一、犬旋毛虫肌幼虫的体外培养（论文文献综述）
杨莹[1]（2021）在《旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价》文中研究说明旋毛虫病（Trichinellosis）是由旋毛虫引起的一种世界范围内的,食源性人兽共患寄生虫病,可通过食用生肉或未熟的含有旋毛虫包囊的肉感染,具有较高的感染率,可严重威胁到人类的身体健康。随着旋毛虫病在全球再度肆虐,该病的免疫诊断和免疫预防等研究工作已成为热点。为了明确旋毛虫雌虫生殖力的影响因素,建立雌虫体外产新生幼虫的常规方法,为免疫学及免疫化学研究奠定基础,开展了本项研究。研究内容包括:感染后第7d雌虫在小鼠肠道内的分布;雌虫在小鼠肠道内持续时间;宿主不同感染天数的雌虫的生殖力;培养液种类、培养温度、时间、密度等对雌虫生殖力的影响;宿主的感染强度,年龄、性别、身体状态等对雌虫生殖力的影响;新生幼虫的免疫保护作用等。研究结果表明:旋毛虫感染后第7d,雌虫主要分布于小鼠回肠中,空肠次之,十二指肠最少。雌虫在小鼠肠期最长持续时间为37d。宿主不同感染天数对旋毛虫雌虫的生殖力有明显影响,感染后第7d获得的雌虫的生殖力最强;感染后5d、14d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.01）;感染后11d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.05）;感染后21d的雌虫新生幼虫数量与感染后第7d比显着降低（P<0.001）感染后第28d的雌虫不再产新生幼虫。在体外培养条件的影响因素中,RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫生殖力最强,M199培养液培养的雌虫平均产新生幼虫数量与RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫比显着降低（P<0.01）;MEM培养液培养的雌虫平均产新生幼虫数量与RPMI-1640+20%胎牛血清培养液培养的雌虫比显着降低（P<0.001）。培养雌虫的最适温度为37℃,此时产新生幼虫的能力最强,培养温度为27℃、30℃、42℃的平均产新生幼虫数量与37℃比显着降低（P<0.001）;35℃的平均产新生幼虫数量与37℃比显着降低（P<0.05）。培养时间与雌虫产新生幼虫数量成正比,培养72h的雌虫生殖力最强,培养12h、24h、36h的平均产新生幼虫数量与培养72h比显着降低（P<0.001）;培养48h的平均产新生幼虫数量与培养72h比显着降低（P<0.01）。雌虫的培养密度、培养液中有无雄虫以及雌虫的寄生部位对雌虫的生殖力均没有明显的影响。在宿主的影响因素中,感染200条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫生殖力最强,与感染500条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫比无显着差异;感染1000条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数量与感染200条肌幼虫小鼠体内获得的雌虫比显着降低（P<0.05）。两周龄小鼠（幼年组）肠道内获得的雌虫生殖力最强;两月龄（青年组）、五月龄（老年组）与两周龄（幼年组）小鼠比,肠道内雌虫平均产新生幼虫数量均显着降低（P<0.05）。雄性小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数与雌性小鼠比显着升高（P<0.05）。饥饿小鼠体内获得的雌虫平均产新生幼虫数与身体状态良好的小鼠体内获得的雌虫比显着升高（P<0.01）。在新生幼虫诱导小鼠免疫保护作用实验中,通过体外培养所收集到的新生幼虫经尾静脉注入小鼠体内,结果显示,注射活的新生幼虫组减虫率为88.12%;注射冻融新生幼虫组的减虫率为5.11%。试验结果表明,活的新生幼虫能有效的诱导小鼠产生免疫保护作用。
伊娜娜[2]（2020）在《旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究》文中研究表明旋毛虫是一种食源性寄生虫。在旋毛虫寄生期间,宿主需要尽可能的排出病原生物,而寄生虫需要在宿主体内成功繁殖和生存,因此在寄生过程中逐渐进化出一种复杂的宿主-寄生虫相互作用关系,而旋毛虫serpin型丝氨酸蛋白酶抑制剂（TsSPI）在这一过程中可能发挥重要作用。TsSPI在旋毛虫ML、AW、NBL中都有表达,其中在ML期表达水平最高。本研究旨在通过RNAi研究TsSPI在旋毛虫入侵以及调节宿主免疫方面的功能,同时探讨重组蛋白TsSPI在体外对巨噬细胞极化的影响。本研究利用RNA干扰技术来探索TsSPI基因在旋毛虫生命周期中的功能。设计合成三条特异性siRNA（siRNA-153、siRNA-479、siRNA-986）,同时体外合成特异性dsRNA-TsSPI,利用脂质体辅助浸泡的方法将特异性siRNA和dsRNA传递到旋毛虫肌幼虫体内,结果发现RNAi可以有效地传递到旋毛虫肌幼虫体内;利用qPCR和Western-blot检测TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,结果发现siRNA和dsRNA-TsSPI的沉默效果为剂量依赖性,且2μM siRNA或60ng/μl dsRNA为最佳的作用浓度;三组特异性siRNA和dsRNA-TsSPI均可有效的降低TsSPI基因转录水平和蛋白表达水平,其中siRNA-986和dsRNA-TsSPI效果最佳,考虑到成本,后续实验均利用60ng/μl dsRNA-TsSPI进行;利用dsRNA-TsSPI浸泡处理旋毛虫2 d后开始有很好的沉默效果,3 d后沉默效果最佳,而且持续到7 d依旧有显着的沉默效果,可见在后续感染实验中,整个肠期感染阶段（感染后3-7 d）内经过dsRNA-TsSPI浸泡处理的旋毛虫都处于TsSPI基因沉默状态;利用检测dsRNA-TsSPI处理后的旋毛虫中Ts Ka SPI的基因转录水平及蛋白水平的方法验证dsRNA-TsSPI干扰的特异性,结果显示dsRNA-TsSPI特异性良好。在本研究中,dsRNA介导的TsSPI基因沉默不影响幼虫在体外的蜕皮和存活率,但降低旋毛虫体外入侵肠上皮细胞的能力。将各组旋毛虫肌幼虫感染小鼠,结果发现与对照感染组相比,TsSPI基因沉默组小鼠肠道成虫荷和肌肉中肌幼虫数量均显着降低,但两组之间相同数量的成虫产出的新生幼虫数量没有差异。dsRNA干扰遗传性分析结果显示,旋毛虫成虫的TsSPI基因依旧受到抑制,而P 1代肌幼虫中TsSPI基因已经基本恢复到正常水平。因此我们推测肌肉中P 1代肌幼虫数量降低可能是肠道成虫荷降低导致的。将dsRNA-TsSPI介导的TsSPI基因沉默的旋毛虫感染小鼠,小鼠感染后4 d、7 d取腹腔巨噬细胞,用ELISA检测试剂盒检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫后,小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10含量均有不同程度的升高,而这种促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子形成的混合体内环境有利于旋毛虫的寄生;与感染后4 d相比,感染后7 d,促炎性细胞因子含量均有不同程度的降低,而抗炎性细胞因子含量没有显着变化。与感染未经过处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中炎性细胞因子含量均有不同程度的升高。可见TsSPI基因沉默后,旋毛虫引起的宿主炎性反应显着加剧,说明TsSPI可能通过影响宿主炎症因子之间的平衡缓解旋毛虫引起的宿主炎性反应。利用Western blot检测各组小鼠巨噬细胞P65磷酸化水平变化,结果显示,与对照组相比,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化显着降低,间接证明了随着感染时间的推移,旋毛虫引起的宿主免疫反应从Th1/Th2混合型反应转变为Th2型免疫反应为主。而与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫小鼠腹腔巨噬细胞P65磷酸化水平显着升高,说明TsSPI可以缓解旋毛虫感染引起的巨噬细胞NF-κB的磷酸化,进而抑制宿主炎症反应。利用qPCR检测旋毛虫感染后腹腔巨噬细胞中效应因子CAM标志物i NOs和AAM标志物Arg-1的m RNA表达量,结果显示,与对照组,感染旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞效应因子i NOs以及Arg-1的表达量均显着升高;和感染后4 d相比,感染后7 d小鼠腹腔巨噬细胞i NOs表达量显着降低,而Arg-1表达量则显着升高,说明旋毛虫感染可以调节宿主巨噬细胞极化。与感染未经处理的旋毛虫的小鼠相比,感染TsSPI基因沉默的旋毛虫的小鼠腹腔巨噬细胞中效应因子i NOs的相对表达量显着升高,而效应因子Arg-1的相对表达量显着降低,说明TsSPI在旋毛虫调节宿主巨噬细胞极化过程中发挥重要作用。诱导表达重组蛋白TsSPI和mu TsSPI,其中mu TsSPI为丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的突变体TsSPI。qPCR检测各CAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导巨噬细胞分泌CAM相关促炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12和效应因子i NOs的转录表达,同时利用Western blot检测巨噬细胞P65磷酸化水平和IRAK、IκB的蛋白表达情况,结果显示,TsSPI可以抑制LPS介导的IRAK、IκB降解以及P65磷酸化,并且如果改用突变体刺激,以上调节功能均明显减弱。可见TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,并进一步抑制促炎性细胞因子和效应因子i NOs的释放,阻止巨噬细胞向CAM极化。利用重组蛋白TsSPI和mu TsSPI直接刺激巨噬细胞。qPCR检测各AAM相关因子转录水平变化,结果显示,TsSPI可以有效的促进AAM相关抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和效应因子Arg-1的转录表达。同时利用Western blot检测巨噬细胞JAK2和STAT3磷酸化水平,结果显示,TsSPI可以刺激激活JAK2和STAT3发生磷酸化,改用突变体刺激并不影响这种调节功能。可见TsSPI可以刺激激活JAK2/STAT3信号通路,同时促进抗炎性细胞因子TGF-β、IL-10和AAM标志效应因子效应因子Arg-1的分泌,促进巨噬细胞向AAM极化。综上所述,dsRNA-TsSPI可以特异而有效的抑制TsSPI的基因转录水平及蛋白水平。TsSPI可能不直接参与寄生虫自身的生长和繁殖,但在一定程度上参与调节旋毛虫与宿主的相互作用。TsSPI基因沉默可以增强巨噬细胞NF-κB的磷酸化水平,促进巨噬细胞分泌炎性细胞因子,调节巨噬细胞极化。重组蛋白TsSPI可以依赖丝氨酸蛋白酶抑制活性抑制LPS介导的NF-κB通路活性,同时刺激激活JAK2/STAT3信号通路,并调节相应细胞因子和效应因子的表达。TsSPI可能通过调节巨噬细胞极化,进而影响宿主炎症因子之间的平衡,从而调节宿主免疫反应,为旋毛虫在宿主中的定殖创造有利环境。
杨达奇[3]（2020）在《利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究》文中指出丝氨酸蛋白酶是多种寄生虫的消化酶,在寄生虫的发育和生存过程中,除了具有催化和蛋白加工的功能外,还在寄生虫成囊、组织侵袭、营养摄取、免疫逃避和致病性等方面起重要作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶（Trichinella spiralis serine protease,TsSP,Genbank:ABY60762）在旋毛虫侵入宿主小肠上皮细胞（IECs）,幼虫发育中亦可能发挥了重要作用。旋毛虫谷胱甘肽S-转移酶（T.spiralis glutathione-S-transferase,TsGST,Genbank:XM＿003373603.1）在旋毛虫生活史各期均有表达,主要定位在虫体的皮层、杆状体和生殖原基,抗r TsGST免疫血清对体外幼虫侵入IEC具有显着的抑制作用,表明TsGST参与了幼虫的侵入。该文应用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对TsSP和TsGST基因的功能进行了研究,观察了RNAi对TsSP和TsGST酶活性的影响,进一步观察了RNAi对幼虫的侵袭、发育能力和生殖力的影响。根据这2种基因的mRNA序列设计小干扰RNA（small interference RNA,siRNA）,利用电穿孔法将siRNA转染到幼虫体内,通过qPCR和Western blot分别在基因转录和蛋白表达调查RNAi对基因的沉默效果。应用明胶酶谱和降解底物试验观察RNAi对肌幼虫虫体可溶蛋白和排泄分泌（ES）蛋白中天然TsSP和TsGST的酶活性。体外实验观察RNAi对幼虫侵入IEC和小肠黏膜的影响。通过动物实验观察TsSP和TsGST基因沉默对幼虫的侵袭、发育能力及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、小鼠及细胞旋毛虫（Trichinella spiralis,T1）在本实验室BALB/c小鼠中传代保种。BALB/c雌性小鼠购自河南省实验动物中心。小鼠肠上皮细胞由本实验室从正常小鼠小肠分离培养,并用于体外旋毛虫幼虫-细胞侵袭模型。2.TsSP和TsGST的诱导表达及其抗血清的制备将本实验室构建的TsSP和TsGST重组菌活化,诱导表达并纯化r TsSP和r TsGST蛋白,用于免疫小鼠,获得抗r TsSP和r TsGST的免疫血清。3.siRNA的设计与合成根据TsSP和TsGST的mRNA序列,用siDirect version2.0在线工具设计siRNA。依据筛选的每条siRNA,根据其siRNA靶向位点分别命名为TsSP特异性siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436,以及TsGST特异性siRNA-366。同时,设计1条control siRNA并加FAM荧光标记,用作阴性对照和观察siRNA是否旋毛虫体内。4.电穿孔法将siRNA转染到旋毛虫体内电穿孔法将1.0μM siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内后,体外培养18h后荧光显微镜下观察siRNA是否进入幼虫体内。5.RNAi对基因在转录和表达水平的影响通过qPCR和Western blot技术确定TsSP-siRNA的最佳干扰效果,从1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM siRNA得到最好的干扰剂量,将siRNA转染幼虫1、3、5和7 d后,观察RNAi对TsSP基因在转录和蛋白表达的沉默效果。观察TsGST-siRNA在不同浓度（1.5、2.0、2.5和3.0μM siRNA）与转染不同时间（1、2、3、4和5 d）后,最佳对TsGST基因的沉默效果。6.RNA干扰基因的特异性分别将TsSP-siRNA和TsGST-siRNA利用电穿孔法导入到旋毛虫体内后,互为对照,分析RNAi对2种基因特异性沉默的特异性。7.TsSP和TsGST基因沉默对其酶活性的影响通过明胶酶谱法和降解丝氨酸特异性底物偶氮酪蛋白,观察TsSP-siRNA对TsSP酶活性的影响。应用谷胱甘肽S转移酶底物CDNB观察TsGST-siRNA对TsGST酶活性的影响。8.RNAi对幼虫存活率及侵入IEC的影响将siRNA转染到肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态的变化,并计算幼虫的存活率。将RNAi后体外培养1d的幼虫经5%胆汁激活为肠道感染性1期幼虫（IIL1）,然后再将100条IIL幼虫与半固体培养基混匀后接种到体外培养的IEC单层上,孵育2h后观察并计数侵入IECs的幼虫数。9.RNAi对幼虫侵入小肠黏膜的影响将RNAi后体外培养1d的100条幼虫,注射入离体的2cm长的小肠袋内,37℃、5%CO2孵育2h后,剪开小肠,观察并计数幼虫对肠粘膜的侵入率。10.RNAi对旋毛虫幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制将80只BALB/c小鼠等分为4组（20只/组）,分别为TsSP-siRNA干扰组,TsGST-siRNA干扰组,control siRNA组和PBS空白对照组。每组每只小鼠径口感染300条siRNA转染后的肌幼虫。感染6d后每组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫（AW）,计算成虫减虫率,分别选取10条雌成虫在37℃、5%CO2体外培养72h收集新生幼虫（NBL）,计数NBL并拍照,计算雌成虫生殖力。剩余小鼠在感染后35d,麻醉后处死小鼠,收集肌幼虫（ML）,计算每克肌肉组织的肌幼虫虫数和幼虫减虫率。同时观察各期虫体形态并测量长度。结果1.FAM荧光信号追踪siRNA导入到肌幼虫体内后,荧光显微镜下观察到虫体内有绿色荧光。2.RNAi对TsSP和TsGST基因转录和蛋白表达水平的下调2.1 RNAi对TsSP基因转录和蛋白表达的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-156、siRNA-171和siRNA-436实验组的TsSP转录水平相对于PBS组分别降低了50.54%、36.36%（P<0.05）和13.41%。同PBS组相比TsSP蛋白表达量分别减少了54.55%、46.84%和30.06%（P<0.05）。siRNA-156在1.5、2.0、2.5、3.0和3.5μM时,TsSP在转录水平相对于PBS组分别减少了50.4 9%、51.49%、55.48%、50.14%和48.47%（P<0.05）,TsSP在蛋白表达水平相对于PBS组分别减少49.62%、44.38%、58.6%、51.91%和54.38%（P<0.05）。2.5μM siRNA-156在转染后1、3、5和7 d,TsSP基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了59.98%、37.23%、36.22%和8.71%（P<0.05）。TsSP在蛋白表达水平上相对于PBS分别减少了48.35%、36.68%、35.01%和21.7 5%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。2.2 siRNA-366对TsGST基因转录和蛋白表达水平的抑制作用:qPCR和Western blot结果表明,siRNA-366在1.5、2.0、2.5和3.0μM时,TsGST在转录水平相对于PBS组分别减少了19.53%、20.24%、21.39%和49.38%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P<0.05）。TsGST在蛋白水平相对于PBS组分别减少了40.36%、41.59%、46.42%和59.18%（P<0.05）。Control siRNA与PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。应用3.0μM siRNA-366在转染1、2、3、4和5 d,TsGST基因在转录水平上相对于PBS组分别减少了49.09%、32.65%、15.46%、12.62%和12.14%（P<0.05）;TsGST在蛋白水平上相对于PBS组分别减少了65.22%、41.00%、19.11%、12.97%和1.97%（P<0.05）。Control siRNA组相对于PBS组的差异无统计学意义（P>0.05）。3.RNA干扰基因特异性分析利用电穿孔法将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内培养1 d。TsSP-siRNA-156处理组TsSP表达水平降低了57.10%（P<0.05）而TsGST蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,TsGST-siRNA-366处理组TsGST表达水平降低了56.09%（P<0.05）而TsSP蛋白表达水平无显着性变化（P>0.05）。4.RNAi对酶活性的抑制作用4.1 RNAi对TsSP酶活性的抑制作用:明胶酶谱分析显示,2.5μM siRNA-156处理后使肌幼虫的ES蛋白降解明胶的能力明显低于control siRNA和PBS组。通过降解偶氮酪蛋白来检测siRNA-156处理后的TsSP酶活性。在siRNA-156处理组、control siRNA和PBS对照组中,相对于PBS组,siRNA-156处理组的肌幼虫ES蛋白中TsSP降解偶氮酪蛋白的酶活性降低了61.38%（F=1570.157,P<0.05）。4.2 RNAi对TsGST酶活性的抑制作用:酶活性分析表明,在siRNA-366组,TsGST催化还原性谷胱甘肽结合CDNB的酶活性为0.55±0.35 U/mg蛋白,在control siRNA组为0.94±0.12 U/mg蛋白,PBS组为1.00±0.078 U/mg蛋白。siRNA-366组和PBS组之间,TsGST的酶活性的差异有统计学意义（F=18.063,P=0.003）。control siRNA组和PBS对照组酶活性的差异无统计学意义（P=0.445）。结果表明,siRNA-366干扰可降低幼虫的TsGST的酶活性。5.RNAi后虫体存活率RNAi后培养1 d,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.67%、4.33%和3.33%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-156、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是33.33%、32.00%和31.67%（P>0.05）。结果表明,应用siRNA-156后幼虫的存活率无明显变化。RNAi后培养1 d,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是4.33%、4.00%和3.67%（P>0.05）,培养7d后,siRNA-366、control siRNA和PBS组幼虫的死亡率分别是35.67%、34.33%和32.33%（P>0.05）。结果表明,siRNA-366幼虫的存活率无明显变化。6.RNAi对幼虫侵入IEC的抑制6.1 siRNA-156对幼虫体外侵入IEC的抑制作用:将IIL1接种到IEC单层上并培养2 h,IIL1侵入并在细胞单层中迁移。siRNA-156组的幼虫侵入率（40.90%）显着低于control siRNA组（65.76%）和PBS组（64.47%）（χ2=20.999,P<0.0001）。结果表明,siRNA-156下调TsSP基因可明显抑制IIL1对IEC的侵入。6.2 siRNA-366对TsGST的沉默抑制幼虫侵入IEC:将IIL1幼虫添加到IEC单层并培养2 h后,IIL1侵入IECs并在IEC单层中迁移。siRNA-366组的幼虫侵入率（42.93%）显着低于control siRNA（64.33%）和PBS组（65.20%）（χ2=10.502,P<0.05）。与PBS组相比,siRNA-366对幼虫的侵袭具有明显的抑制作用,抑制率为34.16%。Control siRNA与PBS对照组侵入率的差异无统计学意义（χ2=0.10,P>0.05）。7.RNA干扰对幼虫侵袭小肠黏膜的抑制7.1 siRNA-156对幼虫侵袭离体小肠黏膜的抑制作用:将IIL1灌注到小肠腔中并与Tyrode溶液孵育2 h后,幼虫侵入肠粘膜。siRNA-156、control siRNA和PBS对照组的幼虫侵袭率分别为51.00%、68.00%和69.00%（χ2=8.748,P=0.013<0.05）。结果表明,与PBS相比,siRNA-156对幼虫侵入肠粘膜的抑制率为26.09%。7.2 siRNA-366对幼虫侵入离体小肠黏膜的抑制:注射经siRNA处理的IIL1并在小肠中孵育,培养2 h后,IILI侵入肠粘膜。结果表明,siRNA-366实验组的幼虫侵入率为36.00%,control siRNA对照组的幼虫侵入率为56.00%,PBS组的侵入率为58.00%。siRNA-366处理组的幼虫侵入率明显低于control siRNA组和PBS对照组（χ2=11.840,P<0.05）。8.RNAi对幼虫在小鼠体内的侵入、发育和生殖力的抑制8.1 TsSP基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-156组的成虫和肌幼虫减虫率分别为是58.85%和60.48%。siRNA-156处理幼虫攻击感染6 d,siRNA-156组的成虫荷（49.91±6.47）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(Fadults=256.630,P<0.05),siRNA-156实验组雌成虫所产新生幼虫数量（60.78±6.01）条,明显低于control siRNA对照组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条(FNBL=50.440,P<0.05)条。siRNA-156转染幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫荷（1245.736±248.0253）明显低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）的肌幼虫荷(F larvea=81.877,P<0.05)。测量旋毛虫各期虫体长度,siRNA-156组的雌成虫长度（2076.51±420.98）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS组（2437.34±270.93）μm(Ff AW=5.817,P<0.05);siRNA-156组的雄成虫长度（930.67±88.92）μm明显低于control siRNA组（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(Fm AW=9.617,P<0.05)。siRNA-156组的新生幼虫长度（87.694±19.34）μm低于control siRNA对照组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.52±10.72）μm(FNBL=9.753,P<0.05)。siRNA-156组的肌幼虫长度（923.54±115.61）μm低于control siRNA组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(FML=40.933,P<0.05)。8.2 TsGST基因沉默对幼虫的侵入、发育和生殖力的抑制:与PBS对照组相比,siRNA-366组的成虫和肌幼虫减虫率分别是62.82%和65.07%。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后6 d,siRNA-366组的成虫数（45.09±7.45）明显低于control siRNA组（120.64±9.71）和PBS组（121.27±8.96）(Fadults=15642.775,P<0.05)。siRNA-366实验组雌成虫的新生幼虫产量（58.31±5.60）条,明显低于control siRNA组的（87.94±5.88）条和PBS组的（87.47±4.85）条（F=89.133,P<0.05）。siRNA-366处理幼虫攻击感染小鼠后35 d,肌幼虫数（1101.268±144.5001）,低于control siRNA组（2942.374±245.7014）和PBS组（3152.836±565.38）虫数(Flarvea=105.050,P<0.05)。siRNA-366组的雌成虫长度（1949.96±326.75）μm明显低于control siRNA对照组（2489.28±374.71）μm和PBS（2437.34±270.93）μm(Ff AW=12.425,P<0.05);siRNA-366组的雄成虫长度（1019.82±74.222）μm明显低于control siRNA对照（1159.60±220.53）μm和PBS组（1191.67±138.93）μm(Fm AW=4.095,P<0.05)。siRNA-366组的新生幼虫长度（87.77±16.19）μm低于control siRNA组（103.5±12.05）μm和PBS组（110.592±10.72）μm(FNBL=11.751,P<0.05)。siRNA-366组的肌幼虫长度（910.01±119.80）μm低于control siRNA对照组（1144.54±114.14）μm和PBS组（1125.24±80.90）μm(FML=44.961,P<0.05)。结论1.应用电穿孔法成功将TsSP和TsGST的特异性siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内。2.siRNAs下调TsSP和TsGST的转录和蛋白表达水平,并抑制了其酶活性。3.TsSP和TsGST基因沉默显着性抑制了旋毛虫幼虫对小肠上皮细胞和肠黏膜的侵入以及虫体发育,并降低了雌虫生殖力。4.TsSP和TsGST在旋毛虫侵入、发育和生殖等方面发挥了重要作用,可作为抗旋毛虫疫苗潜在的分子靶标。
于鹏成[4]（2020）在《应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究》文中指出旋毛虫病是世界范围内一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂在幼虫发育过程中发挥着关键的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂也是早期宿主免疫反应的靶分子抗原,可以作为新的抗原用于旋毛虫感染的早期诊断。本研究应用dsRNA干扰技术沉默旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达,进一步从体外存活、侵入肠上皮细胞情况、体内发育情况、雌虫生殖力以及对宿主免疫的影响几个方面进行分析,从而为研究Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能奠定基础。本研究通过浸泡和电转两种方法将特异性dsRNA-TsKaSPI导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内,而后应用实时荧光定量PCR检测肌幼虫和成虫TsKaSPI基因转录水平,Western-blot检测肌幼虫TsKaSPI基因蛋白水平。结果表明,肌幼虫和成虫该基因转录水平与对照组相比,浸泡法降低了59.36%、67.80%（P<0.001）,电转法降低了63.36%,68.91%（P<0.001）;肌幼虫该蛋白表达水平与对照组相比,浸泡法和电转法分别降低70.67%、69.24%（P<0.001）;电转法沉默效率优于浸泡法,dsRNA-TsKaSPI最优干扰浓度为30μg/ml。同时设计一条Tsp03044基因实时荧光引物,用来验证dsRNA干扰的特异性。结果表明,TsKaSPI基因转录水平与对照基因Tsp03044相比明显降低,即dsRNA-TsKaSPI只能引起与它同源基因的沉默。随后研究dsRNA-TsKaSPI经浸泡和电转两种方法处理后,体外连续培养6d观察每1d转录水平的变化。结果表明,浸泡法在培养第1d转录水平有所降低,随后在第3d转录水平与对照组相比显着降低了63.21%（P<0.001）,达到最好的沉默效果,随着天数增加,转录水平逐渐恢复,而电转法在培养第1d转录水平与对照组相比显着降低了69.31%（P<0.001）,沉默效果最佳,第2d和第3d仍处于较低的水平,随后几天逐渐恢复,由此推出电转法转染效率优于浸泡法。体外培养观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体外存活、体外侵入肠上皮细胞影响。结果表明,浸泡法与电转法分别处理肌幼虫后体外连续培养6d,浸泡法存活率为96%、91%、87%、67%、55%、46%（P>0.05）,电转法存活率为96%、91%、82%、67%、61%、52%（P>0.05）,与对照组相比无显着性差异,推测,TsKaSPI基因对旋毛虫体外存活方面未产生影响。体外侵染肠上皮细胞结果表明,TsKaSPI处理组与对照组相比,作用5h时浸泡法与电转法侵入率分别为41%、43%,明显低于对照组,同时随着培养时间增加,侵入肌幼虫的数量逐渐增多,在第5h时入侵率达到最佳。推测,TsKaSPI基因沉默后对肌幼虫体外侵入肠上皮细胞有一定的抑制作用。将dsRNA导入后的肌幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育的影响。结果表明,6d肠道成虫和35d肌幼虫的减虫率与对照组相比分别为36.22%和31.87%,同时发现雌虫PBS组、e GFP对照组和TsKaSPI的处理组新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32（P>0.05）,处理组与对照组相比雌虫新生幼虫数没有明显的差异,推测,TsKaSPI基因与肌幼虫在宿主体内发育方面有重要的影响,而与雌虫生殖力关系不大。本研究通过检测小鼠脾淋巴细胞CD4+CD8+细胞数以及血清中抗体水平,进一步分析了TsKaSPI基因沉默后对宿主免疫方面的影响。流式细胞术（FCM）检测结果显示,TsKaSPI处理组CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞数与PBS对照组相比明显增加,CD4+/CD8+比值也明显上升。同时,ELISA检测结果显示,TsKaSPI处理组IgG1、IgG2a、IgM抗体水平与对照组相比明显降低,IgG1/IgG2a比值也显着降低。因此,我们初步认为TsKaSPI基因的沉默诱导宿主Th1型细胞免疫反应增强,引起Th2型体液免疫减弱。综上所述,本研究证实dsRNA可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达、肌幼虫对肠上皮细胞的侵入及幼虫在小鼠体内发育,同时促进Th1型细胞免疫应答,使Th2型体液免疫效应减弱。说明Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂不仅在旋毛虫侵入宿主肠粘膜及发育过程中起着非常重要的作用,而且在与宿主免疫的相互作用中也发挥着非常重要的作用,为进一步研究旋毛虫基因功能打下了坚实基础。
刘佳璇[5]（2020）在《旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究》文中指出目的采用旋毛虫肌幼虫排泄分泌物（ES）作为包被抗原,建立酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,检测小鼠血清中的IgG和IgM抗体,为旋毛虫病的诊断提供依据。建立人血清中旋毛虫抗体ELISA检测方法,并将此法应用于郑州献血人群旋毛虫抗体筛查,分析郑州市献血人群中旋毛虫病的流行现状,为做好旋毛虫病的防控工作提供策略支持和理论参考依据。方法收集旋毛虫肌幼虫抗原,并绘制蛋白定量标准曲线,测得所提取的抗原浓度,应用棋盘滴定法选择最佳抗原包被浓度,血清稀释度,酶结合物稀释度,以及其他最适宜的反应条件,分别建立起IgM和IgG抗体的ELISA检测方法。最后评价该方法的准确性、敏感性、特异性及重复性。建立人血清中旋毛虫抗体的ELISA检测方法并检测5836人份献血人群中的旋毛虫感染率,对阳性者进行电话回访,按区域、年龄、性别、学历、职业、饮食及卫生习惯等进行分类统计,对献血人群中流行情况进行分析研究。结果旋毛虫ELISA方法的建立结果。1)通用参数优化:封闭剂为5%脱脂奶粉,封闭时间为120min;显色剂四甲基联苯胺浓度为0.4g/L;血清一抗、酶标二抗以及底物显色反应时间依次为:60min、30min、30min。2)检测鼠旋毛虫IgG参数为:ES抗原包被浓度为1μg/ml,被检血清最佳稀释度为1:100,羊抗鼠IgG酶标抗体稀释度为1:6000。临界值Cut off=0.21。在特异性实验中未出现假阳性,重复性小于15%,准确度达100%,敏感性达到1:3200。3)检测鼠旋毛虫IgM参数为:ES抗原包被浓度为1μg/ml、被检血清稀释度为1:100,羊抗鼠IgM酶标抗体稀释度为1:2500。临界值Cut off=0.25。4)检测人旋毛虫IgG参数优选为:ES抗原包被浓度0.77μg/ml,羊抗人IgG酶标抗体浓度为1:2000,血清稀释度1:20,临界值Cut off=0.16。献血人群旋毛虫流行病学调查结果。检测郑州市献血者5836人,旋毛虫抗体阳性59人,阳性率为1.01%。不同区域之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=20.718,P=0.036）,以管城区旋毛虫抗体阳性率（2.69%）最高,新密市最低（0.38%）。不同的年龄组之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=21.584,P=0.001）,36-45 岁旋毛虫抗体阳性率最高为 1.69%（26/1538）,18-25岁最低为0.32%（3/938）;36岁以上年龄组旋毛虫抗体阳性率是1.55%（50/3226）,36岁以下年龄组阳性率是0.35%（9/2610）。男性旋毛虫抗体阳性率1.18%（50/4254）高于女性旋毛虫抗体阳性率0.57%（9/1582）,两者差异具有统计学意义χ2=4.238,P=0.038)。不同的学历之间旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=12.163,P=0.033）,小学文化程度旋毛虫抗体阳性率最高（2.41%）,本科生最低（0.33%）。不同职业旋毛虫抗体阳性率差异有统计学意义（χ2=40.456,P=0.001）,农民旋毛虫抗体阳性率最高3.37%（28/831）,医务工作者最低0.21%（1/467）。献全血和血小板人群的旋毛虫阳性率差异无统计学意义（χ2=0.204,P=0.651）。偶吃生食或半生食物肉类的人群旋毛虫抗体阳性率高于从不吃生食或半生食物肉类的人,差别有统计学意义（χ2=32.198,P=0.001）;加工生肉与熟食所用刀和板,不分开使用者旋毛虫抗体阳性率高于分开使用者,差别有统计学意义（χ2=20.574,P=0.001）。结论1.成功建立了 ELISA法检测小鼠血清旋毛虫IgG和IgM抗体以及检测献血者旋毛虫IgG抗体,通过增加TMB显色剂的浓度,降低ES抗原的包被量,从而提高其敏感性和特异性,该法不但适用于旋毛虫病的诊断和流行病学调查,而且可减少大量献血者旋毛虫抗体检测的费用。2.郑州市献血人群中旋毛虫感染率属于低流行区,36岁以上人群感染率较高,男性感染率大于女性,小学文化程度以及农民感染率最高。旋毛虫感染率还与不良饮食和卫生习惯不当有关,应加强卫生宣传和检疫防控工作。
杨帆[6]（2019）在《RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究》文中研究表明旋毛虫是一种主要的食源性寄生线虫,旋毛虫病主要是由于生食或半生食含旋毛虫囊包的肉制品从而感染。旋毛虫成虫寄生在宿主的小肠内,但幼虫侵入肠黏膜的机制尚不完全清楚。蛋白酶能够催化蛋白质多肽链的水解,而在寄生虫体内分泌的有多种功能的蛋白酶,在寄生虫的侵入与致病过程有着重要的作用。旋毛虫丝氨酸蛋白酶Ts SP1.2和丝氨酸抑制因子Ts SPI是从旋毛虫排泄-分泌物（excretory-secretory,ES）中获得的。实验室前期已经发现Ts SP1.2（Gen Bank Accession No.:EU302800）和Ts SPI抑制因子（Gen Bank accession no.XP003377380.1）均可能参与了旋毛虫感染性幼虫侵入小肠上皮细胞（IEC）。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在生物进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）诱发的、同源m RNA高效特异性降解的现象[1]。本研究的目的是通过RNAi确定Ts SP1.2和Ts SPI在旋毛虫幼虫侵袭和生长发育中的作用。将特异性小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）通过电穿孔法导入旋毛虫肌幼虫（muscle larvae,ML）体内后,分别通过q PCR技术和Western blot技术来验证干扰效果。同时两个基因互为无关基因进行RNAi特异性的研究。此外,选取最优si RNA并导入旋毛虫肌幼虫后,体外观察幼虫存活率并在胆汁激活为肠道第1期幼虫（IL1）后进行侵入实验,观察RNAi沉默Ts SP1.2或Ts SPI是否能抑制幼虫对肠上皮细胞（IEC）的入侵与发育。将RNAi处理后的肌幼虫经口接种感染小鼠,观察沉默Ts SP1.2和Ts SPI对幼虫发育、存活及生殖力的抑制作用。材料与方法1.旋毛虫虫种、实验动物及细胞本实验所用旋毛虫均来自本实验室昆明小鼠保种的旋毛虫（T1）。实验所用BALB/c小鼠,雄性6周龄,购自河南省实验动物中心。所用细胞系为本实验室分离出的小鼠小肠上皮细胞。2.Ts SP1.2和Ts SPI的表达纯化及抗其免疫血清的制备将本实验室之前冻存的Ts SP1.2和Ts SPI重组菌活化。进行r Ts SP1.2和r Ts SPI诱导表达,进行超声破碎并纯化蛋白,分别免疫小鼠,获取抗r Ts SP1.2和抗r Ts SPI的免疫血清。3.si RNA的设计及合成根据Ts SP1.2和Ts SPI的基因号,登录si RNA在线设计软件si Direct version 2.0进行设计。每个基因筛选出3个si RNA,根据其位点分别命名Ts SP1.2的si RNA为si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303;Ts SPI的si RNA为si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882。此外,设计一条Control si RNA并添加FAM荧光标记,用于实验观察是否将si RNA导入旋毛虫体内。4.将si RNA用电穿孔法导入到旋毛虫体内应用瞬时电击的方法,分别将2μМ不同si RNA导入到旋毛虫体内,体外培养18h后观察荧光信号。5.RNAi后在基因转录水平和蛋白表达水平的变化将siRNA转染肌幼虫后2、4、6及8天,通过qPCR和Western blot技术分别观察Ts SP1.2和Ts SPI基因转录水平和蛋白表达水平的变化。同时观察不同剂量si RNA（1、2、3μМ）的干扰效果。6.RNAi具有基因特异性分别选取2μМ来自Ts SP1.2和Ts SPI的si RNA进行基因沉默,两组互为对照组,验证RNAi基因特异性。7.RNAi后的虫体存活率及其对虫体侵入IEC的影响电穿孔处理旋毛虫肌幼虫后,体外培养7d,观察肌幼虫形态变化,计算存活率。应用电击法将1、1.5、2、2.5、3μM si RNA-534、si RNA-653和Control si RNA导入到旋毛虫肌幼虫体内,PBS作为对照组。体外孵育2h后观察肌幼虫体外入侵IEC情况,计算RNAi对虫体侵入IEC的抑制率。8.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响将80只BALB/c小鼠分为4组（每组20只）:分别为Ts SP1.2组、Ts SPI组、Control si RNA组及空白对照组。每只小鼠分别按300条肌幼虫进行经口感染。感染后6d后各组剖杀10只小鼠,回收肠道期成虫（AW）,测量雌雄虫长度并计算成虫减虫率,每组分别抽取100条成虫进行体外培养,72h后收集新生幼虫（NBL）,观察NBL虫体长度并计算雌虫生殖力。剩余小鼠在感染后35 d剖杀,收集肌幼虫,测量虫体长度并计算肌幼虫减虫率。结果1.si RNA的导入:通过荧光显微镜下观察,发现RNAi处理后幼虫体内有明显一条荧光且虫体通体发亮,而未处理的幼虫则没有荧光信号。2.RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SP1.2和Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响2.1 RNAi对旋毛虫Ts SP1.2基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot结果显示,si RNA-534、si RNA-818、si RNA-303处理组肌幼虫Ts SP1.2基因转录水平相对于PBS对照组分别降低了57.05%、47.37%和27.18%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了69.65%、68.97%和37.09%（P<0.05）;1、2、3μМsi RNA-534导入虫体后,Ts SP1.2基因转录水平降低了44.29%、53.81%和79.16%（P<0.05）,蛋白水平分别减少了35.83%、44.05%和63.28%（P<0.05）;2μM si RNA-534干扰后的肌幼虫在培养2d和4d基因表达量分别降低了56.44%和35.46%（P<0.05）,蛋白水平分别降低了84.48%与67.35%（P<0.05）,Control si RNA与PBS对照组相比较,Ts SP1.2转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。2.2 RNAi对旋毛虫肌幼虫Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的影响:q PCR和Western blot分析发现,si RNA-445、si RNA-653、si RNA-882处理组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录水平分别降低了20.50%、42.09%和12.13%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了63.52%、80.26%和10.61%（P<0.05）;1、2及3μМsi RNA-653导入虫体后1d,Ts SPI基因转录水平分别降低了23.57%、36.90%和60.78%（P<0.05）,蛋白表达水平分别减少了26.47%、75.13%和89.18%（P<0.05）;2μM si RNA-653干扰后的肌幼虫在4d和6d,基因表达量明显降低了75.75%和69.79%（P<0.05）,蛋白表达量分别降低了69.23%和50.63%（P<0.05）。Control si RNA组同PBS对照组相比,Ts SPI基因转录和蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。3.RNA干扰的基因特异性分析分别将si RNA-Ts SP1.2和si RNA-Ts SPI导入到幼虫体内后1d,观察RNAi对Ts SP1.2和Ts SPI蛋白表达水平的变化。结果发现,si RNA-Ts SP1.2处理组同PBS组相比,蛋白表达量减少了46.05%,si RNA-Ts SPI组蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）;si RNA-Ts SPI组蛋白表达量相对于PBS对照组减少了20.50%,Ts SP1.2组蛋白表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。4.RNAi后的虫体存活率RNAi后1d,si RNA-534、si RNA-653、Control si RNA组和PBS组幼虫死亡率分别为5.16%、4.80%、4.49%及3.16%（P>0.05）。沉默后7d,4组虫体死亡率分别为30.34%、34.08%、33.13%和32.73%（P>0.05）。结果表明RNAi对幼虫的生存能力没有明显的抑制作用。5.RNAi对虫体侵入IEC的抑制作用5.1 Ts SP1.2基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5及3μМ的RNAi实验组与PBS组相比,均显着抑制了幼虫对IEC的侵入,3组的幼虫侵入率分别为42.82%、38.66%和32.88%（χ2 2μM=11.095,χ2 2.5μM=14.892,χ2 3μM=23.878;P<0.01）;RNAi对幼虫侵入IEC的抑制效果与si RNA534的剂量具有相关性（r=0.981,P<0.001）。但是,不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义（P>0.05）。5.2 Ts SPI基因沉默对旋毛虫侵入IEC的抑制作用:2、2.5、3μМsiRNA-653转染旋毛虫体内后1d,3组的幼虫侵入率分别为43.68%、36.07%和30.54%（χ22μM=12.789,χ22.5μM=17.185,χ23μM=28.474,P<0.001）;幼虫侵入率与si RNA653的浓度存在相关性（r=0.976,P<0.001）。不同浓度Control si RNA组的虫体侵入率的差异无统计学意义（P>0.05）。6.RNAi对旋毛虫感染性、发育及生殖力的影响6.1 Ts SP1.2-si RNA组:si RNA-534处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷（48.31±7.29）明显低于Control si RNA组（114.15±12.68）和PBS组（112.77±9.99）（Fadults=162.493,P<0.001）;雌成虫培养72h后新生幼虫产量分别为53.33±8.26、78.17±6.33和76.17±6.78条（FNBL=39.547,P<0.001）;感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为1076.40±348.31、3410.79±643.72和3682.34±1090.84（FML=35.530,P<0.05）。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是57.16%和71.46%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度（1496.48±96.19）μm低于si RNA对照组（1807.70±105.88）μm和PBS组（1999.05±36.42）μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为（867.92±28.11）μm与（949.89±20.01）μm,亦明显小于PBS组（996.29±70.27）μm（Ffemal=50.965,Fmale=6.205,P<0.05）。3组的新生幼虫长度分别为（73.72±9.69）μm、（116.50±2.59）μm和（119.28±4.64）μm（FNBL=39.547,P<0.0001）。si RNA组的肌幼虫长度（843.44±39.60）μm亦显着短于对照组的（1133.12±55.54）μm和PBS组的（1146.38±20.70）μm（F=57.836,P<0.001）。6.2 Ts SPI-si RNA组:si RNA-653处理的肌幼虫感染小鼠后6d,RNAi组成虫荷（440.92±8.29）明显低于Control si RNA组（114.15±12.68）和PBS组（112.77±9.99）（Fadults=191.887,P<0.001）;雌成虫培养72 h后新生幼虫产量分别为（40.67±6.32）、（78.17±6.33）和（76.17±6.78）条（FNBL=112.406,P<0.001）;感染后35 d从3组小鼠回收的肌幼虫数分别为（1012.29±131.41）、（3410.79±643.72）和（3682.34±1090.84）条（FML=57.014,P<0.05）。结果表明,Ts SP1.2-si RNA处理幼虫接种小鼠后6d与35d成虫与肌幼虫的减虫率分别是63.71%和72.38%。虫体长度测量结果显示,si RNA组雌成虫长度（1517.98±90.74）μm低于si RNA对照组（1807.70±105.88）μm和PBS组（1999.05±36.42）μm;si RNA组与si RNA对照组的雄成虫长度分别为（715.32±57.60）μm与（949.89±20.01）μm,亦明显小于PBS组（996.29±70.27）μm（Ffemal=40.683,Fmale=40.008,P<0.05）。3组的新生幼虫长度分别为（69.85±4.22）μm、（116.50±2.59）μm和（119.28±4.64）μm（FNBL=57.836,P<0.001）。si RNA组的肌幼虫长度（817.44±43.25）μm亦显着短于对照组的（1133.12±55.54）μm和PBS组的（1146.38±20.70）μm（F=39.547,P<0.001）。结论1.应用电穿孔法将Ts SP1.2和Ts SPI特异性si RNA成功导入到了旋毛虫肌幼虫体内。2.Ts SP1.2-si RNA 534和Ts SPI-si RNA 653分别明显降低了Ts SP1.2和Ts SPI的转录与表达。3.RNAi沉默Ts SP1.2和Ts SPI,均显着抑制了旋毛虫对肠上皮细胞的侵入与虫体的发育,并降低了雌虫的繁殖力,进一步证实Ts SP1.2和Ts SPI为旋毛虫的侵入相关蛋白,可作为抗旋毛虫疫苗的潜在的分子靶点。
刘可[7]（2018）在《抗旋毛虫天然植物提取物筛选和作用机理初步研究》文中提出旋毛虫病是一种由旋毛形线虫引起的人兽共患寄生虫病,同时也是一种广泛流行的食源性寄生虫病,人感染旋毛虫的主要原因是生食或半生食含有旋毛虫包囊的肉制品,感染旋毛虫后会表现出全身发热、腹痛、腹泻、眼睑水肿、心肌炎、全身肌肉疼痛等症状,重症患者甚至可因并发症而死亡,对人体健康产生极大危害。当前临床上应用最普遍的治疗药物是阿苯达唑和苯并咪唑,但副作用明显,因此开发旋毛虫新型药物仍是研究热点。植物源物质来源于自然,具有安全、低毒、对非靶标生物毒害较低、对环境无污染等优点,从天然植物中获取有效物质并用于病虫害防治是目前国际上的一种趋势。本研究在体外培养条件下,用具有药理作用的20种天然植物提取物与旋毛虫共培养,筛选出能够对旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫三个发育阶段的虫体具有杀伤作用的植物提取物,进而通过体内外试验研究筛选提取物对旋毛虫体内三个发育阶段虫体的杀伤效果并初步探索其杀伤机理,以期为防治旋毛虫病提供新的治疗药物和新途径。主要研究内容及结果如下:（1）对旋毛虫各发育期虫体具有杀伤作用的天然植物提取物体外筛选:分别收集旋毛虫成虫、新生幼虫、肌幼虫进行体外培养,设空白对照组、DMSO组以及浓度分别为10、50、100mg/L的天然植物提取物组,置于37 5%CO℃2培养箱中24h,镜检并计算虫体死亡率,统计分析结果表明血根碱（50mg/L）和蔓生白薇苷G（50、100mg/L）对旋毛虫肌幼虫有杀伤作用,作用24h后死亡率分别达到100±0.0%、87.3±4.9%、100±0.0%。血根碱、补骨脂素、扁桃苷、金丝桃苷对旋毛虫成虫有杀伤作用,其中血根碱、补骨脂素、扁桃苷浓度在10mg/L时作用24h后死亡率分别达到71.6±5.3%、97.4±6.5%、93.8±5.1%,在50mg/L时死亡率均达到100±0.0%;金丝桃苷浓度在50mg/L时作用24h后死亡率为87.6±5.8%,在100mg/L时死亡率达到100±0.0%。血根碱、桑根酮C对旋毛虫新生幼虫均有杀伤作用,其中10mg/L血根碱作用24h后死亡率达到100±0.0%;桑根酮C浓度在50mg/L和100mg/L时作用24h后虫体死亡率分别为98.3±5.9%和100±0.0%。（2）血根碱对旋毛虫各发育期虫体杀伤效果和杀虫机理研究:用血根碱作用于体外培养的旋毛虫肌幼虫、成虫、新生幼虫,结果可见血根碱在浓度14-30mg/L之间对旋毛虫肌幼虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度30mg/L时虫体死亡率达到100%;在浓度3-15mg/L之间对旋毛虫成虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度15mg/L时虫体死亡率达到100%,并且随着血根碱浓度的升高,旋毛虫成虫产生新生幼虫的数量逐渐减少;在浓度1.4-3mg/L之间对旋毛虫新生幼虫杀伤作用随浓度升高而增强,在浓度3mg/L时虫体死亡率达到100%。扫描电镜观察血根碱对体外培养旋毛虫成虫体表的损伤,可见血根碱作用后的旋毛虫成虫虫体皱缩,环形皱褶加深,局部表皮溃烂,体表纵嵴消失,结构模糊,雄虫交配附器叶状小片塌陷、萎缩,无法辨认两对乳突、生殖裂口,表明血根碱能够严重侵蚀破坏旋毛虫成虫体表结构。体内实验分为3个时期,每个时期选取8周龄雌性BALBc小鼠60只,随机平均分为6组,设空白对照组、攻虫组、DMSO组、阿苯达唑组,体内旋毛虫成虫期、幼虫移行期、幼虫成囊期分别设浓度为70和80mg/kg、80和100mg/kg、100和150mg/kg的血根碱治疗组,分别于感染旋毛虫后24h内3次、13d及35d连续3天给予血根碱治疗,第7d、30d、46d天处死各组小鼠,收集虫体并计数,计算减虫率。结果表明血根碱对体内旋毛虫成虫期、幼虫移行期、幼虫成囊期均具有较好治疗效果,血根碱浓度在70mg/kg和80mg/kg时对旋毛虫成虫期的减虫率分别为37.2%和36.9%;在80mg/kg和100mg/kg时对旋毛虫幼虫移行期的减虫率分别为26.4%和39.6%;在100mg/kg组和150mg/kg是对旋毛虫幼虫成囊期的减虫率分别为31.7%和42.3%。HE染色观察小鼠十二指肠、舌肌和咬肌病理变化,测量肠绒毛长度和隐窝深度计算肠绒毛-隐窝比值（V/C）,可见不同浓度血根碱治疗后的小鼠组织病理均有不同程度的减轻,并且血根碱可以恢复肠绒毛长度,V/C显着升高（P<0.05）。PAS染色观察十二指肠计数肠粘膜杯状细胞数量,结果显示血根碱能使肠粘膜杯状细胞显着增多（P<0.05）,增强黏膜免疫促进虫体排出。ELISA法检测小鼠血清中活性氧簇（ROS）含量,结果表明血根碱能在旋毛虫幼虫移行期升高ROS含量,维持体内ROS平衡。本研究筛选到血根碱、蔓生白薇苷G、补骨脂素、扁桃苷、金丝桃苷和桑根酮C对旋毛虫有明显杀伤效果,其中血根碱对体内、体外旋毛虫三个发育时期虫体均有杀伤作用,并且能够减轻肠道和肌肉的病理变化,通过升高ROS含量,维持体内ROS平衡和增加肠粘膜杯状细胞数量促进虫体排出。
曲自刚[8]（2016）在《旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选》文中认为旋毛虫病是由旋毛虫感染引起,是一种再度肆虐流行的疾病,旋毛虫肌幼虫入侵宿主且形成适应厌氧环境的包囊,这可能是旋毛虫的正选择基因以及旋毛虫基因组与其余线虫基因组中存在差异基因而导致。正选择基因在进化中具有非同义替代率高于同义替代率的特性,可通过已存在的基因随意突变而改变基因功能,从而使寄生虫适应宿主环境,此外旋毛虫基因组与其余基因组存在差异也可能是旋毛虫适应宿主环境的另外一种机制,因此本研究分析了旋毛虫与不同的蠕虫物种之间的部分差异基因和正选择基因。半胱氨酸蛋白酶是寄生性蠕虫的重要毒力因子,可能作为一潜在抗蠕虫药物靶标和疫苗候选抗原。旋毛虫通过机械作用、酶水解来入侵宿主肌纤维,半胱氨酸蛋白酶是否在入侵中具有作用,仍属未知。组织蛋白酶F属于半胱氨酸蛋白酶家族,旋毛虫组织蛋白酶F在NCBI中初步筛选显示在旋毛虫中是多基因家族,其生物学特性未知,因此我们对旋毛虫组织蛋白酶F家族基因进行研究。本研究以旋毛虫基因组与马来丝虫、猪鞭虫、锡兰钩口线虫和秀丽隐杆线虫基因组作为对照,采用CODEML软件鉴定旋毛虫的正选择基因,结果显示鉴定出986个正选择基因,旋毛虫正选择基因可解释其对宿主厌氧环境的适应性,鉴定的正选择基因对于药物和疫苗研发具有潜在作用;采用blastn进行差异基因组研究,将旋毛虫与人类、锡兰沟口线虫、广州管圆线虫、罗阿线虫、猪蛔虫、美洲板口线虫、马来丝虫、彭亨氏线虫、犬弓首蛔虫、秀丽小杆线虫、秀丽隐杆线虫、鼠鞭虫、犬恶心丝虫、猪鞭虫、捻转血矛线虫、人鞭虫、棘球蚴、曼氏血吸虫中的半胱氨酸蛋白酶家族进行比较,结果显示组织蛋白酶F、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、肠道特异性半胱氨酸蛋白酶、二肽基肽酶在不同物种之间存在差异。成功克隆了TsCF1、TsCF2、TsCF3基因,TsCF1、TsCF2、TsCF3基因片段分别编码366 aa、496 aa和365 aa。将去除信号肽基因与pET30a表达载体连接得到重组质粒随后进行原核表达,表达获得的重组蛋白分别大小为TsCF1重组蛋白大小为45.00 kDa,TsCF2重组蛋白大小为58.29 kDa,TsCF3重组蛋白大小为43.94 kDa。将纯化的rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3免疫家兔后,获高免血清。免疫印迹实验显示TsCF1、TsCF2和TsCF3在旋毛虫肌幼虫粗抗原、排泄分泌抗原以及成虫粗抗原中均存在;免疫组化显示TsCF1定位于表皮和杆状体、TsCF2定位于生殖原基、TsCF3定位于后肠、表皮和杆状体中。抗体阻断实验显示与对照组相比,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠35天后,肌幼虫减虫率分别为54.38%、23%和48%,经TsCF1、TsCF2和TsCF3抗血清处理过的肌幼虫攻击小鼠5天后TsCF1、TsCF2和TsCF3组与对照组相比成虫减虫率分别为62.5%、50.6%和55.67%,显示TsCF1、TsCF2和TsCF3对虫体生存具有显着作用,推测TsCF家族蛋白具有胚胎致死性;采用TsCF1、TsCF2、TsCF3和TsCF1、TsCF2、TsCF3混合蛋白进行免疫,在最后一次免疫后2周进行攻虫实验,与对照组相比,上述各组的减虫率分别为23.24%、21.28%、23.29%和51.72%。将rTsCF1、rTsCF2和rTsCF3复性后,采用针对组织蛋白酶F的特异性底物Z-Phe-Arg-AMC研究重组TsCF1和TsCF2在pH为5.5时的酶活性实验和抑制实验,显示rTsCF1的Km为0.5091μM,Vmax为6.12 RFU/sμM,E64可强有效抑制rTsCF1活性,其IC50为135.50±16.90 nM;rTsCF2的Km为2.016μM,最大速度Vmax值为5.72 RFU/sμM,E64也可强有效抑制rTsCF2活性,其IC50值为112.50±6.16 nM;rTsCF3无酶活性。通过虚拟对接实验研究了TsCF1、TsCF2、TsCF3与E64和K11777之间的相互作用,将旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族进行虚拟对接,获得组织蛋白酶F家族与cystatin家族之间的最适结合构象,显示cystatin家族可与组织蛋白酶F家族之间进行结合,这部分解释了cystatin家族和组织蛋白酶F家族之间的抑制作用。将旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物库进行对接和虚拟筛选,每个组织蛋白酶F均获得200种化合物。采用SPRi技术对TsCF1进行筛选,结果显示TsCF1与头孢地尼、呋塞米、酮洛芬、地拉罗司、舒洛芬、曲尼斯特、坎地沙坦、缬沙坦、替米考星、盐酸倍他洛尔、阿奇霉素、盐酸奎宁二水合物、阿奇霉素二水合物可特异性结合,推测上述化合物可作为体内实验和体外实验筛选的候选药物来治疗旋毛虫病。基于上述结果表明,旋毛虫组织蛋白酶F可作为治疗旋毛虫病的潜在药物靶标。
王莉[9]（2014）在《免疫蛋白组学对旋毛虫诊断抗原的筛选与鉴定及初步应用》文中研究说明旋毛虫病（trichinellosis）主要因生食或半生食含有旋毛虫（Trichinella）幼虫的猪肉或其它动物肉类而感染,是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病。由于旋毛虫病无特异性的症状和体征,因此,临床上对本病不易进行及时、正确的诊断。目前,该病的确诊主要依靠肌肉活检和高特异性的免疫学诊断方法,但前者取决于肌肉样本的大小及感染程度,对于轻度和早期感染者往往不易检出,即使感染晚期因取材局限阳性率也只有50%左右,且不易被患者接受。在旋毛虫感染的过程中,幼虫的排泄分泌（excretory-secretory, ES）蛋白主要来自于杆状体分泌颗粒,直接暴露于宿主的免疫系统,是诱导宿主产生免疫应答的主要靶抗原,可刺激宿主产生强烈的免疫反应,被国际旋毛虫病委员会（International Conference on Trichinellosis, ICT）推荐用于ELISA或Western blotting检测血清中的旋毛虫抗体,但在旋毛虫感染早期抗体检出率较低,且与其他寄生虫感染者之间存在一定的交叉反应。本研究对旋毛虫肌幼虫ES蛋白进行双向电泳（two dimensional gel electrophoresis,2-DE）、 Western blotting和质谱分析,并对筛选出的旋毛虫保护性抗体靶向抗原（antigen targeted by protective antibodies, ATPA, GenBank No. gi|404638）基因进行了克隆、表达及免疫学鉴定,并将其用于旋毛虫实验感染小鼠和旋毛虫病人血清特异性抗体的检测,对寻找旋毛虫病免疫诊断候选抗原及研制高保护性旋毛虫病疫苗具有一定的科学意义。材料与方法1旋毛虫虫种、血清与实验动物本文所用虫种为河南省南阳猪源旋毛虫（T1）由本实验室传代保种。检测血清包括乡土旋毛虫（T2）、布氏旋毛虫（T3）、伪旋毛虫（T4）、纳氏旋毛虫（T7）、裂头蚴、弓形虫与日本血吸虫感染小鼠血清,以及旋毛虫病人与其他寄生虫病人血清。实验动物为昆明小鼠和雌性BALB/c小鼠。2应用免疫蛋白组学筛选旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白中的早期诊断抗原通过人工消化法和改良贝氏法收集纯净的旋毛虫肌幼虫,于体外培养后获得其ES蛋白。将旋毛虫肌幼虫经灌胃法感染BALB/c小鼠（300条/只）,在感染后14～42天隔天进行尾静脉采血,分离血清,应用肌幼虫ES蛋白分别通过ELISA和Western blotting对感染小鼠血清中的旋毛虫抗体进行检测,将感染后最早出现旋毛虫抗体的血清用于后续实验。将旋毛虫肌幼虫ES蛋白进行2-DE后转印至PVDF膜,通过Western blotting应用旋毛虫感染早期抗体阳性血清对旋毛虫肌幼虫ES蛋白进行识别,将阳性反应的蛋白点进行质谱鉴定。3旋毛虫ATPA基因的克隆、表达及鉴定将旋毛虫肌幼虫ES蛋白中分子量为30～40kDa、通过质谱被成功鉴定的阳性反应蛋白点在2-DE凝胶和胶片上的灰度值及其比值分别进行比较,从中选出比值最大的ATPA作为研究对象,应用基因工程技术对旋毛虫ATPA基因进行分子克隆、表达和纯化,将纯化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠获得其免疫血清,通过Western blotting分析其抗原性和免疫原性,应用RT-PCR观察ATPA基因在旋毛虫不同发育期（成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫及成囊期幼虫）是否转录；应用间接免疫荧光抗体试验（IFT）对ATPA蛋白在旋毛虫不同发育期的表达及其在虫体组织的定位进行分析。4rATPA用于旋毛虫感染小鼠与旋毛虫病人血清抗体的检测应用rATPA蛋白与肌幼虫ES蛋白分别建立检测旋毛虫抗体IgG的rATPA-ELISA与ES-ELISA方法,分别用于检测旋毛虫T2、T3、T4和T7)感染小鼠及其他寄生虫感染小鼠、旋毛虫病人及其他寄生虫病人血清抗体观察rATPA-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性与特异性。将30只雌性6周龄BALB/c小鼠随机分为重度（500条/只）、中度（300条/只）、轻度（100条/只）3个感染组（每组10只）,应用rATPA-ELISA与ES-ELISA同时对3组小鼠感染后2-42天的血清抗体进行检测,观察rATPA-ELISA对旋毛虫感染早期及轻度感染的诊断价值。5统计学处理采用SPSS17.0统计分析软件,采用卡方检验和重复资料的方差分析进行数据处理和统计分析,检验水平为α=0.05。结果1应用免疫蛋白组学筛选旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白中的早期诊断抗原应用ELISA及Western blotting方法在小鼠感染旋毛虫后18天可检测出血清抗旋毛虫抗体。分别将200μg和800μg旋毛虫肌幼虫ES蛋白经10%和12%凝胶进行2-DE,可将分子量为40～60kDa和30～40kDa的蛋白进行很好的分离,分别检测到约33个和150个蛋白点,转印至PVDF膜后应用旋毛虫感染后18天的小鼠血清进行Western blotting分析,发现有31个阳性反应蛋白点,分别经胰酶消化后进行MALDI-TOF/TOF-MS分析,共鉴定出7种旋毛虫蛋白,分别为：2种丝氨酸蛋白酶[serine proteases, SP1.2（gi|168805931）和SP1.3（gi|13641204, gi|168805933）]、DNase II （gi|339241449, gi|316974621）、2种假定的胰蛋白酶（putative trypsin, gi|339241891和gi|339241897）、保护性抗体靶向抗原（ATPA, gi|404638）及保守的假定蛋白（conserved hypothetical protein, gi|316966524）。对成功鉴定的已知功能的7种旋毛虫蛋白进行功能分类,7种旋毛虫蛋白均具有催化和水解活性,且与代谢过程有关。2ATPA基因的克隆、表达及鉴定通过生物信息学软件对ATPA基因进行预测,发现其不含跨膜区,但含有信号肽序列（切割位点位于17～18位氨基酸残基间）,且具有良好的抗原性。通过RT-PCR获得ATPA基因,并将其连接至表达载体pMAL-c2X,成功构建了ATPA基因的重组表达质粒pMAL-c2X-ATPA。对重组质粒pMAL-c2X-ATPA进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现在74kDa处出现一条明显的蛋白带（载体蛋白43kDa+目的蛋白31kDa）,表明重组蛋白表达成功,可溶性分析发现重组蛋白以可溶与包涵体2种形式表达。应用Amylose树脂预装柱对表达的rATPA进行纯化,将纯化后的rATPA蛋白免疫BALB/c小鼠获得免疫血清,ELISA检测rATPA免疫血清的效价为1：106。Western blotting结果显示,rATPA可被旋毛虫感染小鼠血清及rATPA免疫血清识别,rATPA免疫血清均可识别旋毛虫肌幼虫可溶性蛋白和ES蛋白的天然ATPA。RT-PCR分析发现,ATPA基因在旋毛虫4个发育期（成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫和成囊期幼虫）均有转录；IFT结果显示,ATPA蛋白在以上4个发育期均有表达,且主要定位于虫体表皮与杆状体部位。3rATPA用于旋毛虫感染小鼠血清抗体的检测应用rATPA-ELISA检测T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗体阳性率分别为96.67%（29/30）、90.00%（27/30）、93.33%（14/15）、40.91%（9/22）和93.75%（15/16）,应用ES-ELISA法检测T1、T2、T3、T4和T7感染小鼠的血清抗体,分别为100%（30/30）、100%（30/30）、100%（15/15）、90.91%（20/22）和100%（16/16）；统计学分析表明rATPA-ELISA与ES-ELISA检测T1、T2、T3和T7感染小鼠血清抗体阳性率的差异无统计学意义（P>0.05）,但在检测T4感染小鼠血清时,rATPA-ELISA的阳性率低于ES-ELISA （P<0.05）。应用rATPA-ELISA与ES-ELISA检测旋毛形线虫感染小鼠血清的抗体阳性率分别为96.67%（29/30）和100%（30/30）（P>0.05）,检测裂头蚴感染小鼠血清的抗体阳性率分别为16.13%（5/31）和3.22%（1/31）（P>0.05）,检测日本血吸虫感染小鼠血清的抗体阳性率分别为68.75%（11/16）和6.25%（1/16）（P<0.05）。rATPA-ELISA与ES-ELISA检测弓形虫感染小鼠血清及正常小鼠血清均为阴性。4rATPA-ELISA检测不同剂量旋毛虫感染小鼠后不同时间的血清抗体水平在重、中、轻度旋毛虫感染小鼠,rATPA-ELISA首次检测到旋毛虫抗体的时间分别是感染后8、12及14天,ES-ELISA首次检测到旋毛虫抗体的时间分别是感染后10、8及10天。在旋毛虫重度感染组,感染后12天和14天,rATPA-ELISA检测的抗体阳性率分别为20%和40%,ES-ELISA检测的抗体阳性率分别为80%和100%（P<0.05）；在旋毛虫中度感染组,感染后10、12和14天,rATPA-ELISA检测的抗体阳性率分别为0、20%和30%,ES-ELISA检测的抗体阳性率分别为70%、100%和100%（P<0.05）；在旋毛虫轻度感染组,感染后12～24天隔天（感染后12、14、16、18、20、22和24天）,rATPA-ELISA检测的抗体阳性率分别为0、10%、10%、10%、30%、30%和30%,ES-ELISA检测的抗体阳性率分别为10%、60%、80%、80%、80%、100%和100%（P<0.05）。在轻、中、重度旋毛虫感染小鼠,rATPA-ELISA检测到旋毛虫抗体100%的时间分别是在感染后30、22及28天,ES-ELISA检测到旋毛虫抗体100%的时间分别为感染后22、12及14天。结果表明,在旋毛虫重、中及轻度感染组,在感染后16、16及26天,rATPA-ELISA与ES-ELISA检测的血清抗体阳性率的差异均无统计学意义（P>0.05）。rATPA-ELISA检测重、中、轻度感染小鼠血清抗体水平的差异无统计学意义（F=2.049,P>0.05）,感染后不同时间的抗体水平之间的差异有统计学意义（F=219.924,P<0.05）,感染后检测时间与感染剂量之间存在交互关系（F=3.311,P<0.05）；两两比较结果显示,感染后10～16天及24～28天血清抗体水平均呈升高趋势（P<0.05）。ES-ELISA检测重、中、轻度感染小鼠血清抗体水平的差异具有统计学意义（F=5.901,P<0.05）,感染后不同时间的抗体水平之间的差异有统计学意义（F=478.276,P<0.05）,感染后检测时间和感染剂量之间存在交互关系（F=5.710,P<0.05）；两两比较结果显示感染后8-32天血清抗体水平均呈升高趋势（P<0.05）。5rATPA用于旋毛虫病人血清抗体的检测rATPA-ELISA和ES-ELISA检测旋毛虫病人血清抗体阳性率均为100%（22/22）, rATPA-ELISA仅在日本血吸虫病人血清检测到1例抗体阳性（5.000%）,而检测并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人、棘球蚴病人、猪囊尾蚴病人、裂头蚴病人及健康人血清抗体均为阴性。rATPA-ELISA检测旋毛虫病人血清抗体的敏感性与特异性分别为100%与99.13%。ES-ELISA检测日本血吸虫病人、并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人、棘球蚴病人、猪囊尾蚴病人、裂头蚴病人抗体抗体阳性率分别为20.00%（4/20）、5-00%（1/20）、14.29%（1/7）、25.00%（5/20）、25.00%（5/20）和12.50%（1/8）,而检测健康人血清抗体为阴性。rATPA-ELISA和ES-ELISA检测日本血吸虫病人、并殖吸虫病人、华支睾吸虫病人和裂头蚴病人血清的差异无统计学意义（P>0.05）,而在检测棘球蚴病人和猪囊尾蚴病人血清时,rATPA-ELISA优于ES-ELISA （P<0.05）。结论1.应用2-DE与质谱分析从旋毛虫肌幼虫ES蛋白中鉴定出了7种旋毛虫蛋白（2种丝氨酸蛋白酶、DNase Ⅱ、2种胰蛋白酶、保护性抗体靶向抗原及保守的假定蛋白）,均具有催化和水解活性,这7种蛋白对旋毛虫病可能具有潜在的早期诊断价值。2.成功构建了旋毛虫ATPA基因的重组表达质粒pMAL-c2X-ATPA, rATPA以可溶与包涵体2种形式表达。ATPA基因在旋毛虫4个发育期（成虫、新生幼虫、成囊前期幼虫和成囊期幼虫）均有转录与表达,主要定位于虫体表皮与杆状体。3.rATPA-ELISA检测旋毛虫感染小鼠和旋毛虫病人血清抗体具有良好的敏感性与特异性,提示rATPA具有用于旋毛虫病的血清学诊断的潜能。
丁文卫[10]（2011）在《犬旋毛虫病感染、检验及防治》文中进行了进一步梳理犬旋毛虫病是一种严重的人畜共患病,人由于吃到含有旋毛虫包囊的犬肉品而感染。早在1975年吉林省大安县就有9人因为吃凉拌犬肉而感染旋毛虫病的报道。
二、犬旋毛虫肌幼虫的体外培养（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、犬旋毛虫肌幼虫的体外培养（论文提纲范文）
（1）旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.2 旋毛虫体外培养研究进展 |
| 1.2.1 肌幼虫到成虫的培养 |
| 1.2.2 成虫到新生幼虫的体外培养 |
| 1.3 旋毛虫新生幼虫免疫研究进展 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验动物、虫种 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2.2 旋毛虫成虫的收集 |
| 2.2.3 新生幼虫的收集与计数 |
| 2.2.4 成虫的体外培养 |
| 2.2.5 感染第7天的小鼠肠道内雌虫的分布 |
| 2.2.6 旋毛虫雌虫在小鼠肠道内的持续时间 |
| 2.2.7 旋毛虫雌虫生殖力的影响因素 |
| 2.2.8 新生幼虫感染力试验 |
| 2.2.9 新生幼虫诱导的小鼠免疫保护作用 |
| 2.2.10 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 感染第七天小鼠肠道内旋毛虫雌虫的分布 |
| 3.2 旋毛虫雌虫在小鼠肠道内的持续时间 |
| 3.3 旋毛虫雌虫生殖力的影响因素 |
| 3.3.1 宿主感染后不同天数获得的旋毛虫雌虫的生殖力 |
| 3.3.2 培养液对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.3 温度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.4 培养时间对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.5 不同培养密度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.6 有无雄虫对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.7 雌虫寄生部位对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.8 宿主感染强度对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.9 宿主年龄对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.10 宿主性别对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.3.11 宿主身体状态对旋毛虫雌虫生殖力的影响 |
| 3.4 旋毛虫新生幼虫的感染力试验 |
| 3.5 旋毛虫新生幼虫诱导小鼠免疫保护作用试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（2）旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫病与旋毛虫 |
| 1.1.1 旋毛虫病概述 |
| 1.1.2 旋毛虫生活史 |
| 1.1.3 旋毛虫入侵对宿主的影响 |
| 1.2 RNA干扰技术在寄生虫中的应用 |
| 1.2.1 常见的生物基因功能研究技术 |
| 1.2.2 RNA干扰技术的原理 |
| 1.2.3 RNA干扰在寄生虫中的作用方式和应用 |
| 1.3 旋毛虫与丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.1 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.3.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概述 |
| 1.3.3 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类及结构特点 |
| 1.3.4 寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.4 旋毛虫感染与免疫 |
| 1.4.1 寄生虫感染后宿主免疫策略 |
| 1.4.2 寄生虫感染与宿主T细胞 |
| 1.4.3 寄生虫感染与宿主巨噬细胞 |
| 1.4.4 寄生虫感染与宿主其他重要免疫细胞 |
| 1.4.5 寄生虫与免疫逃避 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 虫株与实验动物 |
| 2.1.2 主要菌株、细胞株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要应用软件 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 TsSPI基因siRNA设计与合成 |
| 2.2.2 TsSPI基因dsRNA设计与合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫的收集与体外培养 |
| 2.2.4 siRNA/dsRNA导入旋毛虫肌幼虫 |
| 2.2.5 qPCR检测TsSPI基因转染水平变化 |
| 2.2.6 Western blot检测TsSPI蛋白表达水平 |
| 2.2.7 qPCR检测dsRNA干扰效果的时间效应 |
| 2.2.8 检测dsRNA干扰的基因特异性 |
| 2.2.9 检测TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活率以及入侵IECs能力 |
| 2.2.10 检测TsSPI基因沉默后旋毛虫在小鼠体内发育、繁殖、减虫率情况 |
| 2.2.11 qPCR检测TsSPI基因沉默在旋毛虫中的遗传情况 |
| 2.2.12 检测旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞细胞相关因子表达水平变化 |
| 2.2.13 检测TsSPI基因沉默的旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化情况 |
| 2.2.14 CCK8 检测小鼠巨噬细胞raw264.7 增值活力 |
| 2.2.15 qPCR检测CAM相关因子基因表达量 |
| 2.2.16 Western blot检测巨噬细胞IRAK通路相关蛋白含量 |
| 2.2.17 qPCR检测AAM相关基因表达量 |
| 2.2.18 Western blot检测巨噬细胞JAK2/STAT3磷酸化水平 |
| 2.2.19 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 利用RNAI沉默TSSPI基因 |
| 3.1.1 siRNA的设计与dsRNA的构建结果 |
| 3.1.2 siRNA导入旋毛虫体内情况分析 |
| 3.1.3 不同浓度RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.4 不同RNAi对 TsSPI转录水平的影响 |
| 3.1.5 dsRNA-TsSPI干扰的时间效应 |
| 3.1.6 dsRNA-TsSPI干扰的特异性 |
| 3.2 TSSPI基因沉默对ML体外存活率与入侵肠上皮细胞影响 |
| 3.2.1 TsSPI基因沉默对ML体外存活率的影响 |
| 3.2.2 TsSPI基因沉默对肌幼虫体外入侵肠上皮细胞的影响 |
| 3.3 TSSPI基因沉默对ML入侵宿主肠道并发育的影响 |
| 3.4 TSSPI基因沉默的遗传性分析 |
| 3.5 TSSPI基因沉默对ML入侵后宿主免疫相关因子的影响 |
| 3.5.1 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞炎性细胞因子含量影响 |
| 3.5.2 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞效应因子含量的影响 |
| 3.5.3 TsSPI基因沉默对旋毛虫入侵后小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB磷酸化水平的影响 |
| 3.6 重组蛋白TSSPI对小鼠巨噬细胞极化的影响 |
| 3.6.1 重组蛋白的表达纯化及复性 |
| 3.6.2 重组蛋白对小鼠巨噬细胞raw264.7增值活力的影响 |
| 3.6.3 重组蛋白对CAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.4 重组蛋白对巨噬细胞NF-κB通路相关蛋白的影响 |
| 3.6.5 重组蛋白对AAM相关因子基因表达水平影响 |
| 3.6.6 重组蛋白对巨噬细胞JAK2/STAT3 通路相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA干扰对旋毛虫TsSPI基因表达的影响 |
| 4.2 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵宿主过程中的功能研究 |
| 4.3 旋毛虫TSSPI基因沉默在旋毛虫入侵过程中免疫调节功能的研究 |
| 4.4 重组蛋白TSSPI调节巨噬细胞极化的研究 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.2 RNA干扰技术 |
| 1.3 TsSP的研究 |
| 1.4 TsGST的研究 |
| 1.5 研究目的 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验动物、旋毛虫及细胞系 |
| 2.4 主要试剂配方 |
| 3 方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 TsSP和 TsGST的菌种活化及表达 |
| 3.3 蛋白的纯化 |
| 3.4 TsSP和 TsGST蛋白浓度的测定 |
| 3.5 TsSP和 TsGST免疫血清的制备 |
| 3.6 ELISA法鉴定蛋白的抗血清效价 |
| 3.7 siRNA的设计和合成 |
| 3.8 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 3.9 将siRNA导入到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 3.10 虫体可溶蛋白的提取 |
| 3.11 Western blot |
| 3.12 提取旋毛虫肌幼虫的RNA |
| 3.13 RNA反转录成c DNA |
| 3.14 Real-time PCR验证RNAi对基因的转录的影响 |
| 3.15 RNA干扰的基因特异性 |
| 3.16 明胶酶谱法证明RNAi对 TsSP基因酶活性的影响 |
| 3.17 底物偶氮酪蛋白验证RNAi对 TsSP基因酶活性的影响 |
| 3.18 底物CDNB检测RNAi对TsGST的酶活性 |
| 3.19 RNAi对幼虫在体外存活的影响 |
| 3.20 RNAi对旋毛虫幼虫体外侵入IEC的影响 |
| 3.21 RNAi对旋毛虫幼虫体外侵入小肠黏膜的影响 |
| 3.22 RNAi对旋毛虫肌幼虫侵入肠黏膜及其发育的影响 |
| 3.23 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 RNAi对 TsSP基因的研究 |
| 4.1.1 siRNA的设计与合成 |
| 4.1.2 将siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.1.3 qPCR检测siRNA对 TsSP基因转录的抑制 |
| 4.1.4 Western blot检测RNAi对TsSP的蛋白表达抑制 |
| 4.1.5 明胶酶谱法检测RNAi对 TsSP酶活性的抑制 |
| 4.1.6 偶氮酪蛋白为底物检测RNAi对 TsSP酶活性的抑制 |
| 4.1.8 siRNA-156 对幼虫体外侵入IEC的抑制作用 |
| 4.1.9 RNAi对幼虫体外侵袭肠黏膜的抑制作用 |
| 4.1.10 TsSP基因沉默对幼虫在小鼠体内侵入、发育和生殖的抑制 |
| 4.1.11 siRNA-156处理后对虫体各期形态大小的影响 |
| 4.2 RNAi对 TsGST功能的研究 |
| 4.2.1 TsGST的 siRNA设计与和合成 |
| 4.2.2 将siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.2.3 qPCR检测siRNA-366对TsGST基因转录的抑制 |
| 4.2.4 Western blotting检测RNAi对 TsGST的蛋白表达抑制 |
| 4.2.5 CDNB为底物检测RNAi对 TsSGT酶活性的抑制 |
| 4.2.6 siRNA-366 对幼虫体外侵入IEC的抑制作用 |
| 4.2.7 siRNA-366对幼虫体外侵袭小肠黏膜的抑制作用 |
| 4.2.8 TsGST基因沉默对幼虫在小鼠体内侵入、生长和生殖的抑制 |
| 4.2.9 siRNA-366处理后对旋毛虫各个期形态大小的影响 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 综述 RNA干扰在寄生蠕虫中的应用 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（4）应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫和旋毛虫病 |
| 1.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂概况 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂的分类 |
| 1.2.2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能和作用机制 |
| 1.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂概况 |
| 1.3.1 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构特征 |
| 1.3.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能 |
| 1.3.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂作用机制 |
| 1.4 RNA干扰概述 |
| 1.4.1 dsRNA干扰的机理 |
| 1.5 旋毛虫肌幼虫体外侵染肠上皮细胞的研究进展 |
| 1.6 寄生虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.1 吸虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.2 线虫RNAi的研究进展 |
| 1.6.3 原虫RNAi的研究进展 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验虫种、菌株与细胞系 |
| 2.1.2 实验动物及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 qPCR引物与dsRNA引物片段序列 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 旋毛虫的收集 |
| 2.2.2 TsKaSPI基因dsRNA合成 |
| 2.2.3 旋毛虫肌幼虫和成虫dsRNA的导入 |
| 2.2.4 转染浓度与时间的优化 |
| 2.2.5 dsRNA的特异性 |
| 2.2.6 dsRNA对TsKaSPI转录水平的影响 |
| 2.2.7 dsRNA对TsKaSPI蛋白表达水平的影响 |
| 2.2.8 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫幼虫体外存活及侵入肠上皮细胞的影响 |
| 2.2.9 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫体内发育及雌虫生殖力的影响 |
| 2.2.10 TsKaSPI基因沉默后肌幼虫对宿主T细胞增值及抗体水平的影响 |
| 2.2.11 实验数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 dsRNA体外转录模板(含T7启动子) |
| 3.2 dsRNA体外合成 |
| 3.3 dsRNA对TsKaSPI转录水平的影响 |
| 3.3.1 浸泡法导入dsRNA TsKaSPI转录水平变化 |
| 3.3.2 电转法导入dsRNA TsKaSPI转录水平变化 |
| 3.4 dsRNA的特异性 |
| 3.5 dsRNA对TsKaSPI蛋白表达水平的影响 |
| 3.5.1 浸泡法导入dsRNA TsKaSPI蛋白表达水平变化 |
| 3.5.2 电转法导入dsRNA TsKaSPI蛋白表达水平变化 |
| 3.6 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫幼虫体外存活及侵入肠上皮细胞的影响 |
| 3.6.1 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫肌幼虫体外存活的影响 |
| 3.6.2 TsKaSPI基因沉默对旋毛虫肌幼虫侵入肠上皮细胞的影响 |
| 3.7 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育及雌虫生殖力的影响 |
| 3.8 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫感染小鼠后流式细胞检测CD4~+、CD8~+细胞水平 |
| 3.9 TsKaSPI基因沉默对肌幼虫感染小鼠后IgG1、IgG2a、IgM抗体水平的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 dsRNA干扰对旋毛虫TsKaSPI基因表达的影响 |
| 4.2 TsKaSPI在旋毛虫入侵宿主过程中的作用 |
| 4.3 TsKaSPI基因沉默对宿主免疫保护的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（5）旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文名词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 旋毛虫虫种 |
| 1.2 实验小白鼠 |
| 1.3 试验血清 |
| 1.4 仪器耗材 |
| 1.5 实验试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 旋毛虫肌幼虫的收集 |
| 2.2 人工消化液的配置 |
| 2.3 排泄分泌ES抗原的制备 |
| 2.4 Bradford法测蛋白含量 |
| 2.5 ELISA操作方法 |
| 2.6 小鼠血清旋毛虫ELISA法实验条件优化 |
| 2.7 人血清旋毛虫ELISA法实验条件优化 |
| 2.8 献血人群中旋毛虫感染率的流行病学调查 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 旋毛虫肌幼虫显微镜观察结果 |
| 3.2 小鼠血清旋毛虫IgG抗体ELISA方法的建立 |
| 3.3 小鼠血清旋毛虫IgM抗体ELISA方法的建立 |
| 3.4 人血清旋毛虫IgG抗体ELISA方法的建立 |
| 3.5 献血人群中旋毛虫感染情况分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 全球旋毛虫病流行现状及检测方法研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、硕士期间发表的学术论文 |
| 主要学习经历 |
| 主要经历 |
| 致谢 |
（6）RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表(Abbreviations) |
| 1 前言 |
| 1.1 旋毛虫与旋毛虫病 |
| 1.2 RNA干扰技术 |
| 1.3 TsSP1.2的研究 |
| 1.4 TsSPI基因 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验动物、旋毛虫虫种及所用细胞 |
| 2.4 主要试剂的配制 |
| 3 方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 菌种的活化,蛋白的诱导表达 |
| 3.3 蛋白的纯化 |
| 3.4 纯化蛋白的浓度测定 |
| 3.5 ELASA法检测蛋白抗血清的效价 |
| 3.6 siRNA的设计和合成 |
| 3.7 虫体可溶的提取 |
| 3.8 Weastern blot |
| 3.9 提取旋毛虫肌幼虫RNA |
| 3.10 RNA反转录样本cDNA |
| 3.11 RT-PCR验证c DNA质量 |
| 3.12 Real-time PCR |
| 3.13 RNAi的基因特异性 |
| 3.14 RNAi后旋毛虫肌幼虫在体外的存活率 |
| 3.15 RNAi后对侵入IECs的影响 |
| 3.16 RNAi对于旋毛虫肌幼虫侵入肠粘膜及其发育影响 |
| 3.17 数据处理 |
| 4 结果 |
| 4.1 应用RNAi对TsSP1.2蛋白的研究 |
| 4.1.1 siRNA的设计合成 |
| 4.1.2 siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.1.3 qPCR验证si RNA对TsSP1.2基因转录水平的影响 |
| 4.1.4 Western blotting蛋白水平检测RNAi对TsSP1.2表达量变化 |
| 4.1.5 TsSP1.2基因沉默后肌幼虫体外存活及侵入IECs情况 |
| 4.1.6 TsSP1.2基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响 |
| 4.1.7 siRNA-534处理后对各虫期虫体形态大小的影响 |
| 4.1.8 RNAi的基因特异性 |
| 4.2 应用RNAi对TsSPI蛋白的研究 |
| 4.2.1 siRNA的设计合成 |
| 4.2.2 siRNA转染到旋毛虫肌幼虫体内 |
| 4.2.3 qPCR验证RNAi对TsSPI转录水平的影响 |
| 4.2.4 Western blotting验证si RNA对TsSPI蛋白水平的表达量变化 |
| 4.2.5 TsSPI基因沉默后肌幼虫体外存活及侵入IECs |
| 4.2.6 TsSPI基因沉默后对肌幼虫侵入肠粘膜、发育及雌虫生殖力的影响 |
| 4.2.7 siRNA-653处理后对各虫期虫体形态大小的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）抗旋毛虫天然植物提取物筛选和作用机理初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蠕虫病防治药物的研究进展 |
| 1.1 蛔虫病的防治药物研究进展 |
| 1.2 旋毛虫病的防治药物研究进展 |
| 1.3 血吸虫病的防治药物研究进展 |
| 1.4 绦虫病的防治药物研究进展 |
| 第二章 血根碱药理及毒理研究进展 |
| 2.1 血根碱的药理研究进展 |
| 2.2 血根碱的毒理作用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 对旋毛虫具有杀伤作用的天然植物提取物体外筛选 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 血根碱对旋毛虫各发育期虫体的杀虫效果及机理研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 旋毛虫及旋毛虫病概述 |
| 1.2 旋毛虫的功能蛋白 |
| 1.2.1 排泄分泌产物 |
| 1.2.2 尚未揭示功能的蛋白 |
| 1.2.3 具有确定功能的旋毛虫的蛋白 |
| 1.3 寄生性蠕虫药物靶标研究进展 |
| 1.3.1 抗蠕虫药物研发的三个阶段 |
| 1.3.2 基于机理的新型抗寄生虫药物研发流程 |
| 1.3.3 已经获得成功的基于蛋白靶标筛选的抗寄生虫药物的例子 |
| 1.3.4 体外培养系统和药物筛选 |
| 1.3.5 高通量抗蠕虫药物筛选前景和挑战 |
| 第二章 旋毛虫正选择基因、旋毛虫与相关物种半胱氨酸蛋白酶差异基因及组织蛋白酶F进化研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 旋毛虫正选择基因研究材料与方法 |
| 2.1.2 旋毛虫与人类宿主及蠕虫半胱氨酸蛋白酶差异基因研究 |
| 2.1.3 组织蛋白酶F中的结构组成材料与方法 |
| 2.1.4 蠕虫组织蛋白酶F系统进化分析材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 旋毛虫正选择基因研究结果 |
| 2.2.2 旋毛虫与人类宿主及蠕虫半胱氨酸蛋白酶家族差异基因研究 |
| 2.2.3 组织蛋白酶F中的结构组成结果 |
| 2.2.4 蠕虫组织蛋白酶F系统进化分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 旋毛虫组织蛋白酶F家族蛋白特征研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 虫种和抗原 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 载体与菌株 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要软件和仪器 |
| 3.1.6 实验中所使用的引物 |
| 3.1.7 TsCF1、TsCF2和TsCF3表达载体构建 |
| 3.1.8 重组蛋白的原核表达以及纯化 |
| 3.1.9 TsCF1、TsCF2和TsCF3的分子对接研究 |
| 3.1.10 兔抗TsCF1、TsCF2和TsCF3重组蛋白高免血清制备和WesternBlotting反应 |
| 3.1.11 免疫定位 |
| 3.1.12 酶活性实验和抑制实验 |
| 3.1.13 抗体阻断实验 |
| 3.1.14 重组蛋白免疫保护性实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 旋毛虫TsCF1、TsCF2和TsCF3基因片段扩增 |
| 3.2.2 pET30a-TsCF1、pET30a-TsCF2和pET-30a-TsCF3重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 原核表达产物纯化 |
| 3.2.4 TsCF1、TsCF2和TsCF3蛋白分子建模 |
| 3.2.5 免疫印迹实验 |
| 3.2.6 免疫定位实验 |
| 3.2.7 酶活性实验和抑制实验 |
| 3.2.8 抗体阻断实验结果 |
| 3.2.9 免疫保护实验 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作及旋毛虫组织蛋白酶F的虚拟筛选 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作 |
| 4.1.2 旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢产物之间虚拟筛选 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 旋毛虫组织蛋白酶F家族与cystatin家族互作 |
| 4.2.2 旋毛虫组织蛋白酶F家族与FDA药物库和天然代谢物库分子对接和虚拟筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 组织蛋白酶F实际药物筛选 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验仪器和样品 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.1.3 芯片准备及SPR实时动力学分析 |
| 5.2 实验数据与结果 |
| 5.2.1 阴阳性对照信号图 |
| 5.2.2 FDA小分子样品与组织蛋白酶F样品的相互作用 |
| 5.2.3 FDA小分子样品与组织蛋白酶F1样品浓度梯度结合情况实例 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）免疫蛋白组学对旋毛虫诊断抗原的筛选与鉴定及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 应用免疫蛋白组学筛选旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白中的早期诊断抗原 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 旋毛虫保护性抗体靶向抗原ATPA的克隆、表达及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 rATPA应用于旋毛虫病血清学诊断的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 TSL-1抗原在旋毛虫侵入、排虫及免疫诊断方面的研究进展 |
| 1 TSL-1抗原 |
| 2 TSL-1抗原的免疫原性 |
| 3 TSL-1抗原介导的幼虫侵入 |
| 4 TSL-1抗原介导快速排虫 |
| 5 TSL-1抗原在免疫诊断方面的应用 |
| 6 结语 |
| 参考文献 |
| 个人简历、博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）犬旋毛虫病感染、检验及防治（论文提纲范文）
| 1 病原特点 |
| 2 流行病学 |
| 3 临床症状 |
| 4 感染情况 |
| 5 检验方法 |
| 6 处理方法 |
| 7 防治措施 |
四、犬旋毛虫肌幼虫的体外培养（论文参考文献）
- [1]旋毛虫雌虫生殖力的影响因素及新生幼虫免疫保护作用评价[D]. 杨莹. 东北农业大学, 2021
- [2]旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在旋毛虫入侵及免疫调节过程中功能的研究[D]. 伊娜娜. 东北农业大学, 2020
- [3]利用RNAi技术对旋毛虫丝氨酸蛋白酶和谷胱甘肽S转移酶基因功能的研究[D]. 杨达奇. 郑州大学, 2020(02)
- [4]应用dsRNA对旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能的初步研究[D]. 于鹏成. 东北农业大学, 2020
- [5]旋毛虫ELISA检测方法的建立及其血清流行病学的应用研究[D]. 刘佳璇. 郑州大学, 2020(02)
- [6]RNAi对旋毛虫丝氨酸蛋白酶1.2及丝氨酸蛋白酶抑制因子基因功能的研究[D]. 杨帆. 郑州大学, 2019(07)
- [7]抗旋毛虫天然植物提取物筛选和作用机理初步研究[D]. 刘可. 吉林农业大学, 2018(02)
- [8]旋毛虫组织蛋白酶F的功能鉴定及药物靶标筛选[D]. 曲自刚. 中国农业科学院, 2016(01)
- [9]免疫蛋白组学对旋毛虫诊断抗原的筛选与鉴定及初步应用[D]. 王莉. 郑州大学, 2014(06)
- [10]犬旋毛虫病感染、检验及防治[J]. 丁文卫. 养殖与饲料, 2011(01)