一、wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建（论文文献综述）
余新刚[1]（2019）在《miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究》文中研究说明黄牛和水牛是日本血吸虫（Schistosoma japonicum）的重要天然宿主,也是我国血吸虫病的主要传染源。它们对日本血吸虫感染呈现不同的适宜性,进而导致血吸虫在宿主体内的生长发育、存活以及对宿主的致病作用呈现较大差异。为了探究miRNAs在血吸虫生长发育以及与宿主相互作用过程中的调节作用,本研究采用高通量测序技术（Illumina的Hiseq Xten测序）对来自黄牛（适宜性宿主）和水牛（非适宜性宿主）的日本血吸虫成虫以及感染前（T1）、感染后14 d（T2,早期感染）和感染后42 d（T3,急性感染）黄牛和水牛的血浆、外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）的miRNA进行测序,比较黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的差别以及黄牛和水牛血浆和PBMC在感染前后miRNA表达谱的变化,并对日本血吸虫真核翻译起始因子（eukaryotic initiation factor 4,eIF4A）的生物学功能进行初探。上述研究可为抗血吸虫疫苗候选分子和新药靶标的筛选提供新的思路。1.黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛来源的日本血吸虫成虫miRNA的表达谱,分别获得了6378万和6321万条miRNA序列。通过生物信息学分析鉴定了206个miRNAs,包括79个已注释的日本血吸虫miRNAs、127个与其他物种miRNAs高度相似的新miRNAs。其中,5个已注释的miRNAs（sja-miR-124-3p、sja-miR-219-5p、sja-miR-2e-3p、sja-miR-7-3p和sja-miR-3490）在水牛组虫体中呈现显着性上调表达,10个新的miRNAs在两组虫体中呈现差异表达。sja-miR-124-3p在黄牛和水牛源虫体中的表达趋势与啮齿类宿主来源虫体一致,可参与调节日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A等的表达。双荧光素酶报告试验证实sja-miR-219-5p可与靶基因Hsc20特异序列结合。5个已注释的差异表达miRNAs可能参与268个靶基因的生物学功能调节,包括虫体的咽肌发育、嘌呤代谢、减数分裂的胞质分裂、减数分裂中纺锤体的定位、细胞骨架依赖性细胞内运输、r RNA加工、m RNA运输、蛋白质运输和繁殖等过程。其中,sja-miR-124-3p和sja-miR-219-5p可能通过调控虫体的神经系统发育、应激反应等进而影响虫体在两宿主体内的生存及发育。2.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛在血吸虫感染不同时期血浆中miRNA的表达谱。测序后共获得352,727,942条有效序列,平均每个样本有14,696,997条。黄牛和水牛组血浆miRNA的基因组比对率分别为90.80%和99.60%。黄牛和水牛血浆在血吸虫感染各期已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为444和438个。与感染前相比,黄牛和水牛血浆在感染早期分别有3个和9个miRNAs呈现特异性差异表达;在急性感染期黄牛和水牛血浆有9个miRNAs呈现共性差异表达,黄牛和水牛血浆分别有39和23个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,在急性感染期黄牛与水牛血浆有4个miRNAs呈现共性差异表达,分别有35和5个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在感染早期,黄牛和水牛血浆miRNAs在脂肪酸代谢和胰岛素信号通路调节中存在很大差异,可能影响虫体在两宿主体内的生存及发育。3.黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析。采用高通量测序技术比较了黄牛和水牛PBMC在血吸虫感染不同时期miRNA的表达谱。测序后共获得228,483,170条序列,平均每个样本有9,520,132条有效序列。在血吸虫感染各时期黄牛和水牛PBMC中已注释的miRNAs有1,030个,新发现的miRNAs分别为234和228个。与感染前相比,黄牛与水牛PBMC之间在T3/T1期有45个miRNAs呈现共性差异表达,另有111和69个miRNAs呈现特异性差异表达。与感染早期相比,黄牛和水牛PBMC在T3/T2期有64个呈现共性差异表达,另有147和36个miRNAs呈现特异性差异表达。GO分类和KEGG分析发现这些差异表达miRNAs的靶基因与多个信号通路有关。在急性感染期,黄牛和水牛PBMC的miRNAs在Th1/Th2型细胞因子、Toll样受体信号通路等方面存在差异,可能影响宿主的免疫应答。4.日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析。根据Gen Bank中日本血吸虫eIF4A的基因序列（FN315265.1）设计引物,扩增Sj-eIF4A基因;构建其重组表达质粒并转化感受态细胞。采用IPTG诱导表达并纯化该重组蛋白。采用q RT-PCR法检测Sj-eIF4A在不同发育阶段以及不同适宜性宿主来源虫体的转录水平。在体内外对21 d童虫中该基因进行RNA干扰实验,通过扫描电镜观察RNA干扰对虫体繁殖和结构的影响。结果显示,Sj-eIF4A基因全长为1179 bp,编码392个氨基酸,融合蛋白Mr约为46 k Da。Sj-eIF4A在被检的日本血吸虫不同发育阶段均有表达,尤其在毛蚴、14 d童虫以及42 d雌虫体内转录水平较高;在适宜性宿主黄牛和BALB/c小鼠来源虫体内的转录水平高于非适宜性宿主水牛和Wistar大鼠。Sj-eIF4A特异性si RNA不仅能够有效抑制虫体Sj-eIF4A的转录水平并诱导小鼠产生20.63%的减虫率和31.21%的肝脏减卵率,而且能够引起雌虫的排卵异常以及虫体腹吸盘和雌雄虫部分体表结构发生改变。综上所述,本文对黄/牛来源日本血吸虫miRNA的表达差异及黄牛和水牛感染前后PBMC和血浆miRNA表达差异进行了比较分析,并对日本血吸虫真核翻译起始因子Sj-eIF4A进行了克隆表达和基因特性分析。发现了一些对血吸虫生长发育和宿主免疫应答至关重要的虫源性和宿主源性miRNA分子,初步探明了Sj-eIF4A在日本血吸虫生长发育中的重要作用,为揭示不同适宜性宿主与日本血吸虫间的相互作用提供了有价值的信息,也为寻找抗日本血吸虫有效的疫苗候选分子或新药靶标提供了新思路。
李冰[2]（2018）在《犬血清白蛋白融合干扰素γ的制备及功能研究》文中研究指明IFN-γ是II型干扰素家族的唯一成员,主要由受到病原微生物或干扰素诱导剂刺激的Th1淋巴细胞、CD8+细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生。IFN-γ具有抗病毒、抑制细胞增殖、免疫调节功能,是一种能够刺激机体产生炎症反应的免疫调节因子。目前人类临床上,IFN-γ主要用于慢性淋巴肉芽肿,风湿性关节炎、过敏性皮炎及肾脏肿瘤。尽管IFN-γ具备多种生物功能,但其半衰期短副作用大等问题一直限制着它的应用范围。干扰素在兽医临床上的使用较少,虽然有少量产品上市多为原核表达产物,生物活性较低,治疗效果不佳。血清白蛋白融合技术是目前长效药物研发中较为成熟的手段之一,该方法具有操作较为简单且成本较低的优势。杆状病毒表达系统安全性好、蛋白表达量高、生物活性好、能够同时表达多个基因重组蛋白;且Sf9细胞本身以分泌形式表达细胞外的代谢蛋白量较少,利用杆状病毒系统进行外源分泌型蛋白的表达还具易于纯化的优点。所以本研究采用杆状病毒表达系统对犬血清白蛋白融合干扰素γ进行了表达,以此为基础进一步探索利用白蛋白融合技术制备新型IFN-γ长效制剂的可行性,具体研究如下:首先采用特异性引物对犬血清白蛋白基因及犬干扰素γ基因进行特异性扩增。采用重叠PCR技术,引入柔性连接桥序列GS（GGGGS）2GS对犬血清白蛋白基因及犬干扰素γ基因进行融合,获得融合基因CSA-IFN-γ和IFN-γ-CSA,再将融合基因插入pFastBac I质粒中构建转移载体pFastBac-CSA-γ与pFastBac-γ-CSA。通过蓝白斑筛选,获得重组杆粒Bacmid-CSA-IFN-γ和Bacmid-IFN-γ-CSA。将其转染至Sf9细胞后筛选出能够稳定表达融合蛋白CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的重组杆状病毒。继病毒纯化、PFU测定及蛋白表达情况监测等一系列试验后确定了最佳接毒剂量以及重组蛋白收获时间,利用离子交换层析的方法获得了纯化的CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的融合蛋白。基于IFN-γ的生物活性特点,利用体外实验对犬血清白蛋白融合干扰素γ的活性进行了初步测定。结果显示,与犬重组干扰素γ（reIFN-γ）相比,融合干扰素CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA均能够促使STAT1蛋白发生磷酸化,初步证明采用血清白蛋白融合的方法对犬IFN-γ进行修饰不会导致其丧失生物活性。用MDCK-VSV系统对融合干扰素的抗病毒活性进行了测定,CSA-IFN-γ的效价为3.3×104 U/mg、IFN-γ-CSA的效价为9.7×104 U/mg,融合干扰素抗病毒活性略低于reIFN-γ（1.36×105 U/mg）。DH82肿瘤细胞体外生长抑制实验结果显示CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA对肿瘤细胞具有抑制生长活性但略低于reIFN-γ,CSA-IFN-γ的IC50值为106.91 ng/mL、IFN-γ-CSA为39.84ng/mL、reIFN-γ为18.16 ng/mL。同时对干扰素处理后的DH82细胞形态进行观察,处理72 h后,细胞折光性发生改变、拉丝明显、个别细胞萎缩严重,且有大量死细胞悬浮于培养基中,初步判定融合干扰素可能诱发了DH82肿瘤细胞的凋亡。进而对融合干扰素CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的促凋亡作用进行验证,结果显示在10倍于reIFN-γ的剂量对DH82细胞进行处理后,72 h后可明显的检测到CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA的促凋亡作用,且与reIFN-γ的促凋亡程度基本一致。同时对处理后的细胞周期进行了验证,48 h后,可明显检测到IFN-γ-CSA及reIFN-γ使DH82细胞阻滞于G0/G1期,CSA-IFN-γ处理组阻滞效果不明显;在处理后72 h,组间差异基本消失,CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA与reIFN-γ使DH82细胞阻滞于G0/G1期。Wistar大鼠体内药代动力学检测结果显示,与reIFN-γ（2.22 h）相比融合干扰素的半衰期有所提高,C-端修饰产物IFN-γ-CSA的半衰期为6.51 h,仅延长了约2倍,N-端修饰产物CSA-IFN-γ的半衰期为21.73 h,明显高于reIFN-γ及IFN-γ-CSA,表明在N-端对犬IFN-γ进行修饰可显着提高其药物半衰期。为进一步了解融合干扰素γ的治疗作用,用犬肾移植瘤模型检测了融合干扰素γ的体内抗肿瘤活性,结果显示CSA-IFN-γ、IFN-γ-CSA和reIFN-γ均能抑制DH82肿瘤细胞的生长,CSA-IFN-γ的肿瘤抑制效果要明显优于IFN-γ-CSA和reIFN-γ。综合分析融合干扰素体内外生物活性检测结果,发现利用血清白蛋白对犬IFN-γ进行修饰不会导致其生物活性的丧失,且N-端修饰能够显着提高犬IFN-γ的半衰期,更重要得是提高了犬IFN-γ在动物体内的抗肿瘤能力。所以本研究利用血清白蛋白修饰技术能够平衡犬干扰素γ在药代动力学和药效学之间的关系,此方法为开发新型犬类专用的细胞因子类药物奠定了基础。
余子琪,陈蕾,章慧芳,陈建勇[3]（2017）在《p120-连环蛋白对大鼠急性肝衰竭的保护作用》文中研究说明目的探讨p120-连环蛋白（p120cnt）表达对急性肝衰竭（ALF）内皮损伤和炎性激活的影响,分析p120cnt的抗炎效应是否可以通过对Epac1信号通路的调控来发挥作用。方法查询GenBank中大鼠p120cnt cDNA文库,设计引物,PCR扩增目的基因,琼脂糖电泳鉴定结果。经酶切、连接克隆至带绿色荧光蛋白（GFP）的表达载体,转化E.Coli JM109并筛选阳性菌落,提取重组质粒后酶切,测序验证,确保表达框无误。选择健康雄性Wistar大鼠36只,按随机数字表法分为正常对照组、ALF模型组、质粒转染+ALF建模组,每组12只。脂多糖（LPS）联合D-GalN法构建ALF动物模型,使用裸质粒流体力学基因转染法转染大鼠,肝组织切片荧光显微镜观察转染是否成功。以上处理12h后处死大鼠取肝组织切片进行HE染色及TUNEL分析,评估各组肝细胞坏死程度;半定量RT-PCR评估各组肝组织p120cnt mRNA及Epac1mRNA表达水平。结果 PCR扩增目的基因,1.2%琼脂糖电泳显示目的基因约2800bp。真核表达重组体pCMV/p120ctn提取质粒后酶切,酶切产物基因测序显示质粒构建正确。基因转染后大鼠肝组织切片内可见大量GFP表达说明转染已成功。大鼠肝组织切片HE染色及TUNEL分析说明质粒转染+ALF建模组肝细胞坏死严重程度低于ALF模型组。大鼠肝组织p120cnt mRNA表达强弱顺序为:正常对照组>质粒转染+ALF建模组>ALF模型组（均P<0.01）。大鼠肝组织Epac1mRNA表达强弱顺序为:质粒转染+ALF建模组>ALF模型组>正常对照组（P<0.05或P<0.01）。结论 p120cnt存在对ALF的抗炎作用和肝保护作用;p120cnt对肝组织急性炎症的抑制效应与上调Epac1基因表达有关。
樊欣[4]（2014）在《机械拉伸对成骨细胞基因表达及可变剪接的研究》文中研究说明人体内许多组织和器官都受到来自生理环境的不同类型和大小的应力作用，骨是人体内重要的结构和功能组织，研究应力作用对骨组织生长发育的影响有助于骨组织修复工程的发展。应力刺激可以改变细胞内基因的表达和可变剪接过程，本文利用生物力学、分子生物学等手段研究拉伸刺激对成骨细胞内力响应基因的表达和可变剪接的影响，以及可能的可变剪接调控机制。主要研究内容和结果如下：培养小鼠成骨细胞株MC3T3-E1和人永生化表皮细胞株HaCaT，倒置显微镜下观察细胞生长状态良好，MC3T3-E1细胞呈纤维样细胞型，HaCaT细胞呈上皮样细胞型。将成骨细胞MC3T3-E1接种到硅橡胶膜上，应用自主设计制作的应力拉伸装置对MC3T3-E1细胞施加拉伸刺激，加载参数为：应变量15%、频率30次/min、加载时间分别为3h和6h，收集细胞提取总mRNA和蛋白，研究拉伸刺激对VEGF、CD44和cyclinD1基因表达的影响。RT-PCR检测发现拉伸前后VEGF基因主要表达剪接变异体VEGF188、VEGF164和VEGF120，CD44基因主要表达剪接变异体CD44S和CD44E，cyclinD1基因主要表达剪接变异体cyclinD1a。利用q-PCR和western blot检测表达量变化发现拉伸刺激后VEGF及其剪接变异体VEGF164和VEGF120表达量明显上调，cyclinD1及其剪接变异体cyclinD1a表达量明显下调，而CD44及其剪接变异体CD44S和CD44E表达量改变不明显。构建剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1的真核表达质粒pcDNA3.1（+）-EGFP-ASF/SF2、pcDNA3.1（+）-EGFP-SC35和pcDNA3.1（+）-EGFP-hnRNPA1，转染HaCaT细胞以模拟拉伸刺激后细胞内剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1表达上调的状态，研究应力拉伸环境下剪接因子ASF/SF2、SC35和hnRNPA1对VEGF基因可变剪接的影响。荧光显微镜下观察到表达质粒转染效率约70%，western blot检测ASF/SF2、SC35和hnRNPA1蛋白的表达，检测结果证明其表达量明显增加。且过表达ASF/SF2和SC35后VEGF剪接变异体VEGF188、VEGF164和VEGF120蛋白表达量显着下调，而过表达hnRNPA1对VEGF剪接变异体的表达改变不明显。说明ASF/SF2和SC35参与应力拉伸环境下对VEGF基因可变剪接的调控过程，而hnRNPA1不参与该过程。
张颖慧[5]（2014）在《STRIP1和突变型STRIP1在小鼠足细胞中的作用机制研究》文中研究表明研究目的我们曾获得一经临床及病理证实的家族遗传性局灶节段性肾小球硬化症（fami-lial focal and segmental glomerulosclerosis, FFSGS）大家系，在国家自然基金的资助下，对包括5代共54名成员在内的所有人员（未出现肾脏疾病的成员和FFSGS患者）进行连锁分析及全外显子测序（与深圳华大基因研究院合作），获得其致病基因为STRIP1（striatin interacting protein1）。并且经过初步体内实验发现在膜性肾病大鼠模型PHN、微小病变大鼠模型PAN这些典型足细胞病动物模型中，大鼠肾脏的strip1表达量增高，并且随建模时间的延长而增加。为研究STRIP1是否与足细胞病变有关，是否会通过影响细胞形态和骨架结构导致足细胞功能的改变，我们以MPC（mouse podocyte clones，小鼠足细胞克隆）细胞系为基础，探究小鼠野生型Strip1在足细胞中的功能和突变型Strip1的致病机制。本实验将从足细胞形态、骨架和Strip1相关蛋白等方面研究Strip1的功能作用机制，为未来诊断和治疗相关的足细胞疾病提供新的思路和依据。研究方法通过构建Strip1基因沉默，野生型过表达和突变型过表达小鼠肾脏足细胞模型，研究Strip1在小鼠足细胞中的作用。实验设计如下：①针对小鼠Strip1基因设计干扰靶点、合成RNAi序列构建干扰腺病毒；②构建小鼠Strip1基因野生型和突变型过表达腺病毒；③用腺病毒感染完全分化成熟的MPC细胞，构建沉默、野生型和突变型过表达等细胞模型；④通过细胞免疫荧光、qPCR和western blotting观察Strip1基因的功能；⑤通过细胞免疫荧光、qPCR和western blotting观察突变型strip1在小鼠肾脏足细胞中的作用。结果成功构建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型和突变型过表达载体腺病毒：①所有构建载体（包括RNAi、野生型和突变型）的目的片段序列正确；②试感染MPC细胞，所有腺病毒均可表达，效果非常理想（P<0.01）；③获得滴度高达1011TCID50/ml的三种目的腺病毒。成功构建小鼠Strip1基因的RNAi、野生型过表达足细胞模型，观察Strip1对小鼠足细胞的作用：通过细胞免疫荧光观察，①strip1蛋白表达量降低时，细胞形态改变，边缘不规则，足突结构改变，外伸足突伸展不足。F-actin和α-tubulin分布紊乱；②当strip1蛋白表达量显着增高时，细胞变大变圆，边缘改变，足突结构破坏，伪足样足突伸展形态改变。F-actin明显边缘化，排列成了一个又大又圆的球形，边缘明亮，中间断续，α-tubulin完全失去了规则的排列方式；③Strip1表达量改变时，nephrin表达量变少；④ARP2和CTTNBP2的分布也发生了改变，部分strip1过表达细胞的细胞核变大变圆，ARP2在核周的分布形成了一个不完整的环形。通过western blotting发现：在完全分化的终末分化MPC细胞中，①F-actin和α-tubulin表达量随strip1变化；②nephrin随Strip1变化表达量降低。通过Real time PCR发现：F-actin和α-tubulin mRNA的变化与趋势相同（P＜0.05）。成功构建突变型Strip1基因过表达足细胞模型，观察突变型Strip1对小鼠足细胞的作用：通过细胞免疫荧光观察，①突变的strip1蛋白在细胞内表达，细胞形态发生了明显改变，边缘伸展的足突结构异常，细胞边缘明显不规则。F-actin和α-tubulin的分布均随细胞形态的改变而化变，F-actin分布更加边缘化，α-tubulin也失去了正常的排列；②nephrin表达减少。通过western blotting发现：突变细胞膜型中，①F-actin表达量增高；②nephrin表达量降低。通过Real time PCR发现：F-actin mRNA的变化与趋势相同（P＜0.05），Arp2mRNA表达量降低（P＜0.05）。结论Strip1影响小鼠肾脏足细胞的骨架排列，它的异常会导致肌动骨架蛋白F-actin和微管蛋白α-tubulin的分布和表达异常，细胞正常形态消失，足突结构破坏，Strip1可能通过影响CTTNBP2的蛋白修饰影响细胞的骨架蛋白排列。且Strip1表达异常时，有F-actin支撑固定于裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丢失，从而导致足细胞功能的损伤。突变型Strip1影响足细胞骨架结构和分布，细胞形态改变，足突结构消失，裂孔隔膜的功能蛋白nephrin丢失。实验结果显示，发生突变的Strip1与F-actin相互作用，可能通过Arp2影响nephrin的表达。综上所述，Strip1基因对维持足细胞正常形态和功能起重要作用，改变F-actin分布以致影响骨架分布，结构消失，使裂孔隔膜处锚定nephrin的丢失。该基因的此位点突变可能与足细胞病发生有关，且主要与足突结构消失和nephrin减少相关。
肖思佳[6]（2013）在《重组草菇免疫调节蛋白（reFIP-vvo）在毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33中的表达及其生物学活性初探》文中认为真菌免疫调节蛋白家族是一类从大型真菌中提取出来的结构活性相似的小分子蛋白。到目前为止，至少有九种真菌免疫调节蛋白，即LZ-8，FIP-fve，FIP-vvo，FIP-gts，FIP-gja，FIP-gsi，FIP-tvc，FIP-aca和FIP-gmi，它们分别从赤灵芝、金针菇、草菇、松杉灵芝、紫灵芝、紫芝、云芝、樟芝和小孢灵芝等中被发现。该家族成员具有多种体内外生物学活性。从草菇（Volvariella volvacea）中提取的草菇免疫调节蛋白（FIP-vvo）自从1997年被发现至今，尚未在真核表达系统中进行过异源重组表达。本论文根据天然草菇免疫调节蛋白的氨基酸序列，对编码重组草菇免疫调节蛋白（reFIP-vvo）的基因进行了重新设计，使其能够在毕赤酵母X-33表达体系中高效稳定表达。构建了毕赤酵母X-33重组表达载体pPICZαA-reFIP-vvo。用电转化法将目的片段导入酵母基因组中，经Zeocin抗性培养基和PCR鉴定等筛选出成功整合到酵母基因组的酵母工程菌。将酵母工程菌进行摇瓶振荡培养和发酵罐发酵培养，重组草菇免疫调节蛋白的表达量为410mg/L。Westem blot结果表明重组表达的reFIP-vvo为能够正确表达并正确折叠的目的蛋白。reFIP-vvo发酵液经过低温透析和阳离子柱层析纯化后得到蛋白纯度为90%的目的蛋白。血细胞凝集实验表明，reFIP-vvo可凝集大鼠红细胞，与天然蛋白一致，而且可以凝集绵羊红细胞。WST-1法结果表明，reFIP-vvo在3μg/mL可最大程度促进小鼠脾细胞增殖。本论文获得了reFIP-vvo在毕赤酵母X-33中的高效重组表达，并证实了reFIP-vvo具有和天然蛋白相类似的生物学活性。这在国内外均属首次。本论文得到了如下结论：（1）本论文是继1997年Hsu等人首次从草菇子实体中提取分离出FIP-vvo并对其生物活性进行分析后，首次在真核表达体系中对其进行的重组表达。且重组表达后的reFIP-vvo具有和天然FIP-vvo完全相同的氨基酸序列；（2）发现了一种编码草菇免疫调节蛋白的基因序列；（3） reFIP-vvo经过血细胞凝集及淋巴细胞增殖实验等生物活性鉴定，表明在酵母表达系统中利用基因重组表达技术构建表达的的reFIP-vvo具有一定的生物活性。为进一步研究reFIP-vvo的生物活性打下基础。
刘金朋[7]（2011）在《猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒（Porcine circovirus, PCV）为圆环病毒科圆环病毒属成员,PCV分为PCV1和PCV2两种基因型。PCV2具有致病性,不仅与近年来在世界各国普遍发生的断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）密切相关,而且还与猪皮炎肾病综合征、仔猪先天性震颤以及母猪繁殖障碍等疾病有关。PCV2除引起猪体发生原发感染甚至死亡之外,还侵害猪的淋巴系统,从而导致免疫抑制,继发感染猪猪繁殖与呼吸综合征、猪流感、猪瘟、猪伪狂犬等病毒性传染病,使疫情加重,已给全球养猪业造成相当严重的经济损失。目前国内外能有效防制本病的疫苗较少,因此,研制安全而有效的疫苗,将有利于彻底控制乃至根除PCV2。自从1990年出现基因免疫以来,已有许多病毒的保护性抗原基因被导入各种动物体内,产生了很好的免疫效果。DNA疫苗作为第3代疫苗,由于有着其独特的优点而受到研究人员的瞩目。但是DNA疫苗在机体内表达量低,单独使用所诱导机体产生的抗体水平,还不足以完全有效抵抗致死剂量病原体的攻击。怎样增强免疫保护效果成为目前DNA疫苗研究的关键。许多研究表明,IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-18等细胞因子能增强抗原的免疫原性。真核双表达载体pIRES是双顺反子结构,具有两个多克隆位点（MCS A和B）。本研究根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS A的酶切位点和PCV2临颍株（LY株）全基因组核苷酸序列,设计、合成1对引物,PCR扩增PCV2 ORF2全基因。将XhoⅠ与MluⅠ双酶切获得的ORF2基因片段克隆到同样处理的真核表达载体pIRES中,构建重组真核表达质粒pIRES-ORF2。根据真核表达载体pIRES启动子下游的MCS B的酶切位点和重组质粒pGEM-T-PIL18、pGEM-T-PIL2中猪IL-18（PIL-18）、猪IL-2（PIL-2）基因核苷酸序列,设计、合成2对引物,扩增PIL-18、PIL-2全基因。将SalⅠ与NotⅠ双酶切获得的PIL-18、PIL-2基因片段分别重组到真核表达载体pIRES和pIRES-ORF2的MCS B酶切位点SalⅠ与NotⅠ之间,构建重组真核表达质粒pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18和pIRES-ORF2/PIL2。为测定构建的编码PCV2衣壳蛋白ORF2基因与猪IL-18或猪IL-2基因联合免疫的试验效果,将pIRES-ORF2、pIRES-PIL18、pIRES-PIL2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2分别肌肉接种免疫6周龄雌性昆明小鼠,两周后加强免疫一次。二免后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鼠的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第1周用PCV2强毒进行攻击。结果显示,pIRES-ORF2、pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组均能诱导鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中pIRES-ORF2/PIL18与pIRES-ORF2/PIL2免疫组的ELISA抗体水平和T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pIRES-ORF2免疫组（P<0.01）,能抵抗PCV2强毒的攻击。表明细胞因子能明显增强PCV2 DNA疫苗的免疫原性。
刘中成[8]（2008）在《IL-1ra-Fcε融合蛋白功能及对变应性哮喘的治疗作用研究》文中研究说明支气管哮喘是在一定遗传背景之上,由多种因素参与的慢性气道炎症疾病,发病率与死亡率呈逐年升高的趋势。白细胞介素-1 （IL-1）为体内作用较强的致炎症细胞因子之一,在哮喘病发生、发展过程中具有重要作用。白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）是天然的IL-1拮抗剂,能在受体水平拮抗IL-1的作用,研究证实,IL-1ra具有治疗和预防哮喘的作用。在哮喘发病过程中,IgE与其高亲和力受体的结合是触发肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒导致哮喘发病的关键因素之一。阻断IgE与其高亲和力受体的结合是治疗哮喘的有效靶点,具有极大的发展潜力。本研究将IL-1ra和Fcε的功能进行了整合,利用基因工程技术将IL-1ra和IgE分子恒定区构建成融合蛋白,形成具有双重功能活性的新型蛋白分子,一方面拮抗IL-1的生物学效应并延长IL-1ra半衰期,另一方面抑制IgE与其高亲和力受体结合,从而达到防治哮喘的目的。本研究首次构建了人源及鼠源Fcε与人IL-1ra融合基因,并在原核表达系统中实现了高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。采用分子筛和离子交换层析对表达产物进行了纯化,获得了较高纯度的重组IL-1ra-Fcε融合蛋白,并采用逐步降低变性剂浓度的方式对融合蛋白进行了复性。EL-4/CTLL-2细胞学活性研究显示此融合蛋白可拮抗IL-1生物学活性,较IL-1ra活性无显着性变化;RBL-2H3细胞活性分析显示融合蛋白可与其表面的FcεRI相结合,又可抑制IgE介导的RBL-2H3细胞凋亡。为了分析以基因治疗方式给药时,IL-1ra-Fcε融合分子对变应性哮喘的治疗作用,我们构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1ra-Fcε,将其转染293T细胞,并经气管滴注方式滴入大鼠肺部。结果表明,融合基因IL-1ra-Fcε在转染后的293T细胞及大鼠肺组织中均得到表达。为了评价IL-1ra-Fcε融合分子对变应性哮喘的治疗作用,我们建立了大鼠变应性哮喘模型,通过蛋白静脉给药及基因治疗的方式分析了IL-1ra-Fcε对哮喘的治疗情况。通过对大鼠生理状态观测、肺功能测定、BALF中炎性细胞变化情况、血清中IgE及BALF中IL-4和IFN-γ含量测定、外周血中T细胞亚群变化、血管通透性以及肺组织病理变化等指标的检测,证实了IL-1ra-Fcε对变应性哮喘具有治疗作用,比较发现其治疗作用显着优于IL-1ra的治疗效果。免疫组化研究证实STAT6与哮喘发病严重程度相关。基因治疗的方式可能由于给药方式的原因,个体差异较大,但仍能显示对变应性哮喘具有一定的治疗效果。我们又对融合蛋白的治疗机制进行了初步分析。研究发现,在IgE诱导RBL-2H3细胞凋亡过程中仅对IgE信号途径中的关键信号分子Syk磷酸化水平产生了影响,而未影响IL-1信号途径中关键的信号分子IRAK1磷酸化水平,表明RBL-2H3细胞凋亡过程仅触发了IgE信号途径,而不能对IL-1信号途径产生影响;动物整体水平发现,单纯以IL-1ra为治疗药物即可同时触发IL-1信号途径及IgE信号通路;体内外实验均表明RBL-2H3细胞凋亡及哮喘发病过程中均可对NF-κB活性产生了影响,通过与IL-1ra治疗效果比较可以推断IL-1ra-Fcε融合蛋白的双功能活性均发挥了作用。所以我们认为炎性反应在变应性哮喘治疗中具有重要意义。初步药物代谢动力学分析结果表明IL-1ra-Fcε半衰期较IL-1ra得到了显着的延长,与预期结果相符。综上所述,1)构建了IL-1ra-Fcε融合基因,实现了在原核表达系统中的高效表达,经纯化、复性后,获得了较高活性的重组蛋白;2)构建了真核表达载体pIRES2- EGFP-IL-1ra-Fcε,分析了此载体对哮喘发病的预防作用;3)IL-1ra-Fcε对变应性哮喘具有较好的治疗作用,效果优于IL-1ra;4)验证了IL-1信号通路及IgE与受体作用信号通路在变应性哮喘中的作用,证实了炎性反应在哮喘发病机理中起主要作用;5)IL-1ra-Fcε融合蛋白分子半衰期较IL-1ra显着延长。总之,我们的研究为进一步揭示哮喘发病机理,并为变应性疾病治疗提供可能的理论依据和治疗途径。
薛红[9]（2008）在《新型B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗的研制及其防治大鼠类风湿关节炎的疗效与机理研究》文中研究说明有关RA治疗策略的探索始终是国内外尤为关注的焦点、热点和难点。由于迄今对于RA的病因认识不清,对其病机了解不深,目前尚无任何特异性根治疗法。所使用的药物与方案也就是非特异性缓解对症疗法,都必然会产生多种多样的严重毒副作用。因此,如何能发现或发明理想、高效、低毒、特异的药物,使其既能迅速缓解RA的表症,而且更能有效地针对其病机,选择性地阻断其病理生理过程的全新型制剂已是风湿学领域亟待解决的关键首要问题!业已证明,RA是一种抗原驱动由CD4+CD28+Th1细胞介导的全身性自身免疫病。鉴于RA病人的滑膜炎症和关节破坏变形与免疫功能的改变密切相关,近年来国外趋向于将对免疫调节作用的药物作为治疗RA的第一线药,并对RA新的免疫治疗策略进行了广泛的研究。“基因或DNA治疗性疫苗”就是其中最受重视和最为推崇的一种,它是自二十世纪九十年代国际上兴起治疗自身免疫病的特异性免疫疗法之一,也是近年来免疫学研究领域中最活跃、最富有成效的领域之一。从理论上讲,任何能够有效减少、抑制或阻断RA病理生理发生与发展进程的药物都能有效减轻或缓解RA的骨关节病变。鉴于B7:CD28/CTLA4共刺激信号途径在其发生发展的病理生理过程中发挥重要作用这一事实,选择性阻断B7:CD28/CTLA4共刺激信号途径诱导免疫耐受已成为有效防治自身免疫性疾病的重要策略之一。其中最具代表性的突破则是完全人源化新型重组融合蛋白CTLA4-Ig的研发成功,它能选择性阻断B7:CD28/CTLA4系统并在防治RA的动物实验尤其是临床研究中取得显着疗效。2005年12月美国FDA在国际上首次正式批准CTLA4-Ig作为一线药临床应用于中至重度RA的治疗。从而为这一策略的更深入研究尤其是RA的临床应用奠定了坚实的基础。然而,纵观目前国际上探索B7:CD28/CTLA-4系统诱导免疫耐受防治RA的研究手段,采用的均是以CTLA4-Ig或抗B7单抗/多抗来进行封闭或阻断。其缺陷在于:第一,无论是抗CTLA4-Ig或B7单抗/多抗的封闭或阻断,均不能诱导长期免疫耐受;第二,仅仅封闭B7:CD28/ CTLA-4系统所诱导的T细胞免疫耐受可被感染等因素所引起释放的IL-2及其它细胞因子所逆转,导致治疗无效或失败;第三,仍存在其它的共刺激信号途径可以补偿CD28信号的缺失,而旁路激活CD28+T细胞。针对上述缺陷,本课题拟将免疫耐受与基因治疗性疫苗两大策略充分进行有机结合创新性研制全新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,并系统观察了该新型疫苗对CIA防治的疗效,探讨了其相关作用机制,获得如下研究结果:勿庸置疑,本研究的关键是能否成功构建在真核细胞中高效表达的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗。为此,本课题首先以原核表达载体pRSETA/B7-2-PE40KDEL质粒为模板,采用PCR及酶切连接的方法构建真核表达载体pcDNA3.1/B7-2-PE40。在基因测序证实B7-2-PE40真核表达载体构建成功的基础上,采用脂质体转染的方法将B7-2-PE40真核表达载体转染入CHO-K1-RPE.40细胞,经ZeocinTM筛选获得稳定转染细胞株后,利用RT-PCR、Western Blot及ELISA的方法分别从mRNA和蛋白水平检测了B7-2-PE40在CHO-K1-RPE.40真核细胞中的表达情况。检测结果显示,转染入真核细胞的pcDNA3.1/ B7-2-PE40质粒经历转录、翻译及翻译后修饰被分泌至胞外,相对分子质量约为90kDa,平均106个转染细胞24h表达0.23μg/L。将稳定转染细胞与CD28高表达细胞系人淋巴瘤细胞系Jurkat和CD28低表达的人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji共孵育,采用MTT法对其特异性杀伤活性进行了测定。活性测定显示,真核载体所表达的B7-2-PE40能特异性杀伤高表达CD28的Jurkat细胞,而对低表达CD28的Raji细胞抑制率甚低。由此证明本课题构建的pcDNA3.1/B7-2-PE40真核表达载体可在真核细胞中高效表达,且表达产物具有很好的靶向免疫抑制活性。在此基础上,我们选择了肌肉注射结合电脉冲刺激的方法,将150μg pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗注入CIA大鼠体内,利用RT-PCR和流式细胞计数的方法检测了B7-2-PE40在活体内的表达情况及生物学活性。结果显示pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒进入机体2天即可检测出mRNA,14天达到高峰,而后逐渐减弱,至第56天基本检测不到。其真核表达产物B7-2-PE40可发挥特异性细胞杀伤活性,在pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒肌肉注射第2d时,CIA大鼠体内CD28+T细胞已被明显杀伤。第4天时,CD28+T细胞下降至最低,达34%。此后有短暂恢复。随着B7-2-PE40在14天表达高峰的到来,在第21天时再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表达的降低,CD28+ T细胞所占比例逐渐增加,并于第56天时恢复至正常水平。ELISA检测结果表明,pcDNA3.1/B7-2-PE40质粒表达产物作为异源蛋白在体内的的抗原性较低,基本上不产生针对PE40的抗体。上述结果表明,我们所研制的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗可在大鼠体内表达并发挥作用。那么,这种全新型的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗所表达的产物是否具有生物学功能?尤其是在RA大鼠模型体内能否有效的防治CIA病情的发生与发展?这是我们最为关注的大问题。因此我们采用鸡Ⅱ型胶原在Wistar大鼠中建立了CIA作为RA的动物模型,造模成功率为80%。经四肢关节肿胀程度评分、放射影像学和组织病理学验证,该模型与文献报道的一致,完全符合CIA大鼠RA模型体内实验治疗的标准要求。而后我们分别观察了该新型外毒素融合基因疫苗预防和治疗CIA大鼠的效应。将不同剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗分别在诱导CIA模型的当天预防性或第12天治疗性给予CIA大鼠,综合四肢关节肿胀程度评分、组织病理学变化和抗CⅡ抗体的滴度变化来系统评价对CIA疾病进程的影响。预防各组在诱导CIA模型的第一周中均会出现微弱的关节炎症表现。随着B7-2-PE40质粒的表达,关节炎症状会逐渐消失。剂量为200μg/只的预防组在10周内均能很好地抑制关节炎的发生,减轻关节炎的严重程度,其效果优于“金标准”的MTX组。而在剂量为300μg/只的预防组中仅部分地抑制了关节炎症的发生,从第3周起,关节炎症逐渐明显。pcDNA3.1空载体预防组无任何预防效果,其临床积分类似于CIA对照组。治疗各组是在诱导CIA模型的第12天出现足爪红肿时,分别给予每只150μg、200μg和300μg剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗,结果发现在给予基因疫苗治疗的第5天后即开始发挥作用,一直延续到第10周实验结束后。200μg/只治疗组、300μg/只治疗组的疗效与标准低剂量MTX/1次/周×4周治疗组的接近,均可明显减轻四肢关节肿胀程度,降低疾病发生率;而150μg/只治疗组的关节炎症指数略高于上述三组,但明显低于pcDNA3.1空载体治疗组及CIA对照组。与CIA对照组相比,pcDNA3.1空载体组对CIA大鼠四肢关节肿胀程度无任何治疗作用,两组的临床评分基本接近。应说明的是,在300μg/只治疗组大鼠胶原注射处可见溃疡形成,且经久不愈。组织病理结果与肉眼观察相一致;pcDNA3.1空载体对照组的结果与CIA组类似。而经pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗预防及治疗后的各组均有一定程度的改善:滑膜增生减弱,炎性细胞浸润明显减少,少见纤维样物质沉积,基本看不到骨及软骨的破坏。在治疗各组中,MTX治疗组病理改变最好,其次为200μg治疗组;而在预防各组中,200μg预防组病理改善表现优于MTX预防组。300μg预防组的病理表现类似于CIA对照组,可见炎性细胞浸润,纤维增生,局部有坏死及肉芽肿形成。通过ELISA检测体内抗CⅡ抗体滴度的变化表明,与CIA对照组相比,200μg预防组和MTX组可明显降低体内抗CⅡ抗体水平（P<0.05）,而其他各组尽管也能降低抗CⅡ抗体水平,但无统计学差异。上述结果提示200μg/只剂量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗可有效防治CIA疾病的发生,缓解CIA疾病的进程。为了探索pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗有效防治CIA大鼠的相关机制,我们系统观察了CIA大鼠注射pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗后对其免疫系统的影响。研究结果表明,该基因疫苗在体内所表达的B7-2-PE40能有效杀伤CD28+ T细胞,提高CD4+ CD25+ Treg细胞亚群及CD8+ CD28- Ts细胞亚群的比例;有效纠正CIA产生的Th1偏移,下调CD4/CD8比值,明显降低炎性细胞因子TNF-α和IFN-γ的浓度（P<0.05）,抑制IFN-γ分泌型Th1细胞的产生,促进抗炎细胞因子IL-10及IL-4分泌型Th2细胞的生成。而对IL-2和TGF-β的影响不大,尤其是对IL-4基本没有影响。上述结果证实pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗主要是通过抑制致病性T细胞的活化,纠正T细胞亚群及细胞因子网络的失衡,抑制B细胞介导的针对胶原的体液免疫应答来有效控制并减缓CIA的发生与发展的。总之,本研究在国际上原创性的研制成功首个新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,它能在体内有效表达具有特异靶向阻断B7:CD28共刺激信号途径的B7-2-PE40外毒素融合蛋白,经CIA大鼠模型证实该基因疫苗能有效地预防和治疗类风湿关节炎的发生与发展,并对其相关作用机制进行了探讨,为今后临床进一步研究及应用奠定了坚实基础,也为类风湿关节炎的治疗提供了更多更广的新思路和新策略。
姜勇[10]（2008）在《鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价》文中认为十九世纪六十年代,降钙素（Calcitonin, CT）作为一种降血钙的物质被copp发现。它在哺乳动物中起源于甲状腺C细胞,在鱼类中后腮体分泌。降钙素是由哺乳动物的甲状腺C细胞或鱼类的后腮体分泌的多肽类激素,由32个氨基酸残基组成,主要参与体内的钙、磷代谢。在体内的主要作用是通过抑制破骨细胞活性,减少骨质吸收,促进钙在骨中的沉积,从而降低血钙浓度降钙素的这种抗骨吸收活性使降钙素能够被广泛的使用于治疗Paget综合症,骨质疏松,以及高钙血症。不同来源的降钙素氨基酸序列不同,其中后鳃体来源的降钙素活性高于甲状腺来源的降钙素。鲑鱼降钙素（salmon calcitonin, sCT）的生物活性最高（4 000IU/mg-7 000IU/mg）,相当于人降钙素生物活性（200 IU/mg）的30-40倍。由于降钙素的天然来源有限,化学合成降钙素成本较高,从而在一定程度上限制了降钙素的普遍应用。国内外已有多个研究机构进行了基因工程降钙素的研究,并且已经有产品在欧洲上市。多肽类药物在过去的二十年里得到了迅速的发展,但是降钙素已经开发的剂型只有注射和鼻腔给药两种形式,临床主要采用注射给药,患者长期用药极为不便,依从性差,目前,国内外均在加大鲑鱼降钙素口服剂的研究,以更大范围的满足临床需求。由于多肽类药物易于在胃肠中发生降解,因此,提高多肽抵抗蛋白酶降解能力便成为鲑鱼降钙素口服剂广泛应用的首要因素。近来,许多研究表明酿酒酵母对于多肽类药物是一个合适的运载载体。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）具有生长旺盛,易培养,生物量大,公认安全等优良特点,是发酵工业的重要微生物之一。酵母基因组中rDNA片断有100-200个重复单元,是提高外源基因的稳定性和表达量,构建多拷贝整合型载体较为理想的重复顺序。2001年,Blanquet等成功实现了植物细胞色素P450 73A1（生物体内一种重要的酶）在酵母中的表达,提出了应用酿酒酵母为载体实现药物的口服给药途径,该方法制成的药物被称“biodrug”。在以酵母为载体的“biodrug”模式研究中发现,冷冻干燥的重组酵母对人工模拟胃肠环境下的消化酶表现出了较强的耐受性,能够对表达产物能起到良好的保护作用,而且目前研究较多的口服型肠溶微粒模式证明,鲑鱼降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。本文以此为依据进行了鲑鱼降钙素口服途径的相进行了鲑鱼降钙素口服途径的相关研究,测定转鲑鱼降钙素酵母的体外活和体内活性,为鲑鱼降钙素口服途径应用提供一个新的方法。根据酵母整合质粒的设计要求,PCR扩增2.2 kb rDNA片段,导入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）整合载体pYD1中,设计并合成适合在酵母中表达的鲑鱼降钙素（Salmon Calcitonin）,以此为目标基因,构建适合酿酒酵母多拷贝整合的表达载体p-r-sCT。通过载体p-r-sCT引入到酿酒酵母菌株EBY100中,得到酵母重组菌株yAGA2-r-sCT,并通过细胞实验和动物实验进行了活性检测。利用间接荧光标记的方法,在荧光显微镜下观察到了转化子yAGA2-V5和yAGA2-r-sCT外源蛋白的表达。进一步的流式细胞仪分析显示,表达开始12小时之后,yAGA2-sCT中有80 %的细胞表达外源蛋白,yAGA2-V5转化子中有52 %的细胞表达外源蛋白。在肠激酶的作用下,转基因酵母中的外源蛋白释放到酶切液的上清当中。该上清简称为EKS。外源表达的蛋白通过细胞实验对其体外的活性进行了检测。结果发现yAGA2-r-sCT EKS能够显着减少骨陷窝的生成,即重组鲑鱼降钙素能够在体外抑制破骨细胞的活性。体外降血钙实验中,重组鲑鱼降钙素能够明显降低大鼠体内血钙浓度,证明重组鲑鱼降钙素具有体外活性。取转基因酵母分别以高（2 g/kg）、中（0.5 g/kg）、低（0.1 g/kg）三种剂量组对高钙血症模型大鼠灌胃给药,口服2 g/kg冷冻干燥后的转基因酵母可以使高钙血症模型Wistar大鼠的血钙浓度由2.818±0.232 mM降低为2.475±0.0191 mM。口服转鲑鱼降钙素基因酵母为鲑鱼降钙素的应用开辟了一条新的途径。为评价转鲑鱼降钙素基因酵母的安全性,将转基因酵母分别灌胃昆明种小鼠和Wistar大鼠进行急性毒性实验（7天）、亚急性毒性实验（8周）。急性毒性实验结果显示灌喂转基因酵母对大鼠无致死效应（LD50>10000 mg/kg）。亚急性毒性实验中,高（2.0 g/kg）、低（0.5 g/kg）剂量组动物的一般状况、体重、主要脏器系数、血液学指标及血液生化指标与各对照组比较,均未见明显差异（p>0.05）.组织病理切片检查未发现病理性变化。实验结果充分证明转鲑鱼降钙素基因酵母不能对实验动物造成不良影响,是安全无毒的。
二、wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建（论文提纲范文）
（1）miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 血吸虫及我国血吸虫病的流行及防控形势 |
| 1.1.2 日本血吸虫生活史及宿主的适宜性 |
| 1.1.2.1 日本血吸虫生活史 |
| 1.1.2.2 宿主适宜性 |
| 1.1.2.3 水牛和黄牛是我国血吸虫病主要传染源 |
| 1.1.3 血吸虫感染的免疫 |
| 1.1.3.1 宿主对血吸虫感染的天然免疫应答 |
| 1.1.3.2 宿主对血吸虫感染的适应性免疫应答 |
| 1.1.4 micro RNA及其在血吸虫上的研究 |
| 1.1.4.1 血吸虫宿主miRNA研究进展 |
| 1.1.4.2 虫体miRNA研究进展 |
| 1.1.5 真核翻译起始因子eIF4A研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究内容与技术路线 |
| 1.3.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 1.3.2 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.3 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 1.3.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 第二章 黄牛与水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 水牛和黄牛来源日本血吸虫成虫的收集 |
| 2.3.2 虫体RNA的提取 |
| 2.3.3 small RNA文库构建 |
| 2.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 2.3.5 已知显着性差异表达的miRNAs验证 |
| 2.3.5.1 引物设计 |
| 2.3.5.2 虫体miRNA提取 |
| 2.3.5.3 miRNA cDNA第一链合成 |
| 2.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 2.3.6 差异表达miRNAs的靶基因筛选及q RT-PCR验证 |
| 2.3.7 双荧光素酶验证实验 |
| 2.3.7.1 HEK293T细胞的培养 |
| 2.3.7.2 双荧光素酶共表达载体的构建 |
| 2.3.7.3 转染实验 |
| 2.3.7.4 双荧光素酶报告基因活性检测 |
| 2.3.8 数据分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 2.4.2 黄牛和水牛源日本血吸虫已知miRNAs的比较分析 |
| 2.4.3 日本血吸虫成虫新miRNA的初步鉴定 |
| 2.4.4 采用qRT-PCR法验证五个差异表达的已知miRNAs |
| 2.4.5 五个显着性差异表达miRNAs的靶基因预测 |
| 2.4.6 靶基因的功能富集分析 |
| 2.4.7 采用qRT-PCR验证差异表达miRNAs的靶基因 |
| 2.4.8 双荧光素酶验证结果 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后血浆miRNA表达谱及差异分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要溶液的配制 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及血浆分离 |
| 3.3.2 血浆RNA的提取 |
| 3.3.3 small RNA文库构建 |
| 3.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 3.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 3.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 3.3.5.2 血浆miRNA提取及反转录 |
| 3.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 3.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 3.3.6 差异表达miRNAs的靶基因的q RT-PCR验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 3.4.2 黄牛和水牛血浆已知miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.2.4 黄牛和水牛感染血吸虫后血浆差异表达miRNAs的比较分析 |
| 3.4.3 黄牛和水牛血浆新miRNAs的预测分析 |
| 3.4.4 差异表达miRNAs靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 3.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.3 黄牛和水牛在T1、T2、T3 时期血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 3.4.5 黄牛和水牛血浆差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 3.4.5.1 黄牛和水牛各时期血浆差异表达miRNAs的验证 |
| 3.4.5.2 血浆差异miRNAs的靶基因验证 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 黄牛和水牛感染日本血吸虫前后外周血单核细胞miRNA表达谱及差异分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验动物与尾蚴感染 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要溶液的配制 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 黄牛和水牛外周血的采集及PBMC的分离 |
| 4.3.2 PBMC中 RNA的提取 |
| 4.3.3 small RNA文库构建 |
| 4.3.4 miRNA深度测序及数据分析 |
| 4.3.5 差异表达miRNAs的 q RT-PCR验证 |
| 4.3.5.1 差异表达miRNAs的引物设计 |
| 4.3.5.2 PBMC中 miRNA的提取 |
| 4.3.5.3 miRNA c DNA第一链合成 |
| 4.3.5.4 miRNA荧光定量检测 |
| 4.3.6 差异表达miRNAs的靶基因预测及q RT-PCR验证 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 small RNA文库构建及深度测序概况 |
| 4.4.2 黄牛和水牛PBMC新 miRNAs的预测分析 |
| 4.4.3 黄牛和水牛PBMC已知miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs筛选及分析 |
| 4.4.3.3 T1、T2、T3 时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.3.4 不同感染时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的比较分析 |
| 4.4.4 差异表达miRNAs的靶基因预测及靶基因功能的生物信息学分析 |
| 4.4.4.1 黄牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.2 水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.3 黄牛和水牛T1、T2、T3 时期PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.4.4 感染后不同时期黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs的靶基因预测及功能分析 |
| 4.4.5 黄牛和水牛PBMC差异表达miRNAs及其靶基因验证 |
| 4.4.5.1 黄牛和水牛各时期PBMC差异miRNAs的验证 |
| 4.4.5.2 PBMC差异miRNAs的靶基因验证 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A的克隆表达与特性分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验动物和尾蚴 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器及设备 |
| 5.2.4 主要试剂配制 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 Sj-eIF4A的生物信息学分析 |
| 5.3.2 Sj-eIF4A在日本血吸虫不同发育时期虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.2.1 不同发育时期的虫体收集 |
| 5.3.2.2 虫体RNA提取 |
| 5.3.2.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.3 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.3.3.1 不同宿主来源虫体的收集 |
| 5.3.3.2 虫体RNA的提取 |
| 5.3.3.3 虫体RNA反转为c DNA及 q RT-PCR分析 |
| 5.3.4 原核表达质粒的构建 |
| 5.3.5 重组蛋白r Sj-eIF4A的表达与纯化 |
| 5.3.6 Sj-eIF4A基因特异性si RNA的筛选 |
| 5.3.6.1 Sj-eIF4A基因si RNA的合成 |
| 5.3.6.2 虫体的收集与体外培养 |
| 5.3.6.3 Sj-eIF4A基因的干扰效果分析 |
| 5.3.7 Sj-eIF4A基因体外最佳干扰时间的筛选 |
| 5.3.8 Sj-eIF4A基因的体内干扰实验 |
| 5.3.9 Sj-eIF4A基因的体外干扰实验 |
| 5.3.9.1 虫体收集与RNA长期干扰 |
| 5.3.9.2 体外长期干扰虫体结构变化观察 |
| 5.3.10 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 Sj-eIF4A基因的扩增与重组表达质粒的构建 |
| 5.4.2 日本血吸虫Sj-eIF4A基因的生物信息学分析 |
| 5.4.3 r Sj-eIF4A蛋白的纯化 |
| 5.4.4 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同发育时期的转录水平分析 |
| 5.4.5 Sj-eIF4A基因在日本血吸虫不同适宜性宿主来源虫体内的转录水平分析 |
| 5.4.6 siRNA干扰效果分析 |
| 5.4.7 RNA干扰引起Sj-eIF4A基因沉默的最佳时间分析 |
| 5.4.8 体内干扰Sj-eIF4A基因表达对虫荷数和肝脏虫卵数的影响 |
| 5.4.9 体外干扰Sj-eIF4A基因表达对虫卵的影响 |
| 5.4.10 体外干扰Sj-eIF4A基因对虫体形态的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文讨论与总结 |
| 6.1 全文讨论 |
| 6.1.1 黄牛和水牛来源日本血吸虫成虫miRNA表达谱的比较分析 |
| 6.1.2 黄牛和水牛血浆miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.3 黄牛和水牛外周血单核细胞miRNA在日本血吸虫感染前后的表达谱分析 |
| 6.1.4 日本血吸虫真核翻译起始因子eIF4A基因的克隆表达与特性分析 |
| 6.2 全文总结 |
| 6.3 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 日本血吸虫 miRNA 测序流程图及Hsc20 扩增序列 |
| 附录 B 攻读博士学位期间主要学术成果和参加学术会议情况 |
（2）犬血清白蛋白融合干扰素γ的制备及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表或符号表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 干扰素分类 |
| 1.2 IFN-γ研究进展 |
| 1.2.1 IFN-γ的理化性质 |
| 1.2.2 IFN-γ的受体 |
| 1.2.3 IFN-γ信号通路 |
| 1.2.4 IFN-γ的功能 |
| 1.2.5 IFN-γ的应用 |
| 1.2.6 干扰素应用的限制因素 |
| 1.3 长效蛋白多肽类药物研究进展 |
| 1.3.1 化学修饰法在长效药物开发中的应用 |
| 1.3.2 融合蛋白技术在长效药物开发中的应用 |
| 1.4 蛋白表达系统 |
| 1.4.1 原核表达系统 |
| 1.4.2 哺乳动物细胞表达系统 |
| 1.4.3 酵母表达系统 |
| 1.4.4 杆状病毒表达系统 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组质粒的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 组织样品 |
| 2.2.2 菌株及载体 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.2.4 相关溶液配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.2.6 引物设计 |
| 2.2.7 犬IFN-γ基因的克隆 |
| 2.2.8 犬血清白蛋白基因的克隆 |
| 2.2.9 重组质粒pFastBac-CSA-γ的构建 |
| 2.2.10 重组质粒pFastBac-γ-CSA的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 蛋白融合思路 |
| 2.3.2 犬干扰素γ全基因及犬血清白蛋白全基因PCR扩增结果 |
| 2.3.3 pFastBac-CSA-γ重组质粒构建结果 |
| 2.3.4 pFastBac-γ-CSA重组质粒构建结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 表达犬血清白蛋白融合干扰素γ的重组杆状病毒的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 细胞及菌株 |
| 3.2.2 试剂耗材 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 相关溶液配制 |
| 3.2.5 TSS法制备DH10bac感受态细胞 |
| 3.2.6 重组质粒转化DH10BacE.coli感受态 |
| 3.2.7 Bacmid重组杆粒的制备 |
| 3.2.8 Bacmid重组杆粒的鉴定 |
| 3.2.9 Sf9细胞的培养 |
| 3.2.10 Bacmid重组杆粒的转染 |
| 3.2.11 重组病毒鉴定 |
| 3.2.12 重组病毒的纯化及扩繁 |
| 3.2.13 重组病毒滴度测定 |
| 3.2.14 融合蛋白表达情况监测及大量培养 |
| 3.2.15 融合蛋白的纯化及脱盐 |
| 3.2.16 融合蛋白温度稳定性测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组杆粒提取鉴定结果 |
| 3.3.2 Sf9细胞转染后形态学变化 |
| 3.3.3 融合蛋白鉴定结果 |
| 3.3.4 重组病毒滴度测定结果 |
| 3.3.5 融合蛋白表达情况检测 |
| 3.3.6 融合蛋白纯化结果 |
| 3.3.7 融合蛋白温度稳定性检测结果 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 融合干扰素体外生物活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 试剂耗材 |
| 4.2.3 仪器设备 |
| 4.2.4 相关溶液配制 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 Western blot分析 |
| 4.2.7 融合IFN-γ抗病毒活性研究 |
| 4.2.8 肿瘤细胞生长抑制试验 |
| 4.2.9 流式细胞法检测肿瘤细胞凋亡 |
| 4.2.10 细胞周期 |
| 4.2.11 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 融合干扰素CSA-IFN-γ及IFN-γ-CSA激活JAK-STAT1信号通路 |
| 4.3.2 融合干扰素CSA-IFN-γ和IFN-γ-CSA抗病毒活性检测结果 |
| 4.3.3 肿瘤细胞生长抑制实验结果 |
| 4.3.4 肿瘤细胞凋亡检测结果 |
| 4.3.5 犬IFN-γ诱导DH82细胞阻滞于G0/G1期 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 犬血清白蛋白融合干扰素γ药代动力学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞 |
| 5.2.2 实验动物 |
| 5.2.3 试剂 |
| 5.2.4 主要溶液的配制 |
| 5.2.5 仪器设备 |
| 5.2.6 犬血清白蛋白融合IFN-γ大鼠体内药代动力学试验 |
| 5.2.7 大鼠血清中犬IFN-γ浓度检测 |
| 5.2.8 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 犬IFN-γ药代动力学测定结果 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 犬血清白蛋白融合干扰素γ体内抗肿瘤活性研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 细胞 |
| 6.2.2 试验动物 |
| 6.2.3 试剂 |
| 6.2.4 主要溶液的配制 |
| 6.2.5 仪器设备 |
| 6.2.6 小鼠肾恶性组织增生症DH82细胞移植瘤模型的建立 |
| 6.2.7 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 裸鼠成瘤结果 |
| 6.3.2 犬IFN-γ肿瘤抑制情况对比 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 全文总结与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A: 科研成果 |
| 附录B: 博士在读期间所获荣誉 |
（3）p120-连环蛋白对大鼠急性肝衰竭的保护作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要材料 |
| 1.3 实验步骤 |
| 1.3.1 PCR扩增全长p120ctn基因 |
| 1.3.2 真核表达重组体pCMV/p120ctn的构建 |
| 1.3.3 实验分组及模型建立 |
| 1.3.4 标本收集 |
| 1.3.5 肝组织切片HE染色 |
| 1.3.6 原位细胞凋亡检测 (TUNEL) 分析 |
| 1.3.7 RT-PCR评估大鼠肝组织p120cnt mRNA表达 |
| 1.3.8 RT-PCR评估ALF大鼠肝组织Epac1mRNA表达 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 菌落筛选及基因测序 |
| 2.2 基因转染 |
| 2.3 大鼠肝组织切片HE染色与TUNEL分析 |
| 2.4 半定量RT-PCR评估大鼠肝组织p120cnt mRNA表达 |
| 2.5 半定量RT-PCR评估ALF大鼠肝组织Epac1mRNA表达 |
| 3 讨论 |
（4）机械拉伸对成骨细胞基因表达及可变剪接的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出和意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 细胞力学加载方式 |
| 1.2.2 可变剪接 |
| 1.2.3 应力刺激对可变剪接的调控 |
| 1.3 本研究的目的内容 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 研究技术路线 |
| 2 细胞的培养和观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 细胞培养材料和设备 |
| 2.2.1 细胞株 |
| 2.2.2 细胞培养仪器与材料 |
| 2.2.3 细胞培养试剂 |
| 2.3 细胞培养准备工作 |
| 2.3.1 培养用品的清洗灭菌 |
| 2.3.2 培养用液的配制和灭菌 |
| 2.4 细胞培养方法 |
| 2.4.1 细胞复苏 |
| 2.4.2 细胞换液 |
| 2.4.3 细胞传代 |
| 2.4.4 细胞冻存 |
| 2.5 细胞形态观察 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 应力拉伸装置的设计和使用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 应力拉伸装置的结构和原理 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 主要材料和仪器 |
| 3.3.2 医用硅橡胶膜的处理 |
| 3.3.3 细胞接种 |
| 3.3.4 拉伸参数选择 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 拉伸刺激对 VEGF, CD44 和 cyclinD1 基因表达的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 实验装置和仪器 |
| 4.2.3 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞应力加载 |
| 4.3.2 总 RNA 提取与检测 |
| 4.3.3 RNA 反转录成 cDNA |
| 4.3.4 RT-PCR 检测基因表达 |
| 4.3.5 q-PCR 检测基因表达 |
| 4.3.6 总蛋白提取 |
| 4.3.7 蛋白含量测定 |
| 4.3.8 Western blot 检测蛋白表达 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 RT-PCR 条件的优化 |
| 4.4.2 VEGF 及其剪接变异体的表达 |
| 4.4.3 CD44 及其剪接变异体的表达 |
| 4.4.4 cyclinD1 及其剪接变异体的表达 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 过表达载体的构建 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料和仪器 |
| 5.2.1 主要仪器和设备 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.3 实验准备工作 |
| 5.3.1 实验用品的清洗和灭菌 |
| 5.3.2 实验用液的配制和灭菌 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 PCR 扩增目的片段 |
| 5.4.2 感受态制备 |
| 5.4.3 质粒重建 |
| 5.4.4 重建质粒扩大培养 |
| 5.4.5 测序 |
| 5.4.6 质粒提取 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- ASF/SF2 的构建 |
| 5.5.2 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- SC35 的构建 |
| 5.5.3 重组质粒 pcDNA3.1（+）-EGFP- hnRNPA1 的构建 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 6 剪接因子 ASF/SF2, SC35 和 hnRNPA1 对 VEGF 基因可变剪接的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料和仪器 |
| 6.2.1 实验细胞 |
| 6.2.2 实验装置和仪器 |
| 6.2.3 实验材料和试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 过表达质粒转染细胞 |
| 6.3.2 总蛋白提取 |
| 6.3.3 蛋白含量测定 |
| 6.3.4 western blot 检测蛋白表达 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 HaCaT 拉伸加载预实验 |
| 6.4.2 重组质粒转染效率鉴定 |
| 6.4.3 重组质粒表达鉴定 |
| 6.4.4 VEGF 表达鉴定 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 本研究主要结论 |
| 7.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表的论文 |
| B 作者在攻读学位期间参加的科研项目 |
（5）STRIP1和突变型STRIP1在小鼠足细胞中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、足细胞和它的发育 |
| 二、STRIP1基因的研究现状 |
| 三、研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第一部分：小鼠Strip1基因的RNAi、野生型和突变型表达载体腺病毒构建 |
| Ⅰ 小鼠Strip1基因干扰靶点设计、miRNA合成和表达载体构建 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结 果 |
| Ⅱ 小鼠Strip1野生型和突变型基因合成和表达载体构建 |
| 一、 材料和方法 |
| 二、 结 果 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小鼠足细胞中Strip1和突变型Strip1的作用机制 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）重组草菇免疫调节蛋白（reFIP-vvo）在毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33中的表达及其生物学活性初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 大型真菌资源的利用 |
| 1.2 真菌免疫调节蛋白研究进展 |
| 1.2.1 真菌免疫调节蛋白家族 |
| 1.2.2 真菌免疫调节蛋白生物学活性 |
| 1.3 利用基因工程技术大量表达 FIP |
| 1.4 草菇免疫调节蛋白（FIP-vvo）生物学活性 |
| 1.5 草菇免疫调节蛋白（FIP-vvo）的异源表达现状 |
| 1.6 本课题的研究意义 |
| 第2章 重组草菇免疫调节蛋白(reFIP-vvo)表达工程菌的构建 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组草菇免疫调节蛋白目的基因的克隆 |
| 2.2.2 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 重组质粒转化酵母感受态 |
| 2.2.4 重组酵母转化子的分子生物学鉴定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 重组草菇免疫调节蛋白目的基因的克隆 |
| 2.3.2 重组质粒的构建 |
| 2.3.3 酵母转化子筛选 |
| 2.3.4 重组酵母转化子的分子生物学鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 重组草菇免疫调节蛋白(reFIP-vvo)的表达纯化及活性鉴定 |
| 3.1 实验仪器与试剂 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 reFIP-vvo 毕赤酵母工程菌的诱导表达 |
| 3.2.2 reFIP-vvo 纯化工艺 |
| 3.2.3 血红细胞凝集活性测定 |
| 3.2.4 体外促脾淋巴细胞增殖活性检测 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 重组草菇免疫调节蛋白工程菌的诱导表达 |
| 3.3.2 reFIP-vvo 纯化工艺 |
| 3.3.3 血红细胞凝集活性测定 |
| 3.3.4 体外促脾淋巴细胞增殖活性检测 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 试验一 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-18 基因真核共 表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因真核共 表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验三 猪圆环病毒II型病毒ORF2基因与猪白介素-18基因免疫保 护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 试验四 猪圆环病毒 II 型病毒 ORF2 基因与猪白介素-2 基因免疫保 护试验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 发表论文 |
（8）IL-1ra-Fcε融合蛋白功能及对变应性哮喘的治疗作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1 白细胞介素-1 受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist 1,IL-1)与支气管哮喘 |
| 2 免疫球蛋白 E 与支气管哮喘 |
| 3 本研究的设计思路 |
| 第一部分 IL-1ra-Fcε融合基因的克隆、表达纯化及功能研究 |
| 一、鼠源 IL-1ra-Fcε 融合基因的克隆、表达纯化及功能研究 |
| 二、人源 IL-1ra-Fcε 融合基因的克隆、表达纯化及功能研究 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 pIRES2-EGFP-IL-1ra-Fcε真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 IL-1ra-Fcε对过敏性哮喘的治疗作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 融合蛋白对变应性哮喘治疗机制初步探讨 |
| 1 材料方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第五部分 IL-1ra-Fcε融合蛋白药物代谢动力学初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）新型B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗的研制及其防治大鼠类风湿关节炎的疗效与机理研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 pcDNA3.1/B7-2-PE40 外毒素融合基因疫苗真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 pcDNA3.1/B7-2-PE40 外毒素融合基因疫苗防治大鼠类风湿性关节炎疗效观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 pcDNA3.1/B7-2-PE40 外毒素融合基因疫苗治疗大鼠类风湿性关节炎机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 简历 |
| 致谢 |
（10）鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述和立项依据 |
| 第一节 降钙素的研究进展 |
| 1 降钙素概述 |
| 2 降钙素的生物活性与作用机理 |
| 3 鲑鱼降钙素在原核与真核载体中的表达 |
| 4 外源表达鲑鱼降钙素后的酰胺化处理 |
| 5 降钙素的临床应用及其制剂 |
| 6 鲑鱼降钙素的研究发展趋势 |
| 第二节 酵母表面展示载体研究进展 |
| 1 酿酒酵母的表面结构 |
| 2 酿酒酵母细胞表面工程两种系统 |
| 3 酿酒酵母表面展示系统的特点 |
| 第三节 破骨细胞骨吸收机制研究进展 |
| 1 破骨细胞增殖与分化的分子生物学 |
| 2 骨吸收过程中破骨细胞的活动与变化 |
| 3 破骨细胞在骨组织工程中的应用 |
| 第四节 转鲑鱼降钙素基因酵母的安全性评价 |
| 1 转基因食品对环境及生态可能造成的危害 |
| 2 转基因食品对人类健康可能产生的危害 |
| 3 转基因食品的安全性评价 |
| 4 转基因食品无害性评估的几个方面 |
| 5 安全性分析的内容 |
| 6 转基因食品的展望 |
| 第五节 研究课题的提出及立项依据 |
| 第二章 鲑鱼降钙素基因的设计与克隆及多拷贝整合载体的构建- |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 鲑鱼降钙素在酿酒酵母中的多拷贝表达 |
| 第一节 鲑鱼降钙素向酿酒酵母的转化 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 免疫荧光检测外源基因的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三节 流式细胞技术检测外源蛋白在酵母细胞表面的表达- |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 重组鲑鱼降钙素的活性研究及在酵母中表达量的测定 |
| 第一节 重组鲑鱼降钙素对破骨细胞活性的抑制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二节 重组酿酒酵母的体外降血钙活性 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 口服转鲑鱼降钙素基因酵母对高钙血模型大鼠的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 转鲑鱼降钙素基因酿酒酵母的生物安全性评价 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 1 鲑鱼降钙素基因在转基因酵母 yAGA2-r-sCT 中得到了表达 |
| 2 重组鲑鱼降钙素蛋白的体外活性 |
| 3 转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 具有持续降血钙活性 |
| 4 转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 具有抑制高钙血症活性 |
| 5 证明转鲑鱼降钙素基因酵母 yAGA2-r-sCT 是安全无毒级 |
| 参考文献 |
| 文章发表状况 |
| 致谢 |
四、wistar大鼠重组γ-干扰素真核表达载体的构建（论文参考文献）
- [1]miRNA在黄牛和水牛日本血吸虫感染中调节作用的研究[D]. 余新刚. 华南农业大学, 2019
- [2]犬血清白蛋白融合干扰素γ的制备及功能研究[D]. 李冰. 华南农业大学, 2018(08)
- [3]p120-连环蛋白对大鼠急性肝衰竭的保护作用[J]. 余子琪,陈蕾,章慧芳,陈建勇. 南昌大学学报(医学版), 2017(06)
- [4]机械拉伸对成骨细胞基因表达及可变剪接的研究[D]. 樊欣. 重庆大学, 2014(01)
- [5]STRIP1和突变型STRIP1在小鼠足细胞中的作用机制研究[D]. 张颖慧. 第二军医大学, 2014(04)
- [6]重组草菇免疫调节蛋白（reFIP-vvo）在毕赤酵母（Pichia pastoris）X-33中的表达及其生物学活性初探[D]. 肖思佳. 吉林大学, 2013(09)
- [7]猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因DNA疫苗的构建与鼠体内免疫效力观察[D]. 刘金朋. 河南农业大学, 2011(07)
- [8]IL-1ra-Fcε融合蛋白功能及对变应性哮喘的治疗作用研究[D]. 刘中成. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [9]新型B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗的研制及其防治大鼠类风湿关节炎的疗效与机理研究[D]. 薛红. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [10]鲑鱼降钙素在酵母中的多拷贝表达及安全性评价[D]. 姜勇. 中国海洋大学, 2008(02)