 全文总结 |
| 综述 表观遗传学对外周血管性疾病转归的研究进展 |
| 1.PAD流行病学现状 |
| 2.表观遗传学对外周血管性疾病转归的研究进展 |
| 3.总结 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的文章 |
| 致谢 |
（5）基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 膝骨关节炎的治疗与研究进展(文献研究) |
| 1. 现代医学对膝骨关节炎的治疗进展 |
| 1.1 骨关节炎的发病机制 |
| 1.2 骨关节炎的危险因素 |
| 1.3 骨关节炎的治疗进展 |
| 2. 传统医学治疗膝骨关节炎的研究进展 |
| 2.1 中医对膝骨关节炎病因病机的认识 |
| 2.2 膝骨关节炎的中医辨证施治研究现状 |
| 2.3 温经通络法治疗膝骨关节炎的研究现状 |
| 第二部分 靶向抑制血管侵袭治疗骨关节炎的理论基础及研究现状(文献研究) |
| 1 血管生成在骨关节炎发病中的作用 |
| 1.1 血管生成与VEGF |
| 1.2 VEGF信号异常在骨关节炎中的作用研究 |
| 2. 靶向抑制血管生成治疗骨关节炎研究现状 |
| 2.1 靶向抑制血管生成调控骨关节炎的实验研究 |
| 2.2 靶向抑制血管生成调控骨关节炎的临床研究 |
| 第三部分 温经通络汤对永生化人脐静脉内皮细胞功能的调控作用 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 人脐静脉永生化内皮细胞 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 温经通络汤含药血清制备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 永生化人脐静脉内皮细胞的培养 |
| 2.2 CCK8检测永生化人脐静脉内皮细胞增殖情况 |
| 2.3 划痕实验观察永生化人脐静脉内皮细胞增殖情况 |
| 2.4 Transwell实验观察永生化人脐静脉内皮细胞迁移情况 |
| 2.5 管腔形成实验 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 CCK8检测不同浓度温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)增殖的影响 |
| 3.2 划痕实验观察4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)迁移的影响 |
| 3.3 Transwell细胞迁移实验观察4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)迁移的影响 |
| 3.4 4%温经通络汤含药血清对永生化人脐静脉内皮细胞(IHUVEC)管腔形成能力的作用 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四部分 基于蛋白组学研究温经通络汤对永生化人脐静脉内皮细胞的调控作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 细胞培养及干预 |
| 2.2 蛋白质提取 |
| 2.3 电泳 |
| 2.4 TMT标记 |
| 2.5 蛋白质谱分析 |
| 2.6 数据分析 |
| 2.7 生信分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 含药血清和空白血清干预后两组细胞差异蛋白比较 |
| 3.2 Gene Ontology(GO)富集分析 |
| 3.3 KEGG通路富集分析 |
| 3.4 亚细胞定位分析 |
| 3.5 结构域注释及富集分析 |
| 3.6 聚类分析 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第五部分 网络药理学研究温经通络汤治疗膝骨关节炎的作用机制 |
| 1. 实验方法 |
| 1.1 温经通络汤主要活性成分及基因靶点的查询与筛选 |
| 1.2 膝骨关节炎疾病的相关靶点筛选 |
| 1.3 温经通络汤治疗膝骨关节炎靶标网络构建 |
| 1.4 PPI蛋白质相互作用网络构建及核心基因筛选 |
| 1.5 GO功能与KEGG通路富集分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 温经通络汤有效成分的筛选 |
| 2.2 温经通络汤治疗KOA靶点的韦恩图 |
| 2.3 药物活性成分-疾病靶点网络构建 |
| 2.4 温经通络汤治疗膝骨关节炎的靶点蛋白相互作用分析 |
| 2.5 温经通络汤治疗膝骨关节炎的GO富集分析 |
| 2.6 温经通络汤治疗膝骨关节炎的KEGG通路富集分析 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 第六部分 ACLT模型鼠术后不同病理阶段血管生成及相关信号通路的变化情况 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 动物分组 |
| 1.3 试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 前交叉韧带横断手术诱导的膝骨关节炎模型构建 |
| 2.2 化学染色分析骨关节炎病变程度 |
| 2.3 免疫组化分析ADAMTS5及COL- Ⅱ表达情况 |
| 2.4 免疫荧光分析CD31阳性表达情况 |
| 2.5 Western blot检测COX2、iNOS、VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT通路表达情况 |
| 2.6 RT-PCR检测VEGF-A、VEGFR-2、ADAMTS5及Ⅱ型胶原表达情况 |
| 2.7 Elisa检测血清中IL-6,TNF-a,IL-1β,COMP表达 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 术后不同时间各组H-E及Safranin-O染色结果 |
| 3.2 术后不同时间各组小鼠血清COMP表达情况 |
| 3.3 术后不同病理阶段软骨及循环血中炎症因子表达情况 |
| 3.4 术后不同病理阶段软骨ADAMTS5和COL-Ⅱ表达特点 |
| 3.5 术后不同病理阶段软骨中血管生成情况 |
| 3.6 术后不同病理阶段软骨中VEGF-A/VEGFR2信号通路表达规律 |
| 3.7 术后各病理阶段PI3K/AKT通路在软骨中的表达变化 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第七部分温经通络汤调控VEGF-A/VEGFR2相关通路介导的血管生成干预膝骨关节炎进程的作用研究 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 动物分组 |
| 1.3 药物制备 |
| 1.4 试剂及仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HE染色分析骨关节炎病变程度 |
| 2.2 Western blot检测软骨COX2、iNOS、COL-X、VEGF-A/VEGFR2、PI3K/AKT、ERK1/2通路蛋白表达情况 |
| 2.3 RT-PCR检测软骨中VEGF-A/VEGFR2信号通路表达情况 |
| 2.4 免疫组化检测软骨COL-Ⅱ表达情况 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 温经通络汤延缓膝骨关节炎小鼠病理进程作用 |
| 3.2 温经通络汤调控膝骨关节炎小鼠软骨基质中COL-Ⅱ及COL-X的作用 |
| 3.3 温经通络汤调控膝骨关节炎小鼠软骨基质中炎症介质INOS及COX-2的作用 |
| 3.4 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织VEGF-A/VEGFR2信号通路表达的影响 |
| 3.5 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织ERK1/2信号通路表达的影响 |
| 3.6 温经通络汤对膝骨关节炎小鼠软骨组织PI3K/AKT信号通路表达的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 结语 |
| 1. 结论 |
| 2. 创新之处 |
| 3. 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）流体剪切力-材料表面化学共刺激对人脐静脉内皮细胞行为影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验1:材料表面化学自组装单分子层材料的制备与表征 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 自组装单分子层技术制备材料 |
| 1.3 结果分析 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 实验2:材料表面化学刺激对人脐静脉内皮细胞行为的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 数据处理 |
| 2.4 结果分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 实验3:材料表面化学联合F=5dyn/cm~2(LFSS)刺激对HUVECs为的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 数据处理 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 实验4:材料表面化学联合F=15dyn/cm~2(PFSS)刺激对HUVECs影响的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 实验5:材料表面化学联合F=20dyn/cm~2(HFSS)刺激对HUVECs影响的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 数据处理 |
| 5.4 结果分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 材料表面化学联合剪切力刺激对HUVECs行为影响的讨论与综合分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料表面化学联合流体剪切力共同刺激对HUVECs行为影响的结果 |
| 6.3 结果分析与讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 血管内皮细胞中黏着斑与细胞骨架介导的流体剪切力转导的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 应用不同离心条件优化富血小板血浆制作方案研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 PRP制备方法 |
| 2.1.4 观测指标 |
| 2.1.5 统计学方法 |
| 2.1.6 机构伦理问题 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 L-PRP制备条件探索 |
| 2.2.2 P-PRP制备条件探索 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 全血离心后,血小板与白细胞的分布情况 |
| 2.3.2 影响PRP成品质量的重要因素 |
| 2.3.3 离心条件设定 |
| 2.3.4 影响PRP成品质量的其他因素 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 定制化富血小板血浆在肌腱病修复中的应用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.1.4 实验器械 |
| 3.1.5 主要液体配制 |
| 3.1.6 qRT-PCR引物设计 |
| 3.1.7 实验分组 |
| 3.1.8 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大鼠PRP血小板回收率及血小板富集系数测试 |
| 3.2.2 大鼠肌腱干细胞的鉴定 |
| 3.2.3 选择性激活血小板释放的细胞因子对肌腱干细胞增殖与迁移的影响 |
| 3.2.4 选择性激活的血小板释放的生长因子对肌腱干细胞分化的影响 |
| 3.2.5 选择性激活的血小板释放的生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖与迁移的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间已发表或录用的论文 |
（8）猪膀胱脱细胞基质膜在大鼠卵巢自体移植中的应用与研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分 大鼠卵巢组织玻璃化冷冻及自体移植对卵巢组织的影响 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 脂肪间充质干细胞联合UBM在大鼠卵巢自体移植中的作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 女性生育力保存研究进展 |
| 参考文献 |
| 论文发表与获奖情况 |
| 致谢 |
（9）含铜硫酸钙材料生物学性能及促血管和骨修复相关实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新型含铜硫酸钙复合材料的制备、物理表征及体外降解实验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 不同浓度含铜硫酸钙对人脐静脉内皮细胞增殖分化及迁移的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 不同浓度含铜硫酸钙对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 含铜硫酸钙对大鼠胫骨骨缺损处促血管及骨修复的实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 标本试剂的配制 |
| 3 实验分组及方法 |
| 4 血管Microfil灌注和分析 |
| 5 标本的采集与处理 |
| 6 统计学方法 |
| 7 结果 |
| 8 讨论 |
| 9 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩写词汇词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（10）热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化（论文提纲范文）
| 文章快速阅读： |
| 文题释义： |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 时间及地点 |
| 1.3 材料 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞的培养和鉴定 |
| 1.4.2 热休克人脐静脉内皮细胞与人骨髓间充质干细胞体外共培养 |
| 1.4.3 诱导的人骨髓间充质干细胞表型鉴定 |
| 1.4.4细胞免疫荧光鉴定诱导的人骨髓间充质干细胞表型表达诱导 |
| 1.4.5 体外Matrigel成血管实验 |
| 1.4.6体内成血管实验 |
| 1.5 主要观察指标 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定 |
| 2.2 诱导后人骨髓间充质干细胞形态与免疫表型表达 |
| 2.3 诱导后人骨髓间充质干细胞免疫荧光检测结果 |
| 2.4 Matrigel体外成管实验结果 |
| 2.5 体内成血管移植物苏木精-伊红染色结果 |
| 3 讨论Discussion |
四、人脐静脉内皮细胞重建成功（论文参考文献）
- [1]多细胞构建血管化组织工程骨在骨修复中的应用[J]. 赵豆豆,林开利. 中国组织工程研究, 2022
- [2]脂肪细胞来源外泌体在糖尿病动脉粥样硬化疾病中的作用及机制研究[D]. 陈芳芳. 山东大学, 2021(10)
- [3]类外泌体纳米囊泡与外泌体在提高脂肪移植存活率的比较研究[D]. 陈爱贞. 福建医科大学, 2021(02)
- [4]小鼠甲基化转移酶SUV39h1在下肢缺血损伤和血管新生中的作用和机制研究[D]. 牛文豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [5]基于蛋白组学研究温经通络汤调控血管新生治疗膝骨关节炎的作用机制[D]. 钱佳佳. 南京中医药大学, 2021(01)
- [6]流体剪切力-材料表面化学共刺激对人脐静脉内皮细胞行为影响的研究[D]. 覃中杰. 西南医科大学, 2021(01)
- [7]定制化富血小板血浆及其在肌腱病修复中的应用[D]. 张昭远. 上海交通大学, 2020(01)
- [8]猪膀胱脱细胞基质膜在大鼠卵巢自体移植中的应用与研究[D]. 邢彦彦. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]含铜硫酸钙材料生物学性能及促血管和骨修复相关实验研究[D]. 黄磊. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]热休克内皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 曹百川,曾高峰,高云兵,邓贵营,岑忠喜,张传阳,郭彦德,宗少晖. 中国组织工程研究, 2020(19)
标签：内皮细胞论文; 糖尿病论文; 脂肪细胞论文; 主动脉粥样硬化论文; 胰岛素抵抗综合征论文;