一、一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定（论文文献综述）
李敏[1]（2021）在《五个REV分离株全基因组序列分析及抗体阳性鸡的病毒分离检测》文中提出网状内皮组织增殖病（reticuloendothelisis,RE）是由网状内皮组织增殖病病毒（reticuloendotheliosis virus,REV）导致的一种主要侵害鸡、火鸡、鸭和其他禽类的病理综合征。REV属于反转录病毒,是引起家禽发生肿瘤性疾病的病原之一,其传播方式主要为水平传播、垂直传播和疫苗传播。REV引起的免疫抑制一方面可以导致机体抵抗力下降,容易继发其他疾病,另外一方面可导致疫苗免疫应答水平降低,严重者会造成疫苗免疫失效,给养禽业带来更大经济损失。REV在自然条件下极少会单独引起鸡群发病,主要以混合感染的形式出现。课题对2018年-2020年临床疑似肿瘤病病例采集样品进行细胞培养病毒分离,并通过PCR和间接免疫荧光试验（immunofluorescence assay,IFA）进行鉴定,结果成功分离到5株REV分离株GX18NNR1、GX19YLR1、GX19NNR1、GD20R1和GX20YLR1;对分离株的全基因组进行扩增、序列测定及分析,结果显示其全基因组长度为8284 bp-8416 bp。全基因组序列比对发现,分离株GX20YLR1与REV美国鸭源经典毒株SNV相似性最高（nt:99%,aa:96.5%）,而与疫苗分离株FA的相似性最低（nt:90.5%,aa:88.4%）;其余4株与参考株104865的相似性最高（nt>99.8%,aa>97.4%）,与ATCC-VR775的相似性最低（nt<91.6%,aa<87.1%）;各段基因序列的对比显示,REV较为保守,其中以pol最为保守。基于REV全基因及分段基因的序列构建遗传进化树分析发现,REV分为3个大的进化分支,即REV的三个亚型（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）,4个分离株GX18NNR1、GX19YLR1、GX19NNR1和GD20R1属于REVⅢ型,为全球范围的主要流行基因型,而分离株GX20YLR1则属于REVⅡ型。基于贝叶斯（Bayesian）方法对REV毒株进行时间、种群动态、地理和宿主四个方面的分析,发现REV在中国的遗传多样性变化呈现一个先升后趋平缓的态势,且其近十年来的遗传多样性并没有明显的增加。优势基因Ⅲ型毒株早期是由美国传入中国,其中黑龙江是中国大陆最先开始出现的省份,并于20世纪90年代开始在中国流行。证实鸡是REV的自然宿主,其他宿主的感染最可能来源于鸡。本课题应用常规的鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast,CEF）与实验室常用细胞系DF1对REV进行了生长曲线的试验。结果发现REV在细胞中的病毒载量与其感染时间均成正相关,其中DF1感染组的病毒增殖速率较为平缓,其病毒载量在4 dpi（days post-infection,dpi）开始到达平台期,5 dpi达到最高水平。CEF感染组的病毒增殖速率较快,并且在3 dpi开始到达平台期,到6 dpi达到最高水平。CEF感染组的病毒载量显着高于相同时间点的DF1感染组。课题从广西三家地方黄鸡种鸡公司采集种鸡血清样品584份,应用EILISA试剂盒检出361份REV抗体阳性样品,平均阳性率为61.82%,其中DGGX11公司的阳性率最高（84.15%）,DGGX22公司的阳性率最低（8.89%）;并随机收集同群181份抗体阳性和206份抗体阴性鸡的外周血淋巴细胞和血浆,接种CEF进行细胞培养分离病毒,通过PCR检测,结果均未分离到REV。课题成功分离了到5株REV,通过病毒全基因组序列的测定与分析,确定了我国流行的主要基因型,并揭示了我国REV的来源、传播路径及其时间,发现REV的基因组较为保守,近十年来并没有明显的遗传多样性变化。确定了REV培养的最佳细胞和最适合的培养时间。证明了种鸡的REV抗体阳性与病毒的存在并无相关性。
张醒海[2]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中研究说明流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
石梦雅[3]（2020）在《2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究》文中指出马立克氏病（Marek’s diseases,MD）由马立克氏病病毒（Marek’s diseases virus,MDV）引起的一种传染性T淋巴细胞增生性疾病。在过去的六十年,随着MD疫苗的成功研制及广泛应用,有效控制了疾病的发生。但近年来,特超强毒株的出现和野毒株毒力的增强成为疫苗免疫失败的主要原因,给养禽业带来新的威胁以及更大的经济损失。因此,有必要对鸡群中自然流行的MDV进行流行病学监控,对了解病毒的进化趋势以及现有MD疫苗保护力都具有重要意义。广西是我国优质鸡的生产大省,具有品种繁多和饲养周期长等特点,在生产中更容易发生MDV的感染。本课题对2017-2019年广西及其周边地区MDV进行分子流行病学调查,通过细胞培养进行病毒分离、IFA鉴定和致瘤基因meq的序列测定,共分离到23株MDV分离株。序列分析结果显示,23株分离株相似性较高,与中国广西早期分离株GX0101亲缘性较近;根据其氨基酸位点及系统进化树分析,均有中国超强或特超强毒株的特点;对分离株病例背景进行分析发现,均从免疫过MD疫苗的鸡群中所分离,且多以与其他两个肿瘤病病毒（禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病病毒）混合感染（73.9%,17/23）。结合本课题所分离的23株MDV的meq基因和Gen Bank数据库里过去55年（1964-2019）已发表的149株MDV meq基因序列,分别构建三个数据集,通过贝叶斯系统动力学方法进行分析。系统发育树显示,全球172株MDV被分为2个clusters,Cluster 1有71株,包括温和型毒株、疫苗毒株和国外强毒株;Cluster 2有101株,主要以中国强毒分离株为主,本课题的23株分离株构成一个相对独立的进化簇;地理系统分析显示,揭示中国早期的MDV源自国外（美国、日本）,并呈现由北方到南方蔓延扩散的趋势;种群动态分析发现,自2005年起,中国分离株meq基因的遗传多样性呈现持续增长趋势,并分别在2007-2012和2015-2019呈现强的上升趋势。本课题对从免疫了MD疫苗的种鸡群中临床暴发MD病鸡中分离到的GX18NNM4分离株进行了致病性研究,内容包括人工感染试验和商品疫苗免疫保护试验,从临床肿瘤发生及其病理组织学观察、MDV病毒载量的动态检测、细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平检测、免疫保护指数（protection index,PI）等方面进行评价,探究分离株的致病性以及现有商品疫苗的保护效果。未免疫攻毒组鸡只出现垂翅、羽毛粗乱、消瘦、精神沉郁等临床症状,最早于攻毒后16天出现死亡,剖检发现在心脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官有肿瘤;免疫CVI988和814疫苗攻毒组的鸡只最早出现死亡分别在攻毒后22天和18天,剖检发现部分鸡只心脏、胰腺等器官有肿瘤;未免疫攻毒组外周血淋巴细胞的病毒载量在攻毒后28天达到峰值103.7copies/106个细胞,而两个疫苗免疫攻毒组的病毒载量在各个检测时间点均低于未免疫攻毒组的;对MDV感染鸡的脾脏和盲肠扁桃体进行PD-1和PD-L1 m RNA表达水平检测,发现PD-1或PD-L1 m RNA脾脏的表达明显高于盲扁（P<0.05）,但总体趋势基本相同,值得注意的是,在未免疫攻毒组中表达水平显着高于免疫攻毒组（P<0.05）。未免疫攻毒组肿瘤发生率为70.7%（41/58）,CV1988疫苗攻毒组的肿瘤发生率为42.5%（17/40）,保护指数39.9%。免疫814疫苗攻毒组的肿瘤发生率为27.5%（11/40）,保护指数61.1%。本课题研究揭示了早期中国MDV的来源及其传入我国后的传播扩散方向以及中国分离株meq基因遗传多样性的变化规律,同时证明目前MD在南方优质鸡中仍呈地方性的流行并严重危害养鸡业,出现了目前的商品疫苗已不能提供完全保护的vv或vv+MDV的分离株。
董志华[4]（2019）在《四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,IB）是鸡的一种急性、高度传染性的呼吸道疾病,广西养禽业由该病造成的经济损失非常大。鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）基因组十分容易发生变异,不同国家或地区IBV流行株的基因组存在很大的差异。为了进一步阐明广西IBV分子致病变异机制和致病机理,有效控制该病,促进广西养禽业健康发展,非常有必要对广西IBV流行株进行全基因组测序分析和致病性研究。因此,本研究对四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列进行测定,并对获取的全基因组序列进行生物信息学分析,最后对该四株IBV变异株进行SPF鸡和樱桃谷肉鸭的动物回归试验,对其进行致病性研究,旨在为本地区IB防控提供依据。第一,采用高通量测序技术对IBV变异株GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株进行全基因组序列测定,分别对四株样品进行RNA提取、反转录、文库构建、测序和数据分析。研究结果显示:（1）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株全基因组核苷酸序列长度分别为27477 bp、27751 bp、27674 bp和27663 bp;（2）四株IBV基因组结构均符合经典的结构:5’-UTR-Pol-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-UTR-3’。第二,对获得的四株IBV全基因组序列进行生物信息学分析,包括全基因组序列碱基插入和缺失分析、相似性分析、系统发育分析、重组分析、S1蛋白裂解位点分析、糖基化位点分析和RNA茎环结构预测。结果显示:（1）四株代表性IBV变异株主要在基因组核苷酸2928～3428位、20490～20930位、21330～21550位、24180～24740位和27370～27440位存在明显的碱基插入和缺失现象;GX-N160421株在高度保守的N基因505～507bp处连续缺失3个碱基（aa:S）,为本地区首次发现的N基因连续缺失毒株。（2）GX-NN130048株与GX-YL9、YX1010和DY07株相似度较高,均在95.0%以上;GX-NN160421株与CKCHHB2016和GX-NN09032株相似度较高,均在96.4%以上;GX-QZ170728、GX-QZ171023株和YX10株相似度较高,分别为95.2%和95.3%。（3）GX-NN130048、GX-QZ170728和GX-QZ171023株主要与YX10和DY07株位于较近的发育分支树上;GX-NN160421株主要与GX-NN09032和CK株位于较近的发育分支树上。GX-NN130048和GX-QZ170728株S1基因均属于4/91-type,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1基因分别属于New-type和CK/CH/LSC/991-type。（4）GX-NN130048和GX-QZ170728株是来源于疫苗株4/91和LX4型野毒株的重组株,GX-NN130048株重组片段断点为1～20444和26981～27477,GX-QZ170728株重组片段断点为1～19046和26821～27674。（5）S1基因型为4/91-type的GX-NN130048和GX-QZ170728株的S1蛋白裂解位点为RRSRR,GX-NN160421和GX-QZ171023株S1蛋白裂解位点分别为HRRKR和RRFRR。（6）GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和 GX-QZ171023株S1基因N-糖基化位点分别为18、10、17和16个,N基因均为1个。（7）以基因组5’端前导序列为模板预测出3个RNA茎环结构,主要与4/91、M41、CQ04-1、SAIBK和SC021202株存在突变位点;以基因组ORF1b融合区为模板预测出2个茎环结构,主要与BJ和California株存在突变位点;其中茎环结构I是主要的核苷酸突变位点。本部分研究结果表明本地区IBV变异株主要由点突变和基因重组引起,基因组5’端前导序列和ORF1b融合区茎环结构可能对于基因重组具有重要作用,IB的防控面临更严峻的挑战。第三,为进一步了解四株代表性IBV变异株的致病性,本课题进行了G X-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ170728和GX-QZ171023株对SPF鸡以及鸭源GX-QZ170728株对樱桃谷肉鸭的致病性试验。将SPF鸡随机分为4组攻毒组和对照组,樱桃谷肉鸭随机分为攻毒组和对照组。7日龄所有攻毒组的动物分别点眼滴鼻1×106 EID50的病毒液,对照组采用等量PBS替代。攻毒后每日观察各组临床症状,及时剖检死亡鸡,记录发病率和死亡率。采集0、1、7、11、14和21 dpi血清进行IBV特异抗体的检测;采集1、3、5、7、11、14和21 dpi气管、肺脏和肾脏制作组织切片及观察病理学变化,并使用荧光定量PCR检测气管、肾脏和肛拭子的病毒载量。结果表明:（1）攻毒24 h以后,攻毒鸡出现精神沉郁、羽毛松乱、体重下降、喘气、气管啰音和饮水量增加等临床症状;剖检鸡出现气管粘液和出血、肾肿大苍白和花斑肾等病变。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭无异常变化。（2）四株IBV攻毒鸡发病率为53.33%～100%,死亡率为2.22%～28.89%,GX-QZ171023组发病率和死亡率最高。鸭源GX-QZ170728株攻毒的樱桃谷肉鸭死亡率为0%。（3）0～21 dpi时攻毒组鸡的抗体水平逐渐升高,21 dpi时抗体滴度均大于试剂盒阳性判定值;整个试验期间对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭抗体水平一直较低且无变化。（4）组织病理学观察显示:四株病毒均导致气管黏膜结构混乱、上皮细胞变性坏死和大量炎细胞浸润,肺脏上皮细胞变性坏死、大量炎细胞浸润、局部肺淤血和肺房受压萎缩。GX-QZ171023组肾小管大量坏死、个别肾小球细胞坏死、萎缩,GX-NN130048组肾脏有少量淋巴细胞浸润,其余两组攻毒鸡肾脏无异常变化;对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭病理切片无异常变化。（5）荧光定量PCR检测结果显示:1～21 dpi时4组攻毒组鸡气管、肾脏和肛拭子均可检测到IBV;GX-NN130048组和GX-NN160421组气管病毒载量明显高于肾脏病毒载量;GX-QZ170728组和GX-QZ171023组肾脏病毒载量明显高于气管病毒载量。对照组鸡、攻毒组鸭和对照组鸭均未检测到IBV。本部分研究结果表明,四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本研究结果表明,广西IBV仍然不断变异,IBV变异株主要由点突变和基因重组引起;四株IBV变异株对SPF鸡均具有致病性,其中GX-QZ171023株致病性最强;鸭源GX-QZ170728分离株对SPF鸡具有致病性,对樱桃谷肉鸭不具有致病性。本课题丰富了 IBV以及冠状病毒的全基因组生物信息库,为致病性研究提供依据,对广西乃至全国IB的防控具有重要的参考价值。
周海生[5]（2017）在《2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究》文中提出传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病,主要引起鸡群呼吸道与肾脏疾病,是影响养禽业重要的病毒性病原之一。虽然IBV疫苗广泛使用,但IB仍然频繁爆发,特别是以引起肾脏损伤的肾型IBV分离报道较多,给我国养禽业造成巨大的经济损失。由于IBV血清型众多,且各血清型间交叉保护作用较低,同时IBV很容易发生基因突变和同源重组,导致新基因型甚至新血清型不断出现,这给养禽业IB的防控带来巨大的困难。提示我们在防控IB中对病毒进行流行病学监测,并对新型病毒或变异株的流行病学特点进行分析,从而为制定IB有效的免疫防控策略提供重要的理论依据。目前IBV临床分型包括呼吸型、肾型、生殖道型和腺胃型等,其中肾型IBV是近年来我国主要的IB病变型。肾型IBV主要引起鸡肾脏肿大,尿酸盐沉积,进而引起鸡群死亡率增加。病毒S蛋白在IBV的血清学分型、基因分型、病毒组织嗜性及致病性中发挥了决定性的作用,而S蛋白中中和抗原位点、受体结合区域都是位于S1亚基上。因此,研究IBVS1蛋白与宿主之间相互作用,可以为病毒组织嗜性与致病性方面的机理提供一定参考。本研究主要内容包括以下4个部分。1、2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学分析2010～2016年间,本研究共从华东地区疑似IB发病鸡群分离到IBV 36株,其中从肉鸡分离毒株35株,从蛋鸡分离毒株1株。在所有分离株中,我们发现1例IB与H9亚型AIV混合感染。对36株IBV S1基因序列进行测定,发现S1基因长度存在4种:1620/540（28 株）、1617/539（4 株）、1611/537（3 株）及 1638/546（1 株）。S 蛋白裂解位点存在 5种:HRRRR（25 株）、RRFRR（6 株）、RRSRR（3 株）、RRLRR（1 株）及 HRRKR（1株）。序列比对显示本研究分离的36株IBV之间的S1基因核苷酸序列同源性在65.2%～99.9%,分离株与参考株之间S1基因核苷酸序列同源性在65.0%～99.9%。S1基因分型结果表明,36株IBV可划分为七个基因型:QX型（26株）、Mass型（3株）、4/91型（3 株）、tl/CH/LDT3/03 型（1 株）、TW-Ⅰ型（1 株）、TC07-2 型（1 株）和新发现的 New-Ⅰ型（1株）。结合GenBank中2001～2016年中国分离的396株IBV毒株S1基因序列,S1基因分型结果显示,2001～2016年间我国流行的432株IBV可以分为13个基因型,包括QX（321 株）、tl/CH/LDT3/03（25 株）、TW-I（20 株）、4/91（18 株）、Mass（18 株）、CK/CH/LSC/99I（7 株）、TC07-2（4 株）、TW-II（2 株）、Ck/CH/LDL/97I（1 株）、Arkansas（1株）、Vis S（1株）、及新鉴定的基因分支New-Ⅰ（8株）与New-Ⅱ（3株）。值得注意的是,属于美国相关基因分支的ck/CH/LSD/110712已在我国出现。重组分析显示,新出现的New-Ⅰ基因型IBV S1基因来源于4/91与tl/CH/LDT3/03型毒株之间的重组,基因分支New-Ⅱ病毒S1基因来源于tl/CH/LDT3/03型与QX型毒株重组。研究结果表明我国华东地区2001～2016年间流行的IBV基因型众多,基因重组导致IBV新的基因型或变异株出现。本研究为今后IBV疫苗的研发和IB的防控提供一些参考。2、2001～2016年间我国IBV基因组序列重组分析为了解我国IBV分离株基因组重组特点,特别是疫苗株基因参与IBV基因重组情况,本研究对分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 全基因组序列进行测定,同时收集2001～2016年间分离于我国的55株全基因组序列,并与参考株进行了序列重组分析。序列分析显示分离株CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/QL1403基因组中共鉴定出4个重组事件,分别位于CK/CH/2010/JT-1基因组24709-365、17160-19811、21136-21770片段及CK/CH/2014/QL1403基因组20395-24840片段。进一步对基因组序列重组来源分析显示 CK/CH/2010/JT-1 来源于 QX、CK/CH/LSC/99I、tl/CH/LDT3/03 及 4/91基因型IBV重组,CK/CH/2014/QL1403来源于QX与TC07-2型毒株重组,而CK/CH/2014/FJ14是一株典型的QX型IBV。应用RDP4对我国2001～2016年间分离的55株IBV基因组序列进行重组分析,结果显示我国2001～2016年间流行的55株IBV中有52株IBV基因组存在重组事件,其中25个IBV分离株基因组中发现有疫苗型（Mass,tl/CH/LDT3/03及4/91型等）病毒基因组片段的重组,这一结果在SimPlot分析中进一步得到确认。根据生物信息学分析结果,证明流行于我国的IBV基因组序列存在许多基因重组事件,而且疫苗毒株基因频繁参与了 IBV基因重组,导致IBV新的基因型或变异株出现,提示在防控IB时注意合理使用IBV疫苗。3、我国IBV分离株致病性分析及交叉保护研究为了探究分离株 CK/CH/2010/JT-1、CK/CH/2014/FJ14 及 CK/CH/2014/QL1403 致病特点及不同毒株间抗原关系,本研究对分离株进行动物攻毒、交叉中和及交叉保护实验。动物攻毒实验结果显示CK/CH/2010/JT-1与CK/CH/2014/FJ14可引起雏鸡严重的呼吸道症状、肾脏病变及高死亡率（43.75%与50%）,而CK/CH/2014/QL1403不引起雏鸡产生明显的临床症状与病理变化。中和实验结果表明现有抗H120与4/91疫苗株鸡多抗血清不能有效中和 IBV 分离株 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14,而抗 QX 型毒株 CK/CH/2014/FJ14鸡多抗血清能够有效中和TC07-2型IBV CK/CH/2014/QL1403。交叉保护实验结果表明CK/CH/2014/QL1403免疫雏鸡后能为鸡群提供有效保护来抵抗QX型毒株CK/CH/2014/FJ14 攻击。本研究结果显示 CK/CH/2010/JT-1 与 CK/CH/2014/FJ14 属于 IBV强毒株,且目前常用H120与4/91疫苗株不能有效防控该毒株,而CK/CH/2014/QL1403是一株天然弱毒株,而且可以作为疫苗候选株来防控QX型IBV。4、IBV S1蛋白的天然免疫应答研究为了探究IBV S1蛋白引起鸡胚肾细胞（Chickenembryokidneycell,CEKC）天然免疫应答反应,特别是肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答差异,本研究成功构建了肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14与呼吸型IBVM41株S1基因真核表达载体,通过转染CEKC研究其在细胞中的天然免疫应答。结果表明IBV S1基因在CEKC中成功获得了瞬时表达,而且S1蛋白主要表达于细胞浆中。在mRNA水平上,转染后12 h,IBV 肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1 蛋白引起 TLR3、MDA5 的表达明显高于呼吸型M41;转染后24h,肾型毒株CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 S1蛋白引起TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达显着高于呼吸型M41。在蛋白水平上,S1蛋白在 CEKC 中瞬时表达后 24h,肾型毒株 CK/CH/2010/JT1、CK/CH/2014/FJ14 引起 TLR3、IFN-β及IL-6的表达显着高于经典株M41。重组质粒转染CEKC 24 h时,使用配体poly（I:C）和LPS刺激后,IBV不同致病性毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫没有产生进一步放大作用。本研究结果表明肾型与呼吸型毒株S1蛋白引起CEKC天然免疫应答中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6的表达存在差异,暗示IBV对肾脏致病性差异可能与毒株S1蛋白引起肾细胞天然免疫中TLR3、MDA5、IFN-β及IL-6表达差异相关。
杜威威[6]（2014）在《鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备》文中研究表明鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）引起的一种高度接触性、急性呼吸道传染病。目前该病在全世界传播流行广泛,给养禽业造成严重的经济损失。由于该病毒频繁出现基因的突变和重组现象,导致很多不同基因型和血清型毒株的出现,而且这些毒株间的交叉保护性较低,甚至不存在交叉保护性,因此分析IBV基因组的结构特点有助于对传染性支气管炎进行防控。本研究以IBV SC021202株作为参考毒株设计了20对引物,利用RT-PCR法对IBVHH06株的内部基因组序列进行分段扩增,同时利用RACE Kit试剂盒对基因组的非编码区5’UTR和3’UTR进行扩增,对扩增得到的所有片段进行克隆及序列测定。将测序结果进行拼接,并且利用DNAStar软件和MEGA5.0软件对其全进组及各个基因序列进行生物信息学分析。结果显示IBV HH06株全基因组由27663个核苷酸组成,具有典型IBV基因序列特征。对不同毒株的全基因组及各个基因的序列大小进行比较,发现各毒株间3a、3b、5a、5b和N基因长度最保守,序列大小一致；5’UTR、3b、E和M基因进化相对较保守,序列大小差异较小；基因的缺失和插入主要发生在1a、1b、S基因和3’UTR区域。同源性分析比对结果显示,HH06株与其它毒株全基因组的核苷酸同源性在86%-96%之间,其中与SC021202株同源性最高,而与BJ株同源性最低；各个基因同源性比较中5’-UTR、ORF1b、E、M、5a、5b和N基因同源性相对较高可达80%-99%。全基因组及各个基因序列的系统进化树分析显示,在所有系统进化树中HH06株始终与SC021202株具有较近的亲缘关系,而与Mass型毒株亲缘关系较远。各毒株的不同基因进化树进化分支情况也有所差异,这与不同基因在进化过程中的保守性和变异情况有关。根据S1基因对不同毒株进行分型,结果显示HH06株属于HN08型。同时对不同毒株的S基因裂解位点进行比对分析,不同血清型的毒株其裂解位点不尽相同并且裂解位点的氨基酸位置也有所差异,分析这可能是由于基因的突变、缺失和插入造成的,该病毒的裂解位点是536-540位的RRFRR。此外,重组和压力选择分析表明HH06株可发生重组和正向压力选择现象。对传染性支气管炎病毒（IBV）HH06株M蛋白的抗原性和亲疏水性进行分析,去除跨膜区后的M膜内区基因成功亚克隆于pET-30a（+）和PVAX1载体中。将阳性重组质粒pET30a-M转化E. coli Rosetta（DE3）感受态细胞,诱导表达获得20ku重组M蛋白。Western-blot检测表明,重组蛋白能够与IBV参考阳性血清反应。以纯化重组M蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,其ELISA效价达到1:218; Western-blot结果证实,其具有良好的反应性和特异性。间接免疫荧光试验表明,抗M蛋白多克隆抗体可以检测到PVAX-M1转染BHK-21细胞所表达的M蛋白,且与IBV HH06毒株具有很好的特异性反应。病毒感染抑制试验表明,多抗血清对IBV Beaudette株的抑制率可达到25.9%。上述研究结果为IBV检测及M蛋白功能的深入研究奠定了基础。
张洪兵[7]（2014）在《昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究》文中指出输血传播病毒（Torque teno virus, TTV）是一种无囊膜的单股负链DNA病毒,关于其病毒分类尚有争议,目前该病毒归于圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus）。该病毒发现于1997年,一位日本学者采用差异显示分析法（representational difference analysis, RDA）在一例心脏手术输血后发生急性感染的非甲-庚型肝炎病人进行血清分析时发现的,被称为输血传播病毒。研究发现TTV可感染人和多种动物,且在人群中的感染率很高。输血传播病毒呈世界性分布,它的基因组有高度的变异性,在人与动物中的流行状况也不尽相同,而目前国内的研究尚缺乏对更多不同地区的人类输血传播病毒流行病学的研究数据,这就包括病毒的基因型别和感染率。此外,无论是体内实验还是体外实验,输血传播病毒的研究进展都较为缓慢,尤其是病毒在健康人群的流行病学。因此,为了了解该病毒的分子流行病学特点,和全基因组特征,以及为输血传播病毒所可能带来的疾病提供科学的防控依据,本实验对昆明市体检人群血清样品开展了输血传播病毒感染的分子流行病学研究。本研究中,提取昆明市体检人群血清中的病毒基因组,根据GenBank上发表的TTV标准株序列（AB008394）,并参考相关文献,设计合成针对TTV核苷酸序列较为保守的非编码区（Untranslated Region, UTR）的引物,建立了用于检测人TTV的巢式PCR方法。对昆明市某高校体检人群的224份血液样品进行了检测,检测到了151份,结果表明体检人群中TTV的感染率达到了67.41%。依据国外已经发表的研究,针对输血传播病毒核苷酸序列变异率比较大的开放阅读框1（Open Reading Frame one, ORF1）设计并合成了N22区引物,同时合成了输血传播病毒第四基因群（Group4,G4）和第五基因群（Group5,G5）的分型引物,对上一步扩增较好的样品120份进行分型实验。以PCR方法对鉴定引物筛选为阳性的血清样品进行基因分型。对其中PCR扩增效果较好的样品进行序列测定与分析,建立系统进化树。分型结果表明,N22区引物扩增出了21份,占实验样品的17.5%,以G4引物扩增了50份样品,检测出了13份阳性,比例为26%,G5引物扩增了50份,检出24份,阳性率为48%。大部分毒株与TTV Gla型相符合,而进化关系稍远的有可能是基因变异造成成的。设计并合成了五对引物,对TTV全基因组进行克隆与序列测定,并进行了序列拼接,建立了此株病毒的系统进化树,分析了氨基酸的同源性。系统进化分析表明此毒株属于TTV1a型。核苷酸同源性与氨基酸同源性分析表明与TTV1a型的相似度最高。以上研究结果表明,输血传播病毒在昆明市体检人群中的检出率为67.41%,由此推断此病毒在昆明还是有着较高的流行率：基因分型和系统进化分析表明,昆明的优势流行株还是TTV的G1a型。本实验对昆明市体检人群输血传播病毒的分子流行病学作了较为系统的调查研究,以上研究结果为输血传播病毒在体检人群中的流行状况和基因型别提供了参考依据,为输血传播病毒的进一步研究打下了坚实基础。
刘红[8]（2011）在《版纳病毒全基因组序列特征及其分子进化研究》文中研究表明版纳病毒（Banna Virus）是呼肠孤病毒科病毒,2005年国际病毒命名委员将版纳病毒列为东南亚十二节段RNA病毒属（Seadornavirus）的模式病毒。自1987年首次从云南西双版纳病人标本中分离以来,相继在位于北温带、亚热带以及热带（赤道至北纬42度）的中国、印度尼西亚、越南等国家的猪、牛、蜱以及3属10种蚊虫标本中分离。由于直接从病人标本中分离到病毒本并从病人血清中检测到病毒抗体,版纳病毒被认为是一种引起人类发热和病毒性脑炎的重要新发传染病的病原体,引起了国内外病毒学家和疾病预防控制专家的极大关注。本研究首先大规模测定版纳病毒全基因组序列并对病毒全基因组特征进行系统分析,在此基础上运用多种生物信息学理论与方法分析了不同分离年代、不同分离地区、不同宿主来源的版纳病毒的系统进化、分子溯源、种群动态以及空间迁徙路线及动力。本研究是国际上首次开展的版纳病毒相关研究,研究结果对于解释版纳病毒的分子进化和起源等病毒学理论问题以及制定该病毒所引起疾病的预防控制策略等均具有重要意义。结果报告如下：1.版纳病毒的全基因组序列的测定本研究首先测定了我国分离的20株版纳病毒全基因组核苷酸序列,病毒分离自3属10种蚊虫标本；分离地纵贯我国亚热带及北温带包括云南省、山西省、甘肃省、北京市、辽宁省及内蒙古自治区；分离年份从1995年至2007年。病毒全基因组测定质量分析结果显示,平均质量值为30.34,准确性达到98.9%,提示序列的质量具有较高的信度。这也是国际上首次完成的大规模版纳病毒全基因组序列测定。本研究在测定版纳病毒全基因组序列测定过程中采用自行设计的2套病毒全基因组扩增引物,这些扩增引物具有特异性好,工作稳定等特点,该方法与双链RNA病毒基因组传统测定方法相比工作效率大大提高。2.版纳病毒全基因组序列特征分析版纳病毒基因组全长约21,000 bp,由12条分节段的双链RNA组成,各基因节段长度从759 bp到3747 bp大小不等。病毒基因组富含嘌呤和嘧啶核苷酸（A+T含量为58.19%-65.39%）,各节段均具有紧凑的尺寸冗余序列少的特点。版纳病毒各基因节段均为单顺反子结构,仅含有一个开放读码框编码对应的病毒蛋白质分别称为VP1-VP12。分析结果显示,版纳病毒基因组中存在许多高度保守的区域,这些区域是保持病毒功能的重要活性位点同时这些保守区也是对版纳病毒进行分子诊断的理想靶标区域。版纳病毒全基因组核苷酸序列同源性分析结果显示,版纳病毒各基因节段的氨基酸同源性均高于核苷酸同源性,表明大多数突变位点位于密码子的第三位并不引起编码氨基酸的改变。版纳病毒第1-12节段基因组的同源性存在较大差异,其中第12基因节段最为保守（>84.8%,μ=92.5%）,而第9基因节段变异度最大（>37.8%,μ=81.53%）。版纳病毒各基因节段中均可检测到碱基的缺失、插入、重组和重配以及基因倍增,提示版纳病毒各基因节段的基因组结构并非严谨而是一个不断丢失和获得遗传物质的动态结构,这种动态的,多重的基因组结构改变应该是版纳病毒发生适应性进化的驱动力。以病毒全基因组为基础的系统进化分析结果显示,版纳病毒可以分为两个基因型别,基因A型和基因B型,基因A型分为由北方分离株组成的A1亚型和南方分离株组成的A2亚型,体现出明显的地域分布特征。版纳病毒基因A1、A2亚型存在型别特征性的氨基酸位点,是版纳病毒在进化过程中积累的遗传差异,更是深入开展版纳病毒病原性研究的重要分子靶标。对版纳病毒各基因节段的系统进化分析结果显示,版纳病毒第12节段基因结构保守、具有足够的用于基因分型的信息位点、更重要的是该基因节段所绘制的基因进化树与病毒全基因的分析结果基本相同,因此版纳病毒第12基因节段序列信息可以作为该病毒基因分型的分子基础(本章节部分研究结果已发表（EID,2010）。进一步分析发现,版纳病毒各基因节段的进化谱系图并不完全一致,表明版纳病毒各个基因在进化上具有不同的特点。3.版纳病毒分子溯源与地理迁徙分析为了开展版纳病毒基因组的时空动力学研究,本研究使用本课题测定的20株版纳病毒全基因因组序列数据以及从国际基因库（GenBank）下载目前仅有的4株版纳病毒全基因组序列,构建了版纳病毒全基因组非冗余序列联配数据集。使用BEAST、PAUP、Phylip以及MigraPhyla软件进行病毒选择压力、分子溯源、种群进化动态以及地理迁徙分析。研究结果显示,版纳病毒在自然界主要受净化选择压力,即大部分有害的突变被净化选择压力清除。版纳病毒基因组的平均碱基替换速率在103—10-4数量级,与呼肠孤病毒属的其他病毒如蓝舌病毒、轮状病毒等进化速率相当。由于所受选择压力不同,版纳病毒的不同基因节段表现出不同的碱基替换速率,最快的为第9基因节段（1.345*10-2/核苷酸位点/年）,而第12基因节段最慢（4.33*10-4/核苷酸位点/年）。碱基替换模型计算结果显示,版纳病毒基因组序列的变化以嘧啶之间的互换（C-T）最常见,其次是嘌呤之间的互换（A-G）。在序列中置换（Transition）的比率高于颠换（Transversion）。除第11基因节段的最适碱基替换模型为HKY外,其余基因节段的碱基替换模型均为GTR。基于MCMC算法,利用BEAST软件对版纳病毒全基因组序列进行分子溯源和种群进化动态分析,结果显示版纳病毒最近共同进化祖先出现时间为距今315年前（95%HPD：63-619）,其中基因A型和基因B型的共同进化祖先出现的时间分别距今217年（95%HPD：51-424）和49年（95%HPD：31-74）。基因A1亚型和A2亚型的最近共同祖先出现的时间分别为距今92年前（95%HPD：21-192）和164年前（95%HPD：36-327）。根据目前已知的版纳病毒毒株分离年代信息推断,中国南方分离株组成的基因A2亚型的版纳病毒是最古老的版纳病毒种群。种群动态分析结果显示,版纳病毒的种群多样性自1980年开始一直处于缓慢下降状态,2000年一2005年版纳病毒种群多样性明显下降,至2005年前后降至最低点,目前版纳病毒的种群多样性维持在101-102之间。空间动力学研究表明,中国云南省、甘肃省和辽宁省是版纳病毒的三个潜在播散地。追溯版纳病毒的迁徙路线发现其与我国候鸟的迁飞路线高度拟合,提示候鸟的迁徙在版纳病毒的播散中起到了重要的作用。4.总结本课题在国际上首次以不同时间、地点、宿主来源的版纳病毒毒株全基因组序列测定为基础,获得了版纳病毒种群基因组一级结构全貌,精准定位了版纳病毒基因组中高度保守区段、探明了型别特异性分子靶标、明确了版纳病毒进化变异的动力并阐释了版纳病毒基因重配产生的动力,为深入开展版纳病毒的病原学研究进行了有效的基因组分子数据的挖掘与分析。同时采用目前国际最先进的分析方法对版纳病毒基因组开展了系统的生物信息学研究,阐明了基因组数据所蕴藏的生物学意义：明确了版纳病毒分子分型及毒株之间亲缘关系、追溯了版纳病毒的分子起源时间及种群进化动态、重建了版纳病毒的迁徙路线。具体结论如下：的分子起源时间及种群进化动态、重建了版纳病毒空间迁徙路线并推断了其迁徙动力。这些研究结果不仅丰富了版纳病毒的分子生物学基础数据为进一步深入开展版纳病毒的病原学研究奠定了基础,更为科学的制定版纳病毒的防控策略提供了依据。
赵芳芳[9]（2011）在《禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析》文中认为鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种鸡的急性、高度接触性传染病。现在已经在全球流行蔓延,给世界家禽养殖业带来极大的经济损失。由于禽传染性支气管炎病毒（IBV）频繁的基因点突变和重组,目前已经出现了许多不同的血清型和基因型毒株,并且它们之间缺乏交叉保护性或交叉保护性低,所以分析某地区流行的IBV的基因组结构特点,有助于IB的防控。先前研究证实,近年来四川IBV分离株基因型主要是LX4即QX-like型。从S1基因进化树分析推出Sczy3分离株属于QX型,但是Sczy3基因组的其他基因片段还未被测序。本研究应用RT-PCR方法对Sczy3分离株基因组全序列进行测定,结果表明Sczy3分离株具有典型的禽状病毒基因序列特征5’Cap-1a-1b-S-3a-3b-（E）-M-5a-5b-N-3’Poly A。Sczy3分离株基因组长27695bp,含有10个开放阅读框（ORF）。Gene 1 （复制转录酶）含有两个开放阅读框ORF1a和ORF1b,分别由11856和7959个核苷酸组成,编码3951个和2652个氨基酸；Gene2（纤突蛋白基因,S）含有一个开放阅读框由3498个核苷酸组成,编码1165个氨基酸,其中S1基因编码540个氨基酸。Gene3（辅助蛋白基因）包括三个开放阅读框ORF 3a、ORF 3b和ORF3c（E）,分别编码57、62和108个氨基酸；Gene 4（膜蛋白基因,M）一个开放阅读框,由678个核苷酸组成,编码225个氨基酸；Gene 5（辅助蛋白基因）含三个开放阅读框ORF 5a和ORF 5b,分别编码65和82个氨基酸；Gene 6（核衣壳蛋白基因,N）由1230个核苷酸组成,编码409个氨基酸。部分相邻基因间有重叠现象。Gene 1和Gene 2重叠110 nt, Gene 2和Gene 3重叠32 nt, Gene 3和Gene 4重叠114 nt, Gene 5和Gene 6重叠159 nt。核酸序列同源性比较表明Sczy3与参考毒株基因组序列同源性在86.1%-94.1%之间,与QX-like IBV有核苷酸同源性最高,与Mass型IBV核苷酸同源性最低。S蛋白裂解位点分析表明H-R-R-R-R不是中国分离毒株特有的裂解位点。系统进化树分析显示,与LX4型IBV亲缘关系较近,与Mass型Conn型IBV毒株亲缘关系很远。重组分析推测,Sczy3是一株嵌合IBV毒株,假定亲本毒株是LX4和H120。综上所述,本实验课题为深入研究IBV在中国的演变特征,以及IBV的反向遗传学提供参考依据,同时也丰富了冠状病毒IBV的生物信息数据库。
赵玲[10]（2011）在《猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析》文中研究说明根据基因型的不同,参照GeneBank上发表的TTV1（GU570198.1）和TTV2（AY823991.1）的序列,各设计两对巢式引物用于检测TTV1和TTV2。采集生猪血液样品若干份,提取病毒DNA,用巢式PCR技术,扩增出TTV1、TTV2非编码区特异性目的基因片段,将目的片段回收进行克隆测序,以确定为感染TTV1与TTV2病毒。再用阳性TTV DNA为模板,对巢式PCR反应条件进行优化,通过重复性、敏感性、特异性试验来验证该方法的准确性。最后,将优化好的TTV1、TTV2检测方法用于对所采集的127份血清样品进行PCR检测。结果可看出,本研究建立的巢式PCR检测方法重复性、敏感性、特异性较好,适用于临床大规模的检测。针对四川省采集鉴定为TTV1和TTV2阳性的血清样品各两份,参照GeneBank上发表的猪输血性传播病毒1型（TTV1）和2型（TTV2）全基因组核苷酸序列（AB076001.1、GU456386.1）,设计特异性引物,采用巢式PCR的方法扩增TTV1和TTV2全基因组序列,分别进行克隆、测序和拼接,并对其进行遗传进化分析和同源性分析。结果表明,两株TTV1基因组全长分别为2852bp和2917bp；两株TTV2基因组全长分别为为2802bp和2798bp,TTV1-SC1、TTV1-SC2与已公布的TTV1基因组序列相似性分别为81%～95%、82%～94%。TTV2-SC1、TTV2-SC2与已公布的TTV2基因组序列相似性分别为88%-99%、80%-96%。系统进化树分析表明,分离株TTV1-SC1与TTV1 Bj10株（HM633251.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC2与TTV2SH0822／2008株（GU450331.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC1、TTV2-SC2与PTTV2c-VA株（GU456386.1）亲缘关系最近。通过对TTV.ORF1蛋白抗原性分析,疏水性分析和二级结构分析,推测TTV1-SC1-ORF1的抗原表位集中在155aa。173aa、409aa-423aa和470aa-497aa这三个区域之间。TTV1-SC2-ORF1的抗原表位集中在46aa-62aa、169aa-175aa和321aa-337aa这三个区域之间。而TTV2两个毒株的一级结构同源性较高,氨基酸的差异并没有影响到蛋白质的抗原性,推测TTV2.SC1-ORF1和TTV2-SC2-ORF1的抗原表位都集中在268aa-279aa、379aa-390aa、505aa-511aa和517aa-533aa这四个区域之间,这些分析结果是否能说明此区域就是真正的抗原表位,还需实验证实。本研究有利于监测猪TTV1与TTV2的疫源和进化情况,为进一步深入研究病毒形态结构、遗传与变异和基因功能特点奠定一定的生物学基础。
二、一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定（论文提纲范文）
（1）五个REV分离株全基因组序列分析及抗体阳性鸡的病毒分离检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文所用英文缩写符号说明表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 REV的生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的形态结构和分类 |
| 1.1.2 病毒的主要蛋白组成 |
| 1.1.3 病毒的理化特征 |
| 1.2 REV的流行病学 |
| 1.2.1 病毒的感染宿主 |
| 1.2.2 病毒的传播途径 |
| 1.2.2.1 水平传播 |
| 1.2.2.2 垂直传播 |
| 1.2.2.3 疫苗传播 |
| 1.2.3 流行现状 |
| 1.2.4 病毒的致病机理 |
| 1.2.5 病毒的临床症状及病理变化 |
| 1.3 REV的危害 |
| 1.3.1 免疫抑制 |
| 1.3.2 REV的混合感染 |
| 1.3.3 REV基因组的整合 |
| 1.4 分子进化分析方法 |
| 1.5 REV的诊断技术的研究进展 |
| 1.5.1 细胞培养病毒分离 |
| 1.5.2 抗体检测 |
| 1.5.3 分子诊断技术 |
| 1.5.4 鉴别诊断 |
| 1.6 REV的防控措施 |
| 1.6.1 疫苗接种 |
| 1.6.2 防控监测 |
| 1.6.3 生物安全管理 |
| 1.7 开展本研究的主要内容及其目的和意义 |
| 第二章 五株REV的分离鉴定及其全基因组测定与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验所需主要试剂 |
| 2.1.2 试验所需主要仪器设备 |
| 2.1.3 样品来源及处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CEF制备与培养 |
| 2.2.2 病毒接种与分离 |
| 2.2.3 REV分离株IFA鉴定 |
| 2.2.4 样品DNA提取及病原PCR鉴定 |
| 2.2.5 REV分离株全基因组序列扩增及克隆 |
| 2.2.6 REV分离株全基因组序列分析 |
| 2.2.7 基于贝叶斯方法对优势Ⅲ型REV在中国的分子进化研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鸡只临床症状 |
| 2.3.2 组织病理学观察结果 |
| 2.3.3 REV分离株的背景信息 |
| 2.3.4 细胞培养物的PCR鉴定结果 |
| 2.3.5 REV分离株的IFA鉴定结果 |
| 2.3.6 REV分离株各段的相似性分析结果 |
| 2.3.7 REV分离株各段的遗传进化分析结果 |
| 2.3.8 分子钟分析结果 |
| 2.3.9 系统动力学分析 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 REV在两种细胞上培养的生长曲线及REV抗体阳性鸡的病毒分离检测 |
| 试验一REV在 DF1和CEF中的增殖曲线对比试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验毒株与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒的扩增 |
| 3.2.2 细胞培养物DNA的提取 |
| 3.2.3 引物合成及制备标准品质粒 |
| 3.2.4 建立标准曲线 |
| 3.2.5 灵敏性和重复性试验 |
| 3.2.6 样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 REV-pol基因的PCR扩增及重组质粒的构建 |
| 3.3.2 标准品质粒浓度及拷贝数结果 |
| 3.3.3 标准曲线的获得 |
| 3.3.4 灵敏性和重复性试验结果 |
| 3.3.5 病毒在DF1 及CEF中增殖情况的对比 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 试验二REV抗体阳性鸡的病毒分离检测 |
| 3.5 材料 |
| 3.5.1 试验样品 |
| 3.5.2 试验试剂 |
| 3.5.3 试验仪器 |
| 3.6 方法 |
| 3.6.1 REV抗体检测 |
| 3.6.2 样品处理 |
| 3.6.3 细胞培养病毒分离 |
| 3.6.4 细胞培养物DNA的提取及PCR检测 |
| 3.7 结果 |
| 3.7.1 REV抗体检测结果 |
| 3.7.2 病毒核酸检测结果 |
| 3.8 小结与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（2）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文所用缩写符号说明表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MDV的分子生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的形态、结构和分类 |
| 1.1.2 病毒的基因组特征 |
| 1.1.3 病毒的主要致瘤基因概述 |
| 1.2 MD的致病机制 |
| 1.2.1 病毒早期的溶细胞感染 |
| 1.2.2 病毒的潜伏感染 |
| 1.2.3 病毒的第二次溶细胞感染 |
| 1.2.4 病毒转化T细胞形成肿瘤阶段 |
| 1.3 MD的流行病学 |
| 1.3.1 病毒的流行情况 |
| 1.3.2 病毒的毒力进化特征及毒株致病型的界定 |
| 1.3.3 病毒的自然感染宿主 |
| 1.3.4 病毒感染的发病日龄 |
| 1.3.5 病毒的传播方式 |
| 1.3.6 病毒与其他肿瘤性疾病病毒的共感染 |
| 1.4 MDV的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病毒分离 |
| 1.4.3 病毒抗原检测 |
| 1.4.4 聚合酶链反应(PCR)扩增技术 |
| 1.4.5 DNA探针技术 |
| 1.5 针对MDV的防控措施 |
| 1.5.1 疫苗接种方案 |
| 1.5.2 生物安全 |
| 1.6 开展本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 2017-2019广西及其周边地区马立克氏病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验所需的主要材料 |
| 2.1.2 试验中所用到的主要仪器设备 |
| 2.1.3 临床样本信息及来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备与培养 |
| 2.2.2 病鸡外周血淋巴细胞(PBL)的分离 |
| 2.2.3 组织病料的处理 |
| 2.2.4 病毒的接种与分离 |
| 2.2.5 病毒的间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测 |
| 2.2.6 病料组织或细胞培养物基因组总DNA的抽提 |
| 2.2.7 肿瘤病病原PCR鉴定 |
| 2.2.8 MDV meq基因克隆及序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 送检病鸡的临床症状及剖检病变 |
| 2.3.2 肿瘤病病原鉴定及MDV病毒分离结果 |
| 2.3.3 间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测结果 |
| 2.3.4 MDV分离株meq基因序列的分析结果 |
| 2.3.5 基于meq基因的系统进化树分析 |
| 2.3.6 广西地区MDV毒力变化趋势 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 基于meq基因系统动力学分析揭示MDV在中国的起源和演变 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本序列及信息来源 |
| 3.1.2 处理数据所用的软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MDV meq基因序列数据集 |
| 3.2.2 最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 贝叶斯系统发育分析 |
| 3.2.3.1 构建全球最大似然树 |
| 3.2.3.2 构建全球MDV早期地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.3 构建中国MDV强毒分离株地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.4 中国MDV强毒分离株种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MDV meq基因序列最佳核苷酸替代模型的选择 |
| 3.3.2 MDV系统发育分析 |
| 3.3.3 MDV地理系统分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 分离株GX18NNM4的致病性及疫苗免疫保护试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 毒株 |
| 4.1.4 实验动物和疫苗 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备及培养 |
| 4.2.2 GX18NNM4分离株的复苏和病毒增殖 |
| 4.2.3 GX18NNM4分离株纯化 |
| 4.2.4 GX18NNM4 分离株PFU测定 |
| 4.2.5 对试验鸡分组及疫苗免疫方案 |
| 4.2.6 对各试验组鸡生长增重情况的检测 |
| 4.2.7 对试验鸡免疫器官发育情况的检测 |
| 4.2.8 对试验鸡PBLs中病毒载量表达水平的动态检测 |
| 4.2.9 对鸡细胞因子PD-1、PD-L1的标准曲线的构建 |
| 4.2.9.1 PD-1和PD-L1引物合成及标准样品质粒的获得 |
| 4.2.9.2 PD-1、PD-L1 q-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.9.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.10 对试验鸡组织中细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.11 对试验鸡临床症状、鸡只剖检和病理组织学观察 |
| 4.2.12 对试验鸡发病情况及疫苗保护指数和毒力等级的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GX18NNM4 分离株PFU的测定结果 |
| 4.3.2 试验鸡生长性能的测定结果 |
| 4.3.3 试验鸡免疫器官指数的测定结果 |
| 4.3.4 MDV感染后PBLs中病毒载量动态检测结果 |
| 4.3.5 鸡细胞因子PD-1和PD-L1的标准曲线 |
| 4.3.5.1 鸡细胞因子PD-1、PD-L1 基因的RT-PCR扩增及克隆结果 |
| 4.3.5.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.5.3 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的获得 |
| 4.3.5.4 灵敏度和重复性试验 |
| 4.3.6 MDV感染后试验鸡组织中PD-1、PD-L1 m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.7 试验鸡的临床症状、剖检病变及组织学观察结果 |
| 4.3.8 试验鸡发病情况及疫苗保护指数结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（4）四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写、符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒病原学的研究概论 |
| 1.1.1 鸡传染性支气管炎病毒的分类和形态 |
| 1.1.2 鸡传染性支气管炎病毒的理化和生物特性 |
| 1.2 鸡传染性支气管炎发病机理和流行病学 |
| 1.2.1 鸡传染性支气管炎的临床症状和病理变化 |
| 1.2.2 鸡传染性支气管炎的国外流行情况 |
| 1.2.3 鸡传染性支气管炎的国内流行情况 |
| 1.2.4 IBV变异株的研究进展 |
| 1.3 鸡传染性支气管炎病毒的致病性研究 |
| 1.3.1 鸡传染性支气管炎病毒对呼吸器官的致病性 |
| 1.3.2 鸡传染性支气管炎病毒对生殖器官的致病性 |
| 1.3.3 鸡传染性支气管炎病毒对泌尿器官的致病性 |
| 1.3.4 鸡传染性支气管炎病毒对其他组织器官的致病性 |
| 1.4 鸡传染性支气管炎病毒基因组 |
| 1.4.1 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构 |
| 1.4.2 鸡传染性支气管炎病毒结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.3 鸡传染性支气管炎病毒非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.4.4 鸡传染性支气管炎病毒非编码区与生物学功能 |
| 1.5 鸡传染性支气管炎病毒全基因组生物信息学研究现状 |
| 1.5.1 鸡传染性支气管炎病毒全基因组测定分析的研究进展 |
| 1.5.2 生物信息学分析的理论基础 |
| 1.5.3 糖基化位点与蛋白裂解位点的理论基础 |
| 1.5.4 基因重组研究与RNA茎环结构研究 |
| 1.5.5 蛋白质立体结构研究与分子遗传变异研究 |
| 1.6 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV分离株背景 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的选择及合成 |
| 2.2.2 病毒的增殖及纯化 |
| 2.2.3 病毒RNA的抽提及cDNA的合成 |
| 2.2.4 S1、E、M和N结构基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.5 高通量测序IBV全基因组序列 |
| 2.2.6 一代测序与高通量测序的对比分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的纯化 |
| 2.3.2 IBV S1、E、M和N结构基因序列 |
| 2.3.3 IBV全基因组序列 |
| 2.3.4 一代测序与高通量测序的对比 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 四株广西代表性IBV变异株的生物信息学分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物信息学分析数据 |
| 3.1.2 生物信息学分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析 |
| 3.2.2 全基因组序列相似性分析 |
| 3.2.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析 |
| 3.2.4 全基因组序列的重组分析 |
| 3.2.5 S1蛋白裂解位点分析 |
| 3.2.6 糖基化位点分析 |
| 3.2.7 RNA茎环结构预测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因组序列的碱基插入和缺失分析结果 |
| 3.3.2 全基因组序列相似性分析结果 |
| 3.3.3 全基因组序列及结构蛋白基因的系统发育分析结果 |
| 3.3.4 全基因组序列的重组分析结果 |
| 3.3.5 S1蛋白裂解分析结果 |
| 3.3.6 糖基化位点分析结果 |
| 3.3.7 RNA茎环结构预测结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 四株代表性IBV变异株的致病性试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验用SPF鸡胚、SPF鸡及樱桃谷肉鸭 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 4.2.2 SPF鸡及樱桃谷肉鸭分组与攻毒 |
| 4.2.3 病料的采集与处理 |
| 4.2.4 试验动物外周血血清抗体水平的检测 |
| 4.2.5 试验动物组织切片的制作与观察 |
| 4.2.6 试验动物组织器官病毒载量检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定结果 |
| 4.3.2 临床症状与剖检症状 |
| 4.3.3 试验动物外周血血清抗体水平检测结果 |
| 4.3.4 试验动物组织病理变化结果 |
| 4.3.5 试验动物组织器官病毒载量检测结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况及参与的科研项目 |
（5）2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 中英对照缩略词 第一部分 文献综述 |
| 综述一 传染性支气管炎病毒研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现、命名与分类 |
| 1.2 生物学特性 |
| 1.3 基因组结构与主要功能蛋白 |
| 1.4 生活周期 |
| 1.5 致病机理 |
| 1.6 毒株分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 自然宿主 |
| 2.2 实验室宿主 |
| 2.3 传播方式 |
| 3 临床症状及病理变化 |
| 3.1 呼吸道 |
| 3.2 肾脏 |
| 3.3 生殖道 |
| 3.4 消化道 |
| 3.5 其它 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病原的分离鉴定 |
| 4.2 血清学诊断技术 |
| 4.3 分子生物学检测技术 |
| 5 防治 |
| 5.1 免疫预防 |
| 5.2 治疗 |
| 综述二 传染性支管炎病毒在世界范围内流行现状 |
| 1 亚洲国家IBV流行现状 |
| 2 欧洲国家IBV流行现状 |
| 3 非洲国家IBV流行现状 |
| 4 北美洲国家IBV流行现状 |
| 5 南美洲国家IBV流行现状 |
| 6 大洋洲国家IBV流行现状 |
| 综述三 禽冠状病毒纤突蛋白研究进展 |
| 1 禽冠状病毒S蛋白概述 |
| 1.1 结构特点 |
| 1.2 序列多样性 |
| 1.3 其它禽类冠状病毒S蛋白 |
| 2 禽冠状病毒S蛋白功能 |
| 2.1 组织吸附中的作用 |
| 2.2 细胞亲和性中的作用 |
| 2.3 体内组织嗜性与致病性中的作用 |
| 3 病毒吸附中宿主影响因素 |
| 3.1 唾液酸 |
| 3.2 蛋白受体 |
| 3.3 凝集素 |
| 3.4 硫酸肝素 |
| 3.5 宿主蛋白酶 |
| 4 禽冠状病毒S蛋白引起宿主天然免疫反应 |
| 参考文献 第二部分 研究内容 |
| 第一章 2001～2016年间华东地区传染性支气管炎病毒分子流行病学分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 病毒增殖 |
| 2.3 病毒总RNA提取 |
| 2.4 S1基因扩增与序列测定 |
| 2.5 S1基因序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 分离株S1蛋白长度与裂解位点的多样性 |
| 3.3 分离株S1基因分型的多样性 |
| 3.4 新分支New-Ⅰ与New-Ⅱ基因型IBV S1基因的来源 |
| 4 讨论 |
| 第二章 2001～2016年间我国传染性支气管炎病毒基因组序列重组分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分离株全序列扩增引物设计 |
| 2.2 分离株全基因组序列RT-PCR |
| 2.3 病毒基因组5'与3'端序列扩增 |
| 2.4 分离株基因组序列测定与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离株基因组结构 |
| 3.2 分离株CK/CH/2010/JT-1基因组的重组来源 |
| 3.3 分离株CK/CH/2014/QL1403基因组的重组来源 |
| 3.4 我国2001～2016年间IBV基因组重组现象普遍 |
| 4 讨论 |
| 第三章 我国鸡传染性支气管炎病毒分离株致病性分析及交叉保护研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒扩增 |
| 2.2 SPF鸡致病性实验 |
| 2.3 病毒中和实验 |
| 2.4 交叉保护实验 |
| 2.5 鸡IBV血清抗体ELISA |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV分离株致病性 |
| 3.2 交叉中和实验结果 |
| 3.3 天然弱毒CK/CH/2014/QL1403对QX型IBV交叉保护实验 |
| 4 讨论 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒S1蛋白的天然免疫应答研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 试剂与载体 |
| 1.3 主要试剂溶液配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 CEKC的制备 |
| 2.4 CEKC的质粒转染 |
| 2.5 共聚焦显微镜荧光分析 |
| 2.6 Western-blot |
| 2.7 荧光定量PCR方法检测相关因子 |
| 2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 S1基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 重组质粒酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒转染CEKC后S1蛋白的表达 |
| 3.4 IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 3.5 配体刺激后IBV S1蛋白引起CEKC天然免疫相关因子表达差异 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 全文总结 致谢 攻读博士期间所获成果 |
（6）鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IBV的病原生物学研究 |
| 1.1.1 传染性支气管炎病毒的分类 |
| 1.1.2 传染性支气管炎病毒的形态 |
| 1.1.3 传染性支气管炎病毒的理化及生物特性 |
| 1.1.4 传染性性支气管炎病毒国内外流行情况 |
| 1.2 IBV的基因组结构 |
| 1.2.1 传染性支气管炎病毒结构蛋白生物学功能 |
| 1.2.2 传染性支气管炎病毒非结构蛋白生物学功能 |
| 1.2.3 传染性支气管炎病毒非编码区生物学功能 |
| 1.2.4 IBV的全基因组序列研究进展 |
| 1.3 IB的病理变化 |
| 1.3.1 传染性支气管炎病毒的致病性 |
| 1.3.2 传染性支气管炎病毒的临床症状及病理变化 |
| 1.4 IB的诊断和防治 |
| 1.4.1 传染性支气管炎的诊断 |
| 1.4.2 传染性支气管炎的防治 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及SPF鸡胚 |
| 2.1.2 毒株、菌株及质粒 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖培养 |
| 2.2.2 病毒总RNA的提取 |
| 2.2.3 HH06株IBV全基因组内部片段的RT-PCR分段扩增 |
| 2.2.4 RACE法获取5’末端和3’末端非编码区片段 |
| 2.2.5 目的基因的克隆及序列测定 |
| 2.2.6 IBV全基因组序列的生物信息学分析 |
| 2.2.7 IBV M部分基因的亚克隆及重组表达质粒的构建 |
| 2.2.8 重组蛋白的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.9 重组M1蛋白的多克隆抗体的制备 |
| 2.2.10 M1蛋白多克隆抗体的生物学功能检测 |
| 2.2.11 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 全基因组RT-PCR分段扩增结果 |
| 3.2 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.1 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 序列测定及拼接 |
| 3.4 全基因组序列的生物信息学分析 |
| 3.4.1 基因组结构分析 |
| 3.4.2 序列同源性分析 |
| 3.4.3 系统进化树分析 |
| 3.4.4 IBV S基因裂解位点分析比较 |
| 3.4.5 重组分析 |
| 3.4.6 压力选折分析 |
| 3.5 重组表达质粒PET30A-M1和PVAX-M1的构建 |
| 3.6 PET-M1蛋白的表达及WESTERN BLOT分析 |
| 3.7 M1蛋白多克隆抗体制备及其鉴定 |
| 3.7.1 M1蛋白多克隆抗体效价检测和Western blot分析 |
| 3.7.2 M1蛋白多克隆抗体IFA检测 |
| 3.7.3 病毒感染抑制实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 全基因组分段扩增 |
| 4.2 生物信息学分析 |
| 4.3 M蛋白表达分析 |
| 4.4 M蛋白生物学功能分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 输血传播病毒概述 |
| 1.1.1 TTV病毒理化及生物学特性 |
| 1.1.2 TTV所属科属 |
| 1.2 输血传播病毒基因组及其重要蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TTV基因组特点 |
| 1.2.2 TTV的蛋白质 |
| 1.2.3 TTV基因群 |
| 1.3 输血传播病毒可能的致病性 |
| 1.3.1 肝损伤 |
| 1.3.2 肺部疾病 |
| 1.3.3 血液学疾病 |
| 1.3.4 特发性炎症性肌病 |
| 1.3.5 免疫学状况 |
| 1.3.6 系统性红斑狼疮 |
| 1.4 输血传播病毒在人体组织的分布 |
| 1.5 输血传播病毒传播途径 |
| 1.5.1 血液传播 |
| 1.5.2 粪-口途径传播 |
| 1.5.3 母婴垂直传播 |
| 1.5.4 飞沫传播 |
| 1.5.5 性传播 |
| 1.6 输血传播病毒流行状况 |
| 1.7 输血传播病毒检测方法 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 昆明体检人群TTV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清样品PCR检测 |
| 2.2.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒序列测定与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 检测体系的评价 |
| 2.3.2 对检测结果的分析 |
| 2.3.3 由输血传播病毒感染所引发的思考 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 输血传播病毒变异分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 分型引物PCR检测 |
| 3.2.2 序列测定及分析 |
| 3.2.3 同源性及遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 分型引物的设计 |
| 3.3.2 TTV基因型的特点 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 输血传播病毒全基因组序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TTV全基因组分段扩增结果 |
| 4.2.2 各片段重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.2.3 序列拼接 |
| 4.2.4 系统进化树分析 |
| 4.2.5 同源性分析 |
| 4.2.6 重组事件分析 |
| 4.2.7 TTV结构蛋白疏水性及抗原表位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（8）版纳病毒全基因组序列特征及其分子进化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语 中文摘要 Abstract 前言 第一章 |
| 版纳病毒中国分离株全基因组序列的测定 第一节 |
| 版纳病毒分离株的复苏及鉴定 第二节 |
| 版纳病毒型特异性全基因组序列扩增测定引物 第三节 |
| 版纳病毒全基因组序列扩增与测定 第二章 |
| 版纳病毒基因组结构特征研究 前言 第一节 |
| 版纳病毒基因组结构分析 第二节 |
| 版纳病毒基因分型 第三章 |
| 版纳病毒的时空动力学分析 前言 第一节 |
| 版纳病毒的核苷酸置换模型的计算 第二节 |
| 版纳病毒分子溯源与地理迁徙分析 参考文献 综述:我国新分离虫媒病毒及其感染 附录 个人简历 致谢 |
（9）禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 英汉缩略词对照表 1 前言 |
| 1.1 传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 IBV生物学分类地位与病毒粒子特征 |
| 1.1.2 IBV基因组结构 |
| 1.1.3 鸡传染性支气管炎病毒复制机制 |
| 1.1.4 IBV的结构蛋白与生物学功能 |
| 1.1.5 IBV的非结构蛋白与生物学功能 |
| 1.1.6 IBV的非编码区与生物学功能 |
| 1.2 传染性支气管炎病毒分子遗传变异研究进展 |
| 1.2.1 IBV分子遗传变异的机制 |
| 1.2.2 基因突变的引起遗传变异 |
| 1.2.3 基因重组的引起遗传变异 |
| 1.3 研究目的和意义 2 试验材料 |
| 2.1 毒株 |
| 2.2 菌种、载体 |
| 2.3 鸡胚 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 常用试剂配制 |
| 2.6 主要仪器 3 试验方法 |
| 3.1 病毒培养 |
| 3.2 病毒RNA提取 |
| 3.3 Sczy3全基因组内部片段分段扩增 |
| 3.3.1 引物设计 |
| 3.3.2 RT-PCR扩增 |
| 3.3.3 PCR反应 |
| 3.4 RACE获取基因组末端片段 |
| 3.4.1 RACE引物设计 |
| 3.4.2 3’末端cDNA的扩增(3’RACE) |
| 3.4.3 5’末端cDNA的扩增(5’RACE) |
| 3.5 PCR产物回收和纯化 |
| 3.6 PCR产物克隆 |
| 3.6.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备 |
| 3.6.2 PCR回收产物与pMD19-T载体连接 |
| 3.6.3 感受态细胞DNA转化 |
| 3.6.4 重组质粒的筛选和鉴定 |
| 3.6.5 阳性克隆质粒序列测定 |
| 3.7 序列拼接和基因组全序列的生物信息学分析 4 结果 |
| 4.1 基因组内部分段RT-PCR扩增结果 |
| 4.2 基因组末端序列的扩增结果 |
| 4.3 序列测定和拼接 |
| 4.4 Sczy3全基因组结构分析 |
| 4.5 转录调控序列分析 |
| 4.6 全基因组及各基因同源性分析 |
| 4.6.1 5’UTR和3’UTR同源性比对结果 |
| 4.6.2 Gene 1基因组同源性比对结果 |
| 4.6.3 Gene 2基因组同源性比对结果 |
| 4.6.4 Gene 3基因组同源性比对结果 |
| 4.6.5 Gene 4基因组同源性比对结果 |
| 4.6.6 Gene 5基因组同源性比对结果 |
| 4.6.7 Gene 6基因组同源性比对结果 |
| 4.7 系统进化树分析 |
| 4.7.1 全基因系统进化树分析 |
| 4.7.2 S1基因系统进化树分析 |
| 4.7.2 S2基因系统进化树分析 |
| 4.7.3 E基因系统进化树分析 |
| 4.7.4 M基因系统进化树分析 |
| 4.7.5 N基因系统进化树分析 |
| 4.8 重组推测 |
| 4.8.1 RDP3.44重组检测 |
| 4.8.2 Simplot 3.5.1序列相似性分析 |
| 4.8.3 进化树拓扑结构分析 5 讨论 |
| 5.1 全基因组分段扩增 |
| 5.2 生物信息学分析 |
| 5.3 基因重组研究 6 结论 参考文献 致谢 |
（10）猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 输血性传播病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 TTV的理化性质 |
| 1.2 TTV DNA的结构和功能 |
| 1.3 TTV的分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 人的TTV感染 |
| 2.2 灵长类动物的TTV感染 |
| 2.3 猪的TTV感染 |
| 3 致病性 |
| 4 检测方法 |
| 4.1 TTV分子生物学的检测方法 |
| 4.2 TTV分型的检测 |
| 4.3 TTV的其他检测方法 |
| 4.3.1 血清免疫学法 |
| 4.3.2 原位杂交法 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与载体 |
| 1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR引物的设计 |
| 2.2 病毒总DNA的抽提 |
| 2.3 PCR扩增 |
| 2.4 目的基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR产物目的DNA片段的回收 |
| 2.4.2 连接 |
| 2.4.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.4.4 重组质粒的转化 |
| 2.5 阳性菌的鉴定 |
| 2.6 目的基因的序列测定 |
| 2.7 PCR扩增条件的优化 |
| 2.8 特异性实验 |
| 2.9 敏感性实验 |
| 2.10 重复性实验 |
| 2.11 TTV1、TTV2 PCR检测方法的临床应用 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 病料PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.2 特异性试验鉴定结果 |
| 3.3 敏感性试验鉴定结果 |
| 3.4 重复性试验鉴定结果 |
| 3.5 PCR的临床应用的鉴定结果 |
| 3.5.1 采用PCR进行检测 |
| 3.5.2 TTV1、TTV2的感染情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于引物设计 |
| 4.2 关于TTV1、TTV2病毒的确定 |
| 4.3 关于敏感性试验、特异性试验和重复性试验 |
| 4.4 关于PCR方法的临床应用 |
| 第三章 猪输血性传播病毒1型(TTV1)和2型(TTV2)全基因组的克隆与序列分析 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 病料 |
| 2 方法 |
| 2.1 TTV1与TTV2全基因组的克隆 |
| 2.1.1 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 TTV1与TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物的克隆与序列测定 |
| 2.2 TTV1和TTV2全基因组的生物信息学分析 |
| 2.2.1 TTV1和TTV2基因组核苷酸序列同源性分析和进化树分析 |
| 2.2.2 TTV1和TTV2基因组核苷酸重复高变序列分析 |
| 2.3 TTV1和TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 2.3.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性预测分析 |
| 2.3.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 2.3.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白二级结构预测 |
| 2.3.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TTV1、TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 3.2 PCR产物的克隆及测序 |
| 3.3 TTV1、TTV2全基因组序列的拼接 |
| 3.4 TTV1、TTV2全基因组的序列分析 |
| 3.4.1 TTV1、TTV2全基因组同源性分析与进化树 |
| 3.4.2 TTV1、TTV2基因组核苷酸高变缺失序列分析 |
| 3.5 TTV1、TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 3.5.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性分析 |
| 3.5.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 3.5.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白的二级结构预测 |
| 3.5.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于全基因组克隆 |
| 3.2 关于序列分析 |
| 3.3 关于ORF1蛋白分析 |
| 结论 |
| 1 TTV1和TTV2 PCR检测方法的建立 |
| 2 TTV1与TTV2全基因组克隆与序列分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录一 TTV1和TTV2全基因组测序结果 |
四、一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定（论文参考文献）
- [1]五个REV分离株全基因组序列分析及抗体阳性鸡的病毒分离检测[D]. 李敏. 广西大学, 2021(12)
- [2]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [3]2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究[D]. 石梦雅. 广西大学, 2020(02)
- [4]四株广西代表性IBV变异株的全基因组序列测定和生物信息学分析及致病性研究[D]. 董志华. 广西大学, 2019(01)
- [5]2001～2016年间华东地区IBV分子流行病学、致病性及S1蛋白的天然免疫应答研究[D]. 周海生. 扬州大学, 2017(05)
- [6]鸡传染性支气管炎病毒HH06株全基因序列测定分析及M蛋白多克隆抗体制备[D]. 杜威威. 东北农业大学, 2014(01)
- [7]昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究[D]. 张洪兵. 昆明理工大学, 2014(01)
- [8]版纳病毒全基因组序列特征及其分子进化研究[D]. 刘红. 中国疾病预防控制中心, 2011(02)
- [9]禽传染性支气管炎病毒Sczy3株全基因组序列测定分析[D]. 赵芳芳. 四川农业大学, 2011(05)
- [10]猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析[D]. 赵玲. 四川农业大学, 2011(04)