一、实验性暴发性肝功衰竭大鼠肝再生与一氧化氮的关系（论文文献综述）
王永娟[1]（2021）在《LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究》文中认为急性肝衰竭（ALF）是一种罕见而严重的疾病,威胁着人类的健康。肝移植是治疗ALF最有效的方法。然而,由于供体器官缺乏、价格高昂等因素导致肝移植应用受限。因此,寻找治疗ALF的新方法迫在眉睫。肝细胞坏死导致肝脏募集大量的炎症细胞,进而引发全身炎症反应综合征（SIRS）为ALF的病理机制之一。因此,抑制炎症反应是治疗ALF的关键。小分子多肽LR12能够抑制髓样细胞表达触发受体1（TREM-1）的激活,对多种炎症疾病具有治疗作用。然而,LR12在ALF中的作用尚不清楚。肝再生不足以代偿肝细胞坏死,导致肝功能缺失,进而引发多器官功能衰竭是ALF的病理机制之一。肝脏是一个具有强大再生能力和显着调节最终质量能力的器官。以往的研究表明,肝再生是ALF存活的关键因素。然而,LR12是否能够促进肝再生尚不清楚。本研究建立了TAA诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF小鼠肝脏损伤的作用及肝再生的作用;通过体外建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,探讨LR12促进肝细胞再生的机制;本研究通过细胞因子芯片技术筛选出LR12作用于巨噬细胞促进肝再生的关键因子,并通过体外和体内实验进一步验证。本课题主要包括以下四部分:第一部分LR12减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生目的:本研究旨在建立硫代乙酰胺（TAA）诱导的ALF小鼠模型,观察LR12对ALF的治疗作用。方法:1.腹腔注射TAA建立ALF小鼠模型。实验分组:对照组、TAA组、LR12组及TAA+LR12组。2.苏木素-伊红（H&E）染色检测肝脏病理变化。赖氏法检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的含量。3.观察TAA组和TAA+LR12组小鼠的存活率。4.Western blot方法检测小鼠肝脏中PCNA的表达。5.激光共聚焦（CLSM）方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志角蛋白18（CK18）与增殖指标增殖细胞核抗原（PCNA）的共定位及表达情况。结果:1.造模后,TAA组小鼠肝脏可见肝细胞出血性坏死,而TAA+LR12组肝细胞出血性坏死面积减少（P<0.001）。2.TAA组ALT、AST水平较对照组显着升高,而TAA+LR12组ALT、AST水平较TAA组显着降低（P<0.01）。3.TAA+LR12组小鼠存活率显着高于TAA组（P<0.05）。4.TAA+LR12组小鼠肝脏中PCNA蛋白表达量较TAA组上调（P<0.01）。5.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着增多（P<0.001）。结论:LR12能够减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生。第二部分:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖目的:本研究旨在建立TAA诱导的肝细胞损伤模型,研究LR12促进肝细胞再生的机制。方法:1.建立不同浓度TAA诱导的LO2细胞损伤模型,Western blot方法检测PCNA的表达。2.应用TAA或联合LR12刺激LO2细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。3.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞或原代肝细胞,CLSM和Western blot方法检测PCNA的表达。4.流式细胞术（FCM）检测LO2细胞的细胞周期。结果:1.1 mM TAA组、2 mM TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低（P<0.05）。2.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较TAA组无显着变化（P>0.05）。3.Supernatant-TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组PCNA蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。原代肝细胞的结果与LO2细胞的结果一致。4.Supernatant-TAA组LO2细胞S期细胞比例较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组S期细胞比例较Supernatant-TAA组显着增多（P<0.01）。结论:LR12通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖。第三部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在探讨LR12作用于巨噬细胞促进肝细胞再生的机制。方法:1.应用细胞因子芯片技术筛选TAA或联合LR12刺激巨噬细胞上清液中与增殖相关的细胞因子。2.酶联免疫吸附实验（ELISA）方法及实时荧光定量聚合酶链反应（q-RT-PCR）方法检测C-C趋化因子配体20（CCL20）的表达。3.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,CLSM方法检测巨噬细胞标志F4/80与CCL20的共定位及表达情况。4.将LO2细胞分为对照组,TAA组,CCL20组及TAA+CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。5.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测PCNA的表达。6.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,H&E染色检测肝脏病理变化。7.赖氏法检测血清ALT、AST的含量。8.CLSM方法检测小鼠肝脏中肝细胞标志CK18与PCNA的共定位及表达情况。结果:1.Supernatant-TAA组巨噬细胞上清液中CCL20蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组CCL20蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.05）。2.ELSA及PCR结果与芯片结果一致。3.与TAA组相比,TAA+LR12组小鼠肝脏中F4/80与CCL20共定位细胞数显着升高（P<0.001）。4.TAA组LO2细胞中PCNA蛋白表达量较对照组显着降低,而TAA+CCL20组PCNA蛋白表达量较TAA组显着升高（P<0.01）。5.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中PCNA蛋白表达量显着降低（P<0.01）。6.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝细胞出血性坏死面积显着增加（P<0.001）。7.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠ALT、AST水平显着升高（P<0.05）。8.与TAA+LR12+Ig G组相比,TAA+LR12+anti-CCL20组小鼠肝脏中CK18与PCNA共定位的细胞数显着减少（P<0.001）。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。第四部分:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生目的:本研究旨在阐明LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20调控肝细胞再生的机制。方法:1.应用TAA或联合LR12刺激巨噬细胞后的上清液刺激LO2细胞,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。2.建立TAA诱导的ALF小鼠模型,提取原代肝细胞,Western blot方法检测原代肝细胞中p-p38的表达。3.将LO2细胞分为Supernatant-TAA+LR12组和Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组,Western blot方法检测LO2细胞中p-p38的表达。4.将小鼠分为TAA+LR12+Ig G组和TAA+LR12+anti-CCL20组,CLSM方法检测肝细胞中p38的核转位情况。结果:1.Supernatant-TAA组LO2细胞中p-p38蛋白表达量较对照组显着降低,而Supernatant-TAA+LR12组p-p38蛋白表达量较Supernatant-TAA组显着升高（P<0.01）。2.TAA+LR12组小鼠原代肝细胞中的p-p38蛋白表达量较TAA组显着上调（P<0.05）。3.与Supernatant-TAA+LR12组相比,Supernatant-TAA+LR12+anti-CCL20组LO2细胞中p-p38蛋白表达量显着下调（P<0.001）。4.与TAA+LR12+anti-CCL20组相比,TAA+LR12+Ig G组小鼠可见肝细胞中p38核转位。结论:LR12通过促进巨噬细胞分泌CCL20激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生。
国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室[2]（2013）在《我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）》文中进行了进一步梳理
任晓娟[3]（2009）在《PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB及其调控炎症细胞因子的影响》文中研究表明目的:暴发性肝衰竭（fulminant hepatic failure,FHF）是一种由多种原因引起的肝细胞急性大量坏死和严重肝功能损伤所致的临床综合征。暴发性肝衰竭具有起病急,病情进展快,并发症多,治疗难度大,死亡率高,预后极差的特点,是当前肝病研究的热点和难点。其发病机制非常复杂,迄今未能完全阐明。在我国,引起FHF的病因主要是病毒性肝炎,其次是药物和中毒等因素。目前的研究认为,细胞因子网络的激活在暴发性肝衰竭的发病机制中起着重要作用。其中核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）在暴发性肝衰竭炎症反应中的重要调控作用已被证实,NF-κB是一类重要的转录调控因子,被认为是调节前炎症因子基因表达的关键成分之一,诱导炎症细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎性酶等的表达,在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化。已有研究证实,在肝脏炎症、纤维化、肝细胞凋亡与再生、肝脏缺血再灌注损伤等病理生理过程中均伴有NF-κB的活化,是调控肝脏病理损害重要的转录因子。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）是炎症反应的重要介质,在很多炎症反应中均有它们的活化和表达。TNF-α本身是NF-κB的激活剂,而NF-κB的活化又能促进TNF-α的活化和释放,形成一个恶性循环。TNF-α和NF-κB的活化皆能诱导iNOS,从而引起一氧化氮（nitric oxide, NO）释放,形成级联瀑布效应,促进肝损伤和发展,从而引起肝细胞大量坏死。吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC）是一种抗氧化剂,能特异性抑制NF-κB活化。但抑制NF-κB的活化对暴发性肝衰竭病情进展的影响如何?研究甚少。本研究基于上述理论,检测D-氨基半乳糖（D-galactosamine, D-GalN）和脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）导致的大鼠暴发性肝衰竭及应用PDTC后肝组织NF-κB、TNF-α和iNOS的表达情况,分析NF-κB与肝细胞损伤程度、TNF-α、iNOS的关系,探讨PDTC抑制NF-κB表达对大鼠暴发性肝衰竭炎症损伤的影响及其分子机制,从分子生物学角度进一步证实NF-κB在暴发性肝衰竭炎症损伤中的作用,为临床如何调节NF-κB表达治疗暴发性肝衰竭提供理论依据。方法:1研究对象:雄性清洁级Wistar大鼠60只,体重180-200g。将大鼠随机分为模型组30只,PDTC组30只。模型组腹腔注射D-GalN800mg/kg,之后立即皮内注射LPS10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。PDTC组制作FHF模型前1小时腹腔注射PDTC100mg/kg,其余同模型组。2标本的采集和保存:分别于注药（D- GalN +LPS）后2,4,8,12,24小时行股静脉放血处死,各时间点取模型组6只,PDTC组6只大鼠。留取血清,放血处死后立即剖腹取肝脏,取适量肝组织经10%中性甲醛溶液固定,余经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。3肝组织标本采用常规HE染色:光镜下观察肝脏病理学改变。4采用免疫组化S-P法,对肝组织标本进行NF-κB、TNF-α和iNOS的免疫组化染色。5应用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transarninase, ALT）和总胆红素（total bilirubin, TB）水平。6采用酶联免疫吸附试验（ enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）方法检测血清中TNF-α的表达情况。7应用硝酸还原酶法检测血清中NO的变化。8用半定量反转录多聚酶链反应（ reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）方法研究NF-κB、TNF-α和iNOS mRNA在两组肝组织中的表达情况。9统计学方法:所有数据采用SPSS 11.5软件进行统计学处理。计量资料均以x±S表示,计数资料均采用等级表示,采用秩和检验等统计学方法进行分析,以α=0.05为检验水准。结果:1两组动物一般状况观察:模型组随着给药时间的延长,大鼠一般状况逐渐恶化,依次出现活动减少,饮水减少,毛发竖立,精神萎靡,嗜睡等。PDTC组各时间点大鼠与模型组相比情况有所好转,无嗜睡,昏迷等。2两组肝组织形态学观察:⑴肝组织大体标本观察:模型组肝脏组织随时间延长出现充血、出血点、直至大块淤斑及坏死,肝组织边缘较钝。PDTC组各时间点肝组织病变程度较模型组轻。肝组织边缘较锐利,质地柔软,随时间延长仍有弥漫性出血点,但无大块淤斑及坏死。⑵肝组织HE染色:模型组随着给药时间延长,肝组织发生的病理改变逐渐加重,依次出现肝细胞水肿,炎细胞浸润,嗜酸性变,凋亡小体,直至大片出血,肝细胞坏死融合,核溶解、碎裂,纤维网状结构塌陷。PDTC组大鼠肝脏病理改变与模型组同一时间点相比,炎症坏死明显减轻,仍可见多量凋亡小体。3血清ALT,TB,TNF-α和NO水平变化:模型组大鼠用药后2、4、8小时,ALT及TB水平缓慢升高,在12及24小时均急剧升高（P=0.000）。PDTC组与模型组相比均明显降低,ALT两组同时间点比较,除8小时外,其余各时间点均比模型组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。TB在4、12、24小时均比模型组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。模型组在用药后2小时,血清TNF-α明显升高,随着时间的延长,逐渐下降（χ2=27.871, P=0.000）。PDTC组各时间点与模型组相比,TNF-α的升高幅度明显降低,差异有显着统计学意义（P<0.01）。模型组在用药后2小时起血清NO即出现明显升高,12h升高最明显,以后逐渐有所下降（χ2=24.062, P=0.000）。PDTC组2、8、12小时血清NO较模型组有明显下降,差异有显着统计学意义（P<0.01）。4两组肝组织NF-κB蛋白及mRNA表达变化NF-κB蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞,随给药时间延长表达增加,12小时表达呈强阳性,随着肝细胞坏死的加重24小时阳性细胞数表达减少。PDTC组8、12小时NF-κB蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。NF-κBmRNA表达:模型组NF-κBmRNA随给药时间延长表达增加,8小时达高峰,以后逐渐下降（χ2=26.307,P=0.000）。PDTC组4、8小时NF-κBmRNA表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。5两组肝组织TNF-α蛋白及mRNA表达变化TNF-α蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞。随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多, 12小时表达呈强阳性,24小时表达减少（χ2=19.361,P=0.000）。PDTC组4、8、12小时TNF-α蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。TNF-αmRNA表达:模型组TNF-αmRNA随给药时间延长表达增加,12小时升高最明显,24小时有所下降（χ2=25.385, P=0.000）。PDTC组8、12、24小时TNF-αmRNA表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。6两组肝组织iNOS蛋白及mRNA表达变化iNOS蛋白表达:模型组表达阳性细胞主要为肝细胞,随给药时间延长肝细胞胞浆阳性表达的细胞数逐渐增多,8小时呈强阳性表达,12小时及24小时阳性表达的细胞数有所下降,差异具有显着统计学意义（χ2=22.895,P=0.000）。PDTC组4、8小时iNOS蛋白表达与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。iNOSmRNA表达:模型组iNOSmRNA随给药时间延长表达增加,8小时升高最明显,12小时及24小时逐渐下降,差异具有显着统计学意义（χ2=25.281,P=0.000）。PDTC组iNOSmRNA表达4小时及8小时与模型组同一时间点比较,明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。模型组及PDTC组iNOS mRNA的表达与NF-κB mRNA呈正相关,相关系数分别为0.978和0.940,P值分别为0.004和0.017。结论:1 TNF-α、iNOS、NO在D-GalN+LPS诱导的大鼠暴发性肝衰竭肝细胞的炎症坏死中发挥了重要的作用。2 NF-κB与iNOS、TNF-α密切相关,证实了NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞炎症坏死中起关键作用。3 PDTC抑制了D-GalN+LPS导致的实验性暴发性肝衰竭中NF-κB的活化。4 PDTC能够通过抑制NF-κB的表达明显减轻D-GalN+LPS导致的大鼠暴发性肝衰竭肝细胞的炎症坏死。
刘倩[4]（2009）在《PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB表达和细胞凋亡的影响》文中指出目的:暴发性肝衰竭（fulminant hepatic failure, FHF）是一种病死率极高的临床综合征,目前除肝移植外尚无特效的治疗措施,而肝源短缺、费用昂贵、术后长期应用免疫抑制剂限制了其在临床的实施,因此,寻找有效的临床内科治疗方法十分必要。然而发病机制的明确是创新科学、有效的治疗措施的基础。近年来,有关暴发性肝衰竭的研究取得了诸多进展,但是其具体机制尚不十分清楚。有学者提出炎症因子网络的激活在FHF的发生中起着重要作用,尤其是对位于炎症网络中心地位的核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）的研究,成为最近十年的热点。研究发现,NF-κB可以通过启动转录多种炎症因子的表达促进炎症进展,如诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis, iNOS）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）等。暴发性肝衰竭的病理研究认为除了肝细胞坏死,大量肝细胞凋亡参与了其病理过程。NF-κB能启动转录很多下游基因的表达,这些基因表达的产物不但参与了炎症反应的发生,而且在细胞凋亡中发挥着重要作用。NF-κB调控着一系列凋亡诱导和凋亡抑制基因的表达,包括凋亡蛋白酶（caspase）、死亡受体、凋亡抑制蛋白家族部分成员、Bcl-2蛋白家族部分成员以及某些原癌基因。但是由于刺激NF-κB活化的因素不同,活化的靶基因不同,NF-κB在调控细胞凋亡方面也发挥着不同的作用,通过信号转导途径既可抑制肝细胞的凋亡亦可促进肝细胞的凋亡。目前国内外对NF-κB在暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的作用研究较少。因此NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用及其机制尚不清楚。本研究采用Wistar大鼠腹腔注射D氨基半乳糖（ D-galactosamine, D-GalN ）后皮内注射脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）制造暴发性肝衰竭动物模型,并将应用NF-κB特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC）预处理的大鼠与模型组大鼠进行比较。通过采用常规苏木素-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色、流式细胞学技术（flow cytometry, FCM）、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）判断比较抑制NF-κB表达前后肝组织细胞凋亡的情况,了解PDTC在暴发性肝衰竭中对NF-κB表达及肝细胞凋亡的影响,初步探讨NF-κB在暴发性肝衰竭肝细胞凋亡中的作用。应用免疫组化及反转录多聚酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）方法,从蛋白、基因水平检测c-myc、survivin表达,探讨NF-κB是否通过调节凋亡相关基因c-myc、survivin的表达参与暴发性肝衰竭的发病。为临床如何应用NF-κB抑制剂治疗肝衰竭提供理论依据。方法:1研究对象:雄性Wistar大鼠60只,清洁级,体重180-200g。大鼠禁食24小时后,随机分为2组,即模型组和PDTC组,每组30只。模型组应用D-GalN800mg/kg+LPS10ug/kg制造暴发性肝衰竭模型;PDTC组应用PDTC100mg/kg预处理,余同模型组。2标本采集和保存:从PDTC组、模型组各取6只分别于给D-GalN +LPS后2、4、8、12、24小时行股静脉放血处死,迅速小心剖出肝脏,取适量肝组织分别固定于10%中性甲醛液、70%乙醇中,部分肝组织液氮冰冻后存放于-80℃冰箱;将全血放置30min,离心取上层血清行生化学检测。3 HE染色光镜下观察肝组织病理学变化。4采用Olympus AU2700全自动生化分析仪对两组大鼠血清进行肝功能检测丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）及总胆红素（total bilirubin, TB）。5采用免疫组织化学S-P法对肝组织标本进行NF-κB p65、c-Myc、survivin蛋白染色。6采用RT-PCR方法对NF-κB、c-myc、survivin mRNA进行半定量分析。7应用流式细胞学技术测定70%乙醇固定的两组肝组织细胞凋亡率（apoptotic rate, AR）,进行分析比较。8 TUNEL法检测两组肝组织原位肝细胞凋亡情况,凋亡指数（apoptotic index, AI）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。9统计学处理:应用spss11.5统计软件进行统计学分析,采用秩和检验和Spearman秩相关分析对数据进行统计。结果:1一般状况观察:模型组大鼠随着给药时间的延长出现活动减少、反应迟钝、毛发竖立、嗜睡、昏迷等情况;PDTC组大鼠一般状况好于模型组,给药后24小时只有毛发竖立、活动少等表现,无嗜睡、昏迷等肝性脑病表现。2肝组织形态学观察:（1）大体标本观察:模型组大鼠肝脏随着给药时间的延长出血点及淤血斑均逐渐增多,到24小时肝组织呈暗红色,大片出血,淤血严重;PDTC组随着给药时间的延长,只有出血点增多,至24小时仍未见大片出血、淤血现象。（2）HE染色:模型组大鼠肝组织病理显示给药后2小时肝小叶完整,肝索排列规则;4小时可见肝细胞嗜酸性变及凋亡小体,少量炎细胞浸润;8小时可见灶状坏死,伴炎细胞浸润,可见多量凋亡小体;12小时肝细胞片状坏死,可见炎细胞浸润,可见凋亡肝细胞;24小时肝组织大片坏死,出血严重,残留散在肝细胞及凋亡小体;PDTC组大鼠肝细胞坏死、凋亡较模型组均明显减轻。3生化检测结果:模型组大鼠血清ALT及TB水平随着给药时间的延长呈现上升趋势,12、24小时急剧升高;PDTC组大鼠血清ALT、TB较模型组降低,各时间点两组之间p值分别为（ALT: 0.025、0.037、0.631、0.004、0.004;TB: 0.747、0.045、0.872、0.004、0.004）。4细胞凋亡的变化:流式细胞学技术检测细胞凋亡率及TUNEL法计算凋亡指数结果均显示模型组呈现上升趋势（p<0.05）;PDTC组较模型组细胞凋亡减少（p<0.05）。5 NF-κB的表达变化:模型组大鼠肝组织随着给药时间的延长,在基因及蛋白水平表达均呈现上升趋势（p<0.05）;PDTC组较模型组下降（p<0.05）。6 c-myc、survivin表达变化:模型组肝组织c-myc、survivin mRNA表达在4、24呈现双峰,PDTC组肝组织survivin mRNA表达较模型组无明显下降（p>0.05）,c-myc mRNA在4、8、24小时较模型组表达下降（p<0.05）,2、24小时无明显下降（p>0.05）;模型组肝组织c-Myc蛋白表达在4、24小时呈现双峰,Survivin呈现上升趋势,PDTC组肝组织表达较模型组无明显下降（p>0.05）。7 Survivin、c-myc表达与细胞凋亡率相关性分析:survivin、c-myc表达与细胞凋亡率呈负相关（r=-0.491、-0.414,p=0.000、0.004）。结论:1利用D-GalN联合LPS制造暴发性肝衰竭大鼠模型,从形态学、细胞学以及基因水平证实了肝细胞凋亡在暴发性肝衰竭病理过程中起着重要作用。2从细胞、蛋白和基因水平证实NF-κΒ在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭发病中除了促炎作用,还能诱导肝细胞凋亡。3从蛋白和基因水平证实了在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭中抗氧化剂PDTC能有效抑制NF-κΒ的表达。4 PDTC能通过抑制NF-κΒ活性,减轻D-GalN+LPS所致暴发性肝衰竭大鼠肝细胞凋亡,改善病情,为临床应用NF-κB抑制剂治疗肝衰竭提供了理论依据。5 c-Myc、survivin在D-GalN+LPS所致实验性暴发性肝衰竭中具有抑制肝细胞凋亡的作用,但NF-κΒ对其无明确的调控作用,提示NF-κΒ调控肝细胞凋亡的机制复杂,尚需进一步研究。
蒋春晓[5]（2008）在《重组人Elafin对大鼠急性肝损伤作用的研究》文中研究表明本论文采用动物实验学、分子生物学,免疫学、病理学相关方法和技术,建立四氯化碳和D-氨基半乳糖大鼠急性肝损伤模型,给予重组人弹性蛋白酶特异性抑制因子（Elafin）进行干预。通过检测急性肝损伤大鼠血清生化和肝组织病理学的变化,观察重组人Elafin对急性肝损伤大鼠的作用,并对其可能的作用机制进行探讨。其可能的机制在于,炎性反应是机体对损伤的一种保护性反应,以破坏、稀释并清除损伤源为目的,与此同时也会引起不同程度的自身损伤。中性粒细胞弹性蛋白酶被认为是炎性反应的主要终效应因子,Elafin是内源性的弹性蛋白酶抑制剂,为中性粒细胞弹性蛋白酶、胰弹性蛋白酶、蛋白酶3等丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂。具有抗蛋白酶活性、抗炎活性和直接的抗微生物活性等重要作用。本论文的创新之处在于,首次证实了Elafin对实验性大鼠急性肝损伤的治疗作用并对其作用机制进行探讨。国内外尚未见Elafin对大鼠急性肝损伤作用的相关报道。本研究的意义在于,肝损伤是严重危害人类健康的各种肝脏疾病的病变结果,其所涉及的病理因素比较广泛,探讨肝损伤的发生因素及病理机制,对指导临床治疗以及预防肝损伤的发生均有积极意义。
刘亮明[6]（2007）在《Pim-3基因对暴发性肝衰竭的肝保护效应研究》文中提出暴发性肝衰竭（FHF）是一死亡率极高,以大量肝细胞凋亡、严重肝损害为特征的临床疾病。丝/苏氨酸激酶Pim-3基因具有显着的肝细胞凋亡抑制和生长促进效应,预期能在FHF的疾病治疗中发挥积极作用。为此,本课题进行了Pim-3基因转染动物活体肝组织的实验,目的是探讨Pim-3基因对FHF的组织修复或肝保护效应及其作用机制。课题研究采取了多步骤分阶段的方式进行。首先,采用RT-PCR的方法,从大鼠心肌组织中分离并克隆了Pim-3基因。通过基因重组技术,完成了Pim-3基因质粒载体的构建,并利用基因转染技术顺利地实现了重组体质粒pEGFP-N2/Pim-3在体外真核细胞的表达和活性测定;其次,采用常规和流体力学方法进行GFP表达质粒溶液的鼠尾静脉注射,证明常规注射和流体力学注射是两种不同的活体基因转染方法,具有不同的器官靶向性和基因转染效率。其中流体力学方法是一个高效的肝靶向性动物活体基因转染方法;再次,采用腹腔注射LPS/D-GalN的方法建立FHF大鼠模型。找到了制备动物模型最佳的药物剂量,证明小剂量LPS可诱导D-GalN致敏大鼠产生显着但非致死性的急性肝衰竭。其中,肝细胞凋亡是LPS/D-GalN诱导的肝衰竭主要的病理形态学特征;第四,通过构建体pEGFP-N2/Pim-3质粒的大鼠活体肝靶向性转染,证实该质粒能有效地在体内肝细胞表达,并发挥其对细胞凋亡的抑制效应;最后,采用致死剂量LPS/D-GalN处理大鼠,结果提示外源性Pim-3基因的体内转移极有效地降低了动物的死亡率和血清转氨酶水平、减轻了肝组织出血坏死性病变和炎性浸润,并使大片肝细胞凋亡得到逆转。同时,外源性Pim-3基因在体内的高表达也显着地降低了肝组织和血清内炎性细胞因子TNF-α和IL-1β水平以及肝组织损伤基因iNOS和凋亡诱导基因p53的表达,但促进了抗凋亡蛋白Bcl-2的分泌。这些结果提示,外源性Pim-3基因的活体转染能有效地保护大鼠免于LPS/D-GalN诱导的暴发性肝衰竭的发生。其保护作用的产生主要在于肝细胞凋亡的抑制和组织炎性反应的改善。第一部分Pim-3基因克隆和质粒载体构建及其在真核细胞内的表达和活性研究目的克隆Pim-3基因和构建其GFP表达质粒,并研究其在真核细胞内的表达及对细胞凋亡与生存能力的影响。方法采用RT-PCR的方法从Wistar大鼠心肌组织中提取并克隆Pim-3基因,通过酶切和连接反应构建GFP表达质粒,随后经酶切证实和测序鉴定;肝癌SMMC7721细胞采用常规的方法进行培养和传代,原代肝细胞采用二步胶原酶灌注法进行分离;以阳离子脂质体介导的方法进行体外细胞的基因转染;基因转染效率借助荧光显微镜观察GFP的表达进行判断;细胞的凋亡和存活情况通过流式细胞术和MTT分析检测。结果成功克隆大鼠Pim-3基因,并构建其真核表达质粒pEGFP-N2/Pim-3;构建体质粒转染肝癌SMMC7721细胞24h后即见GFP表达,在48h表达显着增强;外源性Pim-3基因的转染显着抑制了肝癌细胞的凋亡。在转染后48h,对照（非转染）、脂质体、空质粒和重组质粒组肝癌细胞的凋亡百分率分别为（10.2±6.3）%、（11.0±5.9）%、（10.7±4.1）%和（3.5±1.3）%。与其它三组相比,重组质粒组肝癌细胞的凋亡百分率显着降低（P＜0.01）;通过MTT分析,Pim-3基因的转染显着地增强了肝癌细胞的增殖能力,且在观察期间,其增殖能力有随时间增强的趋势;成功分离培养大鼠原代肝细胞,并借助阳离子脂质体介导成功完成质粒体外肝细胞转染。在转染48h可见明显GFP表达;通过流式细胞检测,转染后48h,对照、脂质体、空质粒和重组质粒组肝细胞的生存率分别为74.12±11.20、69.87±13.45、72.03±12.47和90.11±9.27。与其它三组肝细胞相比,转染重组质粒后的肝细胞生存率明显提高（P＜0.01）。结论成功构建Pim-3基因GFP表达质粒pEGFP-N2/Pim-3;该构建体能有效地在真核细胞包括肝癌细胞和原代培养肝细胞内表达,并发挥抑制凋亡和促进生长的作用。第二部分绿色荧光蛋白表达质粒经鼠尾静脉注射后的器官靶向性研究目的研究不同方式的鼠尾静脉注射对绿色荧光蛋白（GFP）基因器官靶向性的影响。方法雄性昆明小鼠40只,随机分为正常对照组、流体力学注射组和常规注射组。流体力学和常规注射组再分为转染组和对照组,每组各8只小鼠。注射结束后24h采集血清检测转氨酶,并采集肝、脾、心、肾、肺和脑组织进行冰冻切片,部分肝组织采用4%多聚甲醛固定后切片。荧光显微镜下观察。结果不同方式的注射对24h后的肝功能并无不良影响;常规尾静脉注射引起了少数肾小球细胞表达GFP,而肝、脾、心、肺及脑等组织未见明显GFP表达;流体力学注射引起了肝内GFP高水平表达,肝细胞表达率接近45%,其它组织则无GFP表达。结论流体力学方法是肝靶向性的活体基因转染方法;GFP可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂。第三部分内毒素诱导D-半乳糖胺致敏大鼠急性肝损伤或肝衰竭实验模型的研究目的研究非致死剂量LPS/D-GalN的肝损伤效应和细胞凋亡在急性肝损伤或肝衰竭中的作用。方法48只Wistar大鼠进行随机对照分组实验,分为6h、24h和48h取材3大组（各16只）,每个大组再分为处理组和对照组（各8只）。处理组大鼠以LPS50μg/kg+D-GalN 300mg/kg,用1ml无菌生理盐水溶解后腹腔内注射,对照组动物仅腹腔内注射1ml生理盐水。在相应时间点,门静脉采血查血生化包括ALT、AST和TBIL;肝组织切片分别行光镜、透射电镜检查和TUNEL分析;基因表达通过RT-PCR的方法检测;24h处理鼠肝组织匀浆后行Caspases活性检测。结果所有处理组大鼠ALT、AST和TBIL在6h内即显着升高,24h达到峰值,48h仍维持于高水平;在24h和48h,肝外形明显肿胀并失去正常光泽,表面见出血点;肝损伤的病理组织学改变包括肝细胞死亡、炎性渗出和出血等表现从6h开始出现,在24h和48h显着加重;LPS/D-GalN腹腔注射显着地诱导了肝细胞的凋亡,通过TUNEL分析,在24h和48h大鼠肝组织的凋亡指数（AI）均接近70%;肝组织炎性细胞因子IL-1βmRNA水平在6h显着升高,且在24h和48h维持于高水平,而TNF-α水平在处理组各时间点内均在正常范围;损伤基因iNOS mRNA表达被早期诱导,在6h达峰值,随后逐渐下降。相反,在早期（6h）,并未发现凋亡诱导基因p53 mRNA高表达,但在肝凋亡的高峰期（24h）,p53显着高表达,且维持于高水平直至后期（48h）;此外,LPS/D-GalN的应用显着地诱导了24h处理大鼠肝组织caspase-3、-8、-9和-12的活性。结论小剂量LPS可诱导D-GalN致敏大鼠产生显着但非致死性的急性肝衰竭;肝细胞凋亡是LPS/D-GalN诱导的肝衰竭主要的病理形态学特征,其发生在早期可能与iNOS基因、而中期和晚期可能与p53基因的高表达有关,且至少三条凋亡通路参与了这种病理过程。第四部分Pim-3质粒构建体在活体肝组织表达和活性的研究目的研究Pim-3质粒构建体pEGFP-N2/Pim-3在活体肝组织的表达和活性。方法动物采用随机分组对照实验,基因活体内肝靶向性转染通过质粒溶液的大鼠尾静脉流体力学注射法完成,肝细胞凋亡的诱导则采用腹腔内注射LPS和D-GalN来实现。四组动物（8只/组）分别为:A组为正常对照组,B、C和D组分别以林格氏液、空载质粒和重组质粒溶液行尾静脉流体力学注射,1d后,予LPS/D-GalN腹腔内注射,24h后处死动物;肝组织报告基因GFP的表达通过荧光显微镜、目的基因Pim-3的表达通过RT-PCR方法检测;肝细胞凋亡采用TUNEL分析,并进行Caspase-3活性检测。结果重组质粒和空质粒DNA通过流体力学注射法被成功转染入大鼠活体肝组织内,C组和D组大鼠肝组织切片中GFP呈现高水平表达;目的基因Pim-3的相对表达水平A组为0.06±0.02、B和C组为0、D组为0.49±0.15。D组与A、B、C三组间差异有显着统计学意义（P＜0.01）;通过TUNEL分析,各组大鼠肝细胞的凋亡指数（apoptotic index,AI）分别为:A组3.1±0.7%,B组72.5±6.1%、C组69.8±5.7%和D组4.9±1.2%,D组与A组间差异无明显统计学意义（P＞0.05）,而D组与B、C组之间差异存在显着统计学意义（P＜0.01）。B和C组间差异无统计学意义（P＞0.05）;各组大鼠肝组织Caspase-3活性分别为:A组60.37±15.23pmol/min.mg、B组146.5±55.2pmol/min.mg、C组141.6±49.7pmol/min.mg和D组75.57±26.91pmol/min.mg,D与A组间和B与C组间差异无明显统计学意义（P＞0.05）,而D组与B、C两组间差异有明显统计学意义（P＜0.01）。结论已构建的重组体质粒pEGFP-N2/Pim-3能在大鼠活体肝组织内有效表达,并发挥其对肝细胞凋亡的抑制效应。第五部分Pim-3表达质粒活体肝转移对LPS/D-GalN诱导暴发性肝衰竭大鼠的保护效应及其机制目的探讨Pim-3基因对暴发性肝衰竭大鼠的肝保护作用及其机制。方法32只大鼠随机分成四组（8只/组）。A组为正常对照组,B、C和D组分别以林格氏液、空载质粒和重组质粒溶液预处理大鼠,1d后,予LPS/D-GalN腹腔内注射诱导FHF,8h后或濒死期处死大鼠,采集标本。另设32只大鼠分组观察24h内的死亡情况;血清转氨酶水平通过全自动血生化分析仪检测;Pim-3基因的活体肝组织转染效率通过荧光显微镜观察GFP的表达来评估;细胞凋亡采用TUNEL分析和Caspase-3活性来测定;肝组织基因表达通过RT-PCR和Western blot进行检测,血清内蛋白质的分泌采用ELISA方法测定。结果LPS/D-GalN攻击24h后,B和C组大鼠死亡率均为87.5%,D组为12.5%,A组均存活;Pim-3基因的应用显着地降低了LPS/D-GalN注射诱导的血清转氨酶水平;荧光显微镜观察,C组和D组肝组织有大量GFP表达,而A组和B组无GFP表达;肝组织病理检查,可见Pim-3质粒肝转移有效地减轻了LPS/D-GalN诱导的肝内出血坏死和炎性细胞浸润;肝组织TUNEL分析和Caspase-3活性测定显示外源Pim-3基因的体内转染显着地减轻了LPS/D-GalN诱导的肝细胞凋亡,并抑制了Caspase-3的活性;正常大鼠肝组织组成性表达Pim-3基因,LPS/D-GalN攻击显着地抑制了Pim-3基因表达,外源Pim-3基因的活体转染使这种抑制得到逆转并出现Pim-3 mRNA和蛋白质超高表达;LPS/D-GalN攻击大鼠肝组织和血清TNF-α和IL-1β水平均升高,但外源Pim-3基因使其增高程度显着减轻;LPS/D-GalN攻击诱导了大鼠肝组织iNOS和p53mRNA的表达,Pim-3基因的应用明显地降低了其增高的程度,但并不影响LPS/D-GalN诱导Bax的表达水平;外源Pim-3基因的应用也显着地诱导了Bcl-2蛋白表达。结论外源性Pim-3基因的活体内转染能有效地保护大鼠免于LPS/D-GalN诱导暴发性肝衰竭的发生。其保护效应的产生主要在于肝细胞凋亡的抑制和组织炎性反应的改善。
余立敏[7]（2007）在《茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的影响》文中提出目的观察茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型动物的防治作用，并在此基础上观察其防治急性肝衰竭的作用机制，为临床治疗急性肝衰竭提供新的思路。方法选取健康清洁级Wistar大鼠110只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为6组，即正常组，模型组，促肝细胞生长素组和茵陈泽兰方低、中、高剂量组。其中正常组10只，其余各组均为20只。大鼠禁食过夜（14h以上）后，除正常组外，其余各组用硫代乙酰胺（TAA）600mg／kg皮下注射2次（间隔24h）造模；正常组皮下注射同等剂量的生理盐水。开始至实验结束，正常组、模型组和西药组予生理盐水5ml／kg灌胃，茵陈泽兰方低、中、高剂量组分别给等体表面积比的相应药物灌胃（三组分别给予茵陈泽兰方成人等效剂量、成人等效剂量的5倍、成人等效剂量的10倍剂量进行灌胃）。为防止低血糖，造模期间，除西药组外，所有动物每隔8h皮下注射5ml混合液（3ml 10％葡萄糖、2ml含等量生理盐水与20μmol／L KCl）；西药组予促肝细胞生长素2mg／kg，溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持续3d。动物自由饮食。实验48h后，所有大鼠用3％戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后取腹中线迅速剪开腹腔，用10ml注射器无菌采取腹主动脉血8ml，常规分离血清，-20℃冻存备测。各组随机取大鼠9只，取相同部位的肝组织放入10％中性福尔马林液固定，常规石腊包埋，切片厚4μm，并取部份肝、脑组织迅速放入液氮中冻存。主要观察48h内各组大鼠行为学变化、死亡情况和常规生化方法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBil）；SABC免疫组织化学法检测肝组织肝细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、肝再生信号调节蛋白α1（SIRPα1）水平；双抗体夹心ELISA法检侧血清TNF-α和IL-6含量；RT-PCR法检测肝组织HMGB1、CD14mRNA和脑组织AQP-4mRNA水平。结果1．造模后动物出现活动进食减少，行动变缓，出现昏迷，部分死亡（死亡率为55.0％）。中药组大鼠肝损伤得到较大改观，有部分大鼠可逐渐恢复正常。死亡率方面，用药各组与模型组比较均具有显着性差异（p＜0.01）。病理上，与模型组相比较，茵陈泽兰方中、高剂量组肝细胞坏死程度最轻微，其次为西药组和低剂量组；透射电镜下残留肝细胞病理变化较模型组也轻。造模后，反映大鼠肝功能的血清ALT，AST，Tbil水平均明显升高，模型组明显高于正常组，有非常显着差异（P＜0.01）；西药组及中药各剂量组较模型组低，统计有显着性差异（P＜0.01）；茵陈泽兰方中、高剂量组与西药组均低，组间无差异（P＞0.05）；中药低剂量组与西药组之间有差异（P＜0.01）。降低血氨方面，中西药各组均有显效（P＜0.01），但茵陈泽兰方中、高剂量组较西药组强（P＜0.01）；有效缩短凝血酶原时间方面情况相似，只是西药组比中药低剂量组更有效（P＜0.05）。2．正常组大鼠肝组织有丝分裂指数（MI）极少，造模后大鼠肝组织MI显着升高（P＜0.01），用药后各组肝组织有丝分裂有不同程度增加（P＜0.01），以中高剂量组最明显，分别是模型组的2.6倍和3.1倍。低剂量组有丝分裂指数最少，与其它各用药组比有显着性差异（P＜0.05-0.01）。正常组大鼠肝组织内仅见少数增殖细胞核抗原（PCNA）阳性细胞，表达也较弱。造模组大鼠PCNA表达明显增加，与正常组大鼠相比差异显着（P＜0.01）；促肝细胞生长素组PCNA染色也明显增多，浓度高，表达范围广；茵陈泽兰方治疗后，大鼠肝组织PCNA表达升高，且随着茵陈泽兰方剂量的增加表达增强，与模型组相比，明显升高（P＜0.01-0.05）。但相对于西药组，中药低剂量组表达较少（P＜0.01）。3．正常组大鼠肝组织中，SIRPα1表达水平较低，模型组和促肝细胞生长素组大鼠与其相比，差异均显着（P＜0.01）。茵陈泽兰方治疗后，大鼠肝组织SIRPα1表达升高，高、中、低剂量SIRIα1表达均明显高于模型组（P＜0.01）。且SIRPα1的表达随着茵陈泽兰方剂量的增加而增加，茵陈泽兰方中高剂量组与模型组比较有显着差异（P＜0.01）；且与西药组作用相当（P＞0.05）；但茵陈泽兰方低剂量组大鼠肝组织SIRPα1阳性表达虽然比模型组明显升高（P＜0.01），但不及西药组及中高剂量组（P＜0.05）。4．大鼠在皮下注射TAA造模后，模型组、西药组和茵陈泽兰各剂量组血清TNF-α和IL-6含量均较正常组高（P＜0.01）；但西药组和茵陈泽兰各剂量组较模型组比较则明显下降，其结果有显着性差异（P＜0.01）；中药茵陈泽兰方低剂量组与西药组比较有差异（P＜0.05），提示其效果不及西药组；中高剂量组与西药组比较有显着性差异（P＜0.01），提示其效果优于西药组；中药中高剂量组间比较无显着性差异（P＞0.05）。5．正常组HMGB1 mRNA表达很低（0.136），模型组肝组织HMGB1 mRNA表达明显增高（0.429），与正常组比较有显着性差异（p＜0.01）。应用茵陈泽兰方后，HMGB1 mRNA相对含量明显下降（0.351，0.246，0.241），与模型组比，各用药组均有明显降低（p＜0.05-0.01），中高剂量比西药组和低剂量组都要低（p＜0.01）。低剂量组效果最差（p＜0.01）。6．正常组AQP-4 mRNA表达很低，模型组肝组织AQP-4 mRNA表达明显增高，与正常组比较有显着性差异（p＜0.01）。应用茵陈泽兰方后，AQP-4 mRNA表达受到了抑制，其相对含量明显下降（0.472，0.336，0.302），与模型组比，各用药组均有明显降低（p＜0.05-0.01），而中高剂量组相比西药组和低剂量组都要更低（p＜0.05-0.01）。7．正常组CD14 mRNA表达很低（0.193），模型组肝组织CD14 mRNA表达明显增高（0.697），差异显着（p＜0.01）。应用茵陈泽兰方后，CD14 mRNA表达受到了抑制，其相对含量明显下降（0.564，0.419，0.306），与模型组比各用药组均有明显降低（p＜0.05-0.01），中、高剂量比西药组和低剂量组都要低（p＜0.01）。结论1．茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型大鼠肝损伤有较好的防治作用，能在一定程度上恢复肝功能，改善肝组织病变，降低死亡率。2．茵陈泽兰方对模型大鼠急性肝衰竭防治作用的机制可能是：（1）通过降低TNF-α、IL-6和HMGB1等的水平，平衡炎性细胞因子的释放，抑制肝细胞坏死和凋亡，延缓肝细胞进一步损伤，从而阻断急性肝衰竭的发生发展；（2）提高肝细胞有丝分裂指数（MI）及PCNA、SIRPα的表达，促进和调节残留肝细胞的再生；（3）降低脑组织AQP-4 mRNA的表达，调整脑组织的水液代谢平衡，防止急性肝功能衰竭时伴发严重脑水肿，从而降低死亡率。（4）降低肝组织中CD14 mRNA水平，阻止内毒素对肝组织的直接损害，并且抑制内毒素激活各种细胞因子和炎症介质的释放，导致肝损伤。
宋慧娟[8]（2007）在《NF-κB在实验性暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及其机制》文中提出目的:暴发性肝衰竭（Fulminant Hepatic Failure, FHF）是由于多种原因所引起的肝细胞大量坏死而出现的以肝功能严重受损为特征的综合征。具有起病急、预后差及病死率高的特点,迄今仍无有效治疗,国外报导病死率在40-70%[1],国内经过连续攻关报导仍为50%左右[2],降低病死率是临床工作中迫切需要解决的难题。虽然近年来在暴发性肝功能衰竭的发病机制、临床诊断、治疗等方面取得了较大进展,但其发病机制仍不甚明确,若能进一步明确其发病机制必将提高FHF的防治水平。目前国内外对于暴发性肝衰竭发病机制的研究强调内毒素引起的触发作用。最近的研究证明内毒素等的毒性作用主要是间接性的,它依赖于许多炎症介质的释放,特别强调细胞因子的作用,其中TNF-α起着关键作用[3]。临床和基础研究都明确观察到在暴发性肝炎所致肝功能衰竭患者血清TNF-α升高,并初步阐明了TNF-α在其发病机制中的作用[4]。研究认为内毒素进入肝脏激活单核/巨噬细胞系统,引起TNF-α为中心的多种炎症介质的释放,介导炎症反应的瀑布效应造成肝细胞坏死。NF-κB是一个多级转录因子,它调控一系列基因的表达,如编码炎性细胞因子、趋化因子、干扰素、MHC蛋白、生长因子、细胞粘附因子的基因和病毒基因,与机体免疫、炎症等病理生理过程密切相关[5]。调控合成与炎症反应有关的蛋白质的细胞因子主要有:前炎性细胞因子:TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF;趋化因子:IL-8、巨噬细胞炎性蛋白-1、巨噬细胞趋化蛋白-1;炎性反应酶类;粘附分子:细胞间粘附分子-1、血管细胞粘附分子-1、E-选择素;受体:IL-2受体、T细胞受体（β链）。它们大多参与机体的炎症反应;可促进炎症细胞积累、活化或炎症介质的释放,加重炎症反应。LPS和TNF-α都是NF-κB的强烈激活剂[6]。NF-κB是介导过度炎症反应的核心环节。国内外对于NF-κB的研究多集中于肿瘤和缺血再灌注方面,而对其在暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及机制研究较少。本研究基于上述理论,旨在用免疫组织化学方法检测NF-κB在FHF病理损害过程中表达的变化,以期证实NF-κB在暴发性肝衰竭中的作用,进一步阐明暴发性肝衰竭的发病机制。方法:1.研究对象:雄性清洁级Wistar大鼠45只,体重180-200g。将大鼠随机分为模型组30只,对照组15只。模型组腹腔注射D-氨基半乳糖800mg/kg,之后立即皮内注射脂多糖10μg/kg,制造暴发性肝衰竭模型。对照组腹腔注射同样体积的生理盐水。2.标本的采集和保存:分别于注药后2,4,8,12,24小时行股静脉放血处死,各时间点取模型组6只,对照组3只大鼠。留取血清,放血处死后立即剖腹取肝脏,取适量肝组织经10%中性甲醛溶液固定,余经液氮速冻后置-80℃冰箱保存备用。3.肝组织标本采用常规HE染色:光镜下观察肝组织病理学改变,观察炎症、坏死的形成与发展。4.肝组织标本的免疫组织化学染色:采用常规免疫组化S-P法,对肝组织标本进行NF-κB、iNOS和TNF-α的免疫组化染色。NF-κBp65和TNF-α结果评估参照Fromowitz[7]的综合计分法进行。iNOS结果判定参照Shimizu[8]等判定标准采用半定量方法,分别按染色细胞的分布和染色深度记分,最终结果用阴性、弱阳性、阳性、强阳性来表示。5.应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析,所有计数资料均采用等级表示,各指标不同时间点间统计分析用Wilcoxon秩和检验及秩相关分析。两指标间的相关性用秩相关进行分析。P<0.01时有显着性差异。结果:1.各组动物一般状况观察:对照组大鼠一般状况较好,无死亡。模型组随着给药后时间的延长,大鼠一般状况逐渐恶化,依次出现饮水减少、毛发竖立、精神萎靡、反应迟钝、嗜睡,11小时死亡1只大鼠。2.各组肝组织形态学大体观察:（1）肝脏大体标本观察:对照组不同时间点,肝组织形态学差异不大,大鼠肝脏呈鲜红色,光泽好,质地柔软有弹性,边缘锐利。模型组肝脏组织随时间延长出现充血、出血点、局部淤血、坏死,肝组织脆性增加及大块坏死。（2）肝组织HE染色:对照组不同时间点,肝组织形态学差异不大,肝小叶结构完整,肝板排列整齐,无变性、坏死。模型组随着时间延长,肝组织发生的病理改变逐渐加重,肝组织的病理学光镜下可观察到肝细胞水肿、肝窦淤血、炎细胞浸润、肝组织出血、肝细胞大片坏死,肝小叶结构破坏。肝细胞损伤的方式主要为炎症坏死,也可见少量肝细胞具有细胞凋亡形态学改变。3.各组肝组织免疫组织化学改变:（1） NF-κBp65蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞（肝窦内皮细胞和枯否细胞）染色阳性,细胞浆有弱表达,极少见核阳性表达。模型组表达阳性细胞主要为肝细胞、枯否细胞。2h组主要是非实质细胞的胞浆着色。4h、8h、12h、24h组以肝细胞胞核着色为主。4h、8h、12h组核阳性表达的细胞数明显增多,且明显高于对照组。（2） iNOS蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞（枯否细胞、肝窦内皮细胞）染色阳性,模型组随着肝脏炎症程度加重阳性率增高,染色程度加深。（3） TNF-α蛋白表达:对照组可见少量非实质细胞（枯否细胞）染色阳性,模型组随着肝脏炎症程度加重阳性率增高,染色程度加深。4. NF-ΚB与iNOS,TNF-α在实验性暴发性肝衰竭中的关系,研究结果显示模型组大鼠肝脏变性坏死炎症程度较重且随时间延长炎症坏死程度加重。NF-κB与iNOS之间呈正相关（r=0.801, P<0.01）,NF-κB与TNF-α之间也呈正相关（r=0.852, P<0.01）。结论:1应用D-GalN+LPS造模可反映暴发性肝衰竭发生的病理变化过程,并可动态观察暴发性肝衰竭肝脏组织病变演变过程,适于暴发性肝衰竭发病机制的研究。2从蛋白水平观察了在暴发性肝衰竭发病过程中NF-κB从胞浆到胞核的激活过程。从而证实NF-κB被激活,参与了暴发性肝衰竭的病理损害过程,是暴发性肝衰竭的重要发病机制。3暴发性肝衰竭时,肝细胞中的NF-κB的高表达,提示在暴发性肝衰竭病理过程中,肝细胞不仅是致病因子攻击的靶细胞,而且还参与了暴发性肝衰竭的发病过程。4暴发性肝衰竭肝组织中NF-κB与iNOS,TNF-α密切相关,随着NF-κB的活化,iNOS和TNF-α表达增多。从而证实NF-κB在暴发性肝衰竭肝组织炎症坏死中起重要作用,提示NF-κB是暴发性肝衰竭发病过程中的关键环节,这为临床治疗暴发性肝衰竭提供了新的干扰靶点。
朱清静[9]（2006）在《丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究》文中提出目的： （1） 探讨丹黄方对硫代乙酰胺所致急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的作用及机制。 （2） 探讨丹黄方对部分肝切除大鼠肝再生的作用及机制。 方法： （1） 113只Wistar大鼠，雄性56只，雌性57只，体重230～250g，随机分为6组：正常对照组（8只）、急性肝衰竭组（25只）、丹黄方大剂量组（20只）、丹黄方中剂量组（20只）、丹黄方小剂量组（20只）、促肝细胞生长素组（20只）。试验第2天除正常对照组皮下注射同等剂量的生理盐水外，其余各组用TAA600mg／kg-1体重皮下注射造模，24h后相同剂量重复注射1次。试验开始至实验结束，正常组、急性肝衰竭模型组、促肝细胞生长素组予生理盐水5ml·kg-1灌胃，丹黄方大、中、小剂量组分别给等体积／重量比的相应药物灌胃（三组分别给予丹黄方成人等效剂量、成人等效剂量的5倍、成人等效剂量的10倍剂量进行灌胃）；除正常对照组外所有动物每日皮下注射5ml混合液（10％葡萄糖3ml、含适量生理盐水与20μmol／L KCl 2ml）以防低血糖，促肝细胞生长素组予促肝细胞生长素2mg／kg体重溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持续3d，观察造模后48h内大鼠病死率．并于第2次注射TAA后24h后腹主动脉采血测定肝功能（ALT、AST、TB），ABC-ELISA法检测血清TNF-α水平。迅速取肝组织，用10％甲醛液中固定，石蜡切片，检测肝组织病理变化及有丝分裂指数。用链霉菌抗生物素—过氧化酶法（SP法）检测增殖细胞核抗原、肝再生信号调节蛋白α1和白细胞分化抗原14。逆转录聚合酶链反应法检测白细胞分化抗原14mRNA的表达。 （2） 雄性Wistar大鼠24只，体重230～250g，随机分为正常组（假手术对照组）、模型组（肝切除手术组）、丹黄组和pHGF组4组，每组6只。大鼠自由喂养1周后，术前12h禁食，6h禁饮。丹黄组和pHGF组于手术前3天至实验结束，每日1次分别腹腔注射生理盐水4.0ml·kg-1体重、灌胃丹黄方10g·kg-1体重、和灌胃生理盐水4.0ml·kg-1体重、腹腔注射pHGF1 ml／100g，假手术对照组、肝切除手术组模型组分别给予腹腔注射0.85％生理盐水1 ml／100g，同时两组分别灌胃等体积的生理盐水。按照Higgins和Panis等介绍方法无菌条件下操作。1％戊巴比妥钠(用量40mg／kg体重-1)皮下注入麻醉动物，固定在自制的简易手术台上，剪去上腹部鼠毛，体积分数为2％的碘酊消毒，体积分数为75％的乙醇脱碘，盖洞巾，在大鼠上腹部做一个纵形长约1cm的切口，拉出左叶和中叶，用手术线在左叶和中叶根部结扎，切除肝脏左叶和中叶（占70％），术毕皮下给予生理盐水1ml，缝合刀口，消毒。假手术组动物仅开腹翻动肝左叶和中叶，不作肝叶切除，术后自由饮食水，所有动物无1例死亡。除正常组大鼠仅进行肝叶的牵拉，其余大鼠均进行70％肝叶切除复制模型。48h后，杀死动物，迅速取肝组织，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，逆转录聚合酶链反应法检测细胞癌基因fosmRNA、肝细胞生长因子mRNA、肝再生因子-1mRNA、神经生长因子诱导的抗增殖相关分泌蛋白mRNA、非受体型酪氨酸激酶mRNA和转化生长因子β1mRNA的表达。
杨宝山[10]（2005）在《复方甘草酸苷对暴发性肝衰竭保护作用的实验和临床研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨暴发性肝衰竭的发病机理及复方甘草酸苷（SNMC）对暴发性肝衰竭的保护作用和可能机制。方法:（1）用D-氨基半乳糖和脂多糖腹腔注射构建暴发性肝衰竭（FHF）的小鼠模型。观察 SNMC 对小鼠实验性肝损伤各组血浆谷丙转氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）、胆红素（TBIL）、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、一氧化氮（NO）、内皮素-1（ET-1）、白细胞介素-6（IL-6）和肝脏病理情况及小鼠存活率的影响: 电镜下观察细胞超微结构的改变。（2）将昆明种小鼠70只随机分为 A,B,C 三组,分别为正常对照组 （5只）、模型组（5只）和 SNMC 保护组（60只）,A 组和 B 组小鼠于给药后6 h 全部断颈处死,C 组于给药后6h,1d,3d,5d 和7d 各断颈处死5只,留取肝组织,应用末端转移酶标记技术（TUNEL）检测肝细胞原位凋亡的情况:应用免疫组化法分别检测肝组织中 Fas,Fas 配体（FasL）和天冬氨酸半光氨酸蛋白酶 -3（caspase-3）的表达。（3）选择2004年3月至2005年3月哈医大一、二院、黑龙江省医院、哈尔滨传染病院住院的暴发性肝衰竭病人（急性、亚急性重型肝炎）,共86人。其中治疗组每天静脉注射 SNMC120ml, 同时常规保肝支持对症治疗,对照组则仅用保肝支持对症治疗。对比观察两组血浆谷丙转氨酶（ALT）、胆固醇（CHOL）、胆红素（TBIL）、凝血酶原活动度（PTA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、一氧化氮（NO）、白细胞介素-6（IL-6）的变化情况及病情转归。结果:（1）D-氨基半乳糖和脂多糖可以构建暴发性肝坏死模型,SNMC 大、中、小剂量组及不同给药时间组在降低酶学指标及血浆 TNF-α、NO、ET-1、IL-6水平,改善肝组织的损伤程度方面与模型组比较均有非常显着的差异（P<0.01）。SNMC 大、中、小剂量以小剂量较好,不同给药时间以同时给药较好,但不同剂量和不同给药时间之间无显着意义（P>0.05）。模型组和保护组之间的存活率有非常显着的差别（P<0.01）。电镜可见典型的肝细胞凋亡,表现随治疗时间的延长明显改善。（2）SNMC 治疗组随着 SNMC 治疗时间的延长,凋亡指数逐渐降低,由6h 的32.3%降至 7d 的5%（33.2±4.4 vs 26.6±4.7,t=4.1 P<0.01）;Fas 及 caspase-3在 A 组有少量表达,FasL 未见表达。B 组 Fas,FasL 及 caspase-3、细胞色素 c 阳性表达细胞明显增加,C 组随治疗时间的延长,表达逐渐减少（80.1±11.3 vs 64.7±10.9,P<0.01:60.9±7.5vs43.1±7.8,P<0.01;84.0±5.5vs72.3 ±5.2,P<0.01;58.5±3.8vs46.3±5.5,P<0.01）。（3）SNMC 在降低酶学指标、改善肝功能情况及对有关炎症介质水平变化的影响方面,与对照组比较有非常显着的差异（p<0.01）,且对病人的临床表现及病情转归亦有非常显着的作用（p<0.01）。结论:（1）SNMC 对小鼠暴发性肝衰竭有明显的保护作用,可改善 D-氨基半乳糖和脂多糖所致的肝细胞病理性凋亡及坏死,并抑制各种因素所介导的炎症反应,从而降低暴发性肝坏死的病死率。（2）肝细胞异常凋亡在小鼠暴发性肝衰竭的发病中具有重要作用,其机理可能是通过 Fas/FasL 系统活化所介导的肝细胞凋亡,细胞色素 c 和线粒体在肝细胞凋亡中也具有一定作用:同时也证明 SNMC 对抑制细胞凋亡有一定作用。（3）SNMC 对暴发性肝衰竭病人有明显的保护作用,并抑制各种因素所介导的炎症反应,从而减少或缓解肝坏死的并发症,降低病人的病死率。
二、实验性暴发性肝功衰竭大鼠肝再生与一氧化氮的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、实验性暴发性肝功衰竭大鼠肝再生与一氧化氮的关系（论文提纲范文）
（1）LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 LR12 减轻TAA诱导的ALF小鼠肝脏损伤,促进肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LR12 通过作用于巨噬细胞促进TAA诱导的肝细胞损伤模型中肝细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LR12 通过促进巨噬细胞分泌CCL20 激活肝细胞内p38 MAPK途径促进TAA诱导的ALF小鼠肝细胞再生 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 急性肝衰竭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB及其调控炎症细胞因子的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 PDTC 对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB 及其调控炎症细胞因子的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞因子与暴发性肝衰竭 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB表达和细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 PDTC 对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κΒ表达和细胞凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞凋亡信号转导途径的研究进展 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）重组人Elafin对大鼠急性肝损伤作用的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 肝损伤机制研究进展 |
| 第二节 肝损伤治疗药物的研究进展 |
| 第三节 Elafin—弹性蛋白酶特异性抑制剂 |
| 第二章 重组人Elafin 对四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤作用的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 第三章 重组人Elafin 对D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝损伤作用的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读博士学位期间发表论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
（6）Pim-3基因对暴发性肝衰竭的肝保护效应研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 Pim-3基因克隆和质粒载体构建及其在真核细胞内的表达和活性研究 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.1.1 实验动物 |
| 2.2.1.2 细胞株和质粒来源 |
| 2.2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.1.4 主要试剂 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 RT-PCR方法克隆Pim-3 cDNA全长编码序列 |
| 2.2.2.2 质粒pEGFP-N2的扩增 |
| 2.2.2.3 基因重组技术 |
| 2.2.2.4 细胞培养技术 |
| 2.2.2.5 原代肝细胞的分离培养技术 |
| 2.2.2.6 MTT(即四唑盐比色法)分析 |
| 2.2.2.7 流式细胞检查 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 总RNA提取样品的纯度与质量 |
| 2.3.2 大鼠Pim-3基因全长编码cDNA扩增结果 |
| 2.3.3 转化菌平板筛选结果 |
| 2.3.4 重组体质粒pEGFP-N2/Pim-3酶切鉴定结果 |
| 2.3.5 全自动DNA测序分析结果 |
| 2.3.6 质粒体外转染肝癌细胞后绿色荧光蛋白的表达情况 |
| 2.3.7 Pim-3基因对肝癌SMMC7721细胞凋亡的影响 |
| 2.3.8 Pim-3基因对肝癌SMMC7721细胞增殖能力的影响 |
| 2.3.9 原位循环灌注后肝脏形态学的改变 |
| 2.3.10 原代分离培养肝细胞在基因转染后GFP的表达情况 |
| 2.3.11 Pim-3基因对原代培养肝细胞生存率的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 绿色荧光蛋白表达质粒经鼠尾静脉注射后的器官靶向性研究 |
| 3.1 概述 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.1.1 实验动物 |
| 3.2.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.1.3 主要试剂 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.2.1 溶液配制 |
| 3.2.2.2 动物处置 |
| 3.2.2.3 动物分组 |
| 3.2.2.4 流体力学注射方法 |
| 3.2.2.5 常规注射方法 |
| 3.2.2.6 标本采集 |
| 3.2.2.7 肝组织固定方法 |
| 3.2.3 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 不同注射方法对血清转氨酶的影响 |
| 3.3.2 常规尾静脉注射后组织绿色荧光蛋白表达情况 |
| 3.3.3 流体力学注射后组织绿色荧光蛋白表达情况 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 内毒素诱导D-半乳糖胺致敏大鼠急性肝损伤或肝衰竭实验模型的研究 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 实验动物 |
| 4.2.1.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.1.3 主要试剂 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 动物饲养 |
| 4.2.2.2 动物实验方法 |
| 4.2.2.3 血生化检测 |
| 4.2.2.4 光学显微镜检查 |
| 4.2.2.5 电子显微镜检查 |
| 4.2.2.6 TUNEL分析 |
| 4.2.2.7 RT-PCR |
| 4.2.2.8 Caspases活性分析方法 |
| 4.2.3 统计学处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 药物剂量与动物的生存率的关系 |
| 4.3.2 血生化检测结果 |
| 4.3.3 肝大体形态改变 |
| 4.3.4 肝组织病理学改变 |
| 4.3.5 肝细胞凋亡的TUNEL分析结果 |
| 4.3.6 肝组织炎症细胞因子的表达 |
| 4.3.7 肝组织iNOS mRNA表达情况 |
| 4.3.8 肝组织p53 mRNA的表达 |
| 4.3.9 24h处理组大鼠肝组织起始和效应Caspases活性检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 Pim-3质粒构建体在活体肝组织表达和活性的研究 |
| 5.1 概述 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 实验动物 |
| 5.2.1.2 质粒 |
| 5.2.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.2.1.4 主要试剂 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 动物实验方法 |
| 5.2.2.2 肝细胞凋亡诱导方法 |
| 5.2.2.3 肝靶向性活体基因转染方法 |
| 5.2.2.4 荧光显微镜检查 |
| 5.2.2.5 RT-PCR |
| 5.2.2.6 细胞凋亡的TUNEL分析 |
| 5.2.2.7 Caspase-3活性检测 |
| 5.2.3 统计学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 报告基因GFP在肝组织的表达 |
| 5.3.2 大鼠肝组织Pim-3基因的表达 |
| 5.3.3 大鼠肝组织细胞凋亡的TUNEL分析结果 |
| 5.3.4 大鼠肝组织Caspase-3活性检测 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 Pim-3基因对暴发性肝衰竭大鼠的肝保护作用及其机制 |
| 6.1 概述 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.1.1 实验动物 |
| 6.2.1.2 质粒来源 |
| 6.2.1.3 主要仪器与设备 |
| 6.2.1.4 主要试剂 |
| 6.2.2 实验方法 |
| 6.2.2.1 动物实验 |
| 6.2.2.2 暴发性肝衰竭大鼠模型的建立 |
| 6.2.2.3 肝靶向性活体基因转染方法 |
| 6.2.2.4 血清转氨酶的检测 |
| 6.2.2.5 荧光显微镜检查 |
| 6.2.2.6 细胞凋亡的TUNEL分析 |
| 6.2.2.7 Caspase-3活性检测 |
| 6.2.2.8 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 6.2.2.9 蛋白免疫印迹(Western blot)检测 |
| 6.2.2.10 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 6.2.3 统计学分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 各组大鼠死亡情况 |
| 6.3.2 血清转氨酶检测结果 |
| 6.3.3 各组大鼠肝组织GFP表达情况 |
| 6.3.4 肝组织病理切片检查结果 |
| 6.3.5 肝细胞凋亡的TUNEL分析结果 |
| 6.3.6 肝组织Caspase-3活性分析结果 |
| 6.3.7 肝组织目的基因Pim-3的表达 |
| 6.3.8 大鼠肝组织和血清炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的表达 |
| 6.3.9 肝组织损伤性基因iNOS mRNA的表达 |
| 6.3.10 肝组织凋亡诱导基因p53的表达 |
| 6.3.11 肝组织Bax基因的表达 |
| 6.3.12 Bcl-2蛋白质表达 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 进一步工作的方向 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 附录B |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
（7）茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英对照表 |
| 前言 |
| 实验一 茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠模型的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型大鼠肝再生的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠模型细胞因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠模型HMGB1mRNA的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五 茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型脑组织AQP-4mRNA的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六 茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠模型CD14mRNA的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 讨论 |
| 1、急性肝衰竭模型评价 |
| 2 阳性药选择依据 |
| 3 急性肝衰竭的机理探讨 |
| 4 肝衰竭的中医认识现状及对策 |
| 5 茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
（8）NF-κB在实验性暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 NF-κB 在实验性暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及其机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 NF-κB 的激活与调控在肝损伤中的作用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 实验一 丹黄方对硫代乙酰胺致大鼠急性肝衰竭的影响 |
| 实验二 丹黄方对大鼠急性肝衰竭肝再生作用的实验研究 |
| 实验三 丹黄方对大鼠急性肝衰竭肝再生过程中CD14的影响 |
| 实验四 丹黄方对大鼠肝再生过程中HGF影响的实验研究 |
| 实验五 丹黄方对大鼠肝再生过程中Tec影响的实验研究 |
| 实验六 丹黄方对大鼠肝再生过程中PC3、c-fos、LRF-1影响的实验研究 |
| 实验七 丹黄方对大鼠肝再生过程中TGFβ1影响的实验研究 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 博士生期间发表论文、主持课题及科研奖励 |
| 文献综述 |
| 文献综述1 重型肝炎／肝衰竭的发病机制及中医药治疗进展 |
| 文献综述2 大黄药理研究及在肝病治疗中的研究进展 |
| 致谢 |
四、实验性暴发性肝功衰竭大鼠肝再生与一氧化氮的关系（论文参考文献）
- [1]LR12在TAA诱导的急性肝衰竭中的治疗作用及机制研究[D]. 王永娟. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）[J]. 国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室. 世界科学技术-中医药现代化, 2013(05)
- [3]PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB及其调控炎症细胞因子的影响[D]. 任晓娟. 河北医科大学, 2009(10)
- [4]PDTC对暴发性肝衰竭大鼠肝组织NF-κB表达和细胞凋亡的影响[D]. 刘倩. 河北医科大学, 2009(10)
- [5]重组人Elafin对大鼠急性肝损伤作用的研究[D]. 蒋春晓. 吉林大学, 2008(11)
- [6]Pim-3基因对暴发性肝衰竭的肝保护效应研究[D]. 刘亮明. 南昌大学, 2007(01)
- [7]茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的影响[D]. 余立敏. 湖北中医学院, 2007(04)
- [8]NF-κB在实验性暴发性肝衰竭肝细胞炎症损伤中的作用及其机制[D]. 宋慧娟. 河北医科大学, 2007(06)
- [9]丹黄方对急性肝衰竭及肝再生大鼠作用的实验研究[D]. 朱清静. 湖北中医学院, 2006(11)
- [10]复方甘草酸苷对暴发性肝衰竭保护作用的实验和临床研究[A]. 杨宝山. 第二届全国人工肝及血液净化学术年会论文集, 2005